Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Литературный обзор 11
1.1. Общая характеристика гидрогелей 11
1.2. Гидрогели на основе гиалуроновой кислоты и хитозана 16
1.2.1. Физически сшитые гидрогели 16
1.2.2. Химически сшитые гидрогели .19
1.2.3. Фотосшитые гидрогели 38
1.3. Модификация гиалуроновой кислоты 39
1.4. Модификация хитозана 50 Заключение по литературному обзору 61
ГЛАВА II. Экспериментальная часть .63
2.1. Характеристика исходных веществ и реагентов .63
2.2. Методики экспериментов 65
2.2.1. Приготовление полиэлектролитного комплекса на основе гиалуроновой кислоты и хитозана .65
2.2.2. Модификация гиалуроновой кислоты эпихлоргидрином...65
2.2.3. Периодатное окисление гиалуроновой кислоты 66
2.2.4. Модификация хитозана янтарным ангидридом .66
2.2.5. Приготовление гидрогелей на основе производных гиалуроновой кислоты и хитозана .66
2.2.6. Приготовление пленок на основе поливинилового спирта.67
2.3. Методы анализа 67
2.3.1. Определение степени деацетилирования хитозана .67
2.3.2. Определение характеристической вязкости растворов полимеров 69
2.3.3. Определение молекулярной массы полимеров методом седиментационного равновесия .71
2.3.4. Определение парциального объема .72
2.3.5. Определение молекулярной массы полимеров методом сочетания скоростной седиментации и характеристической вязкости 72
2.3.6. Спектральные исследования образцов 73
2.3.7. Нингидринный анализ для определения степени модификации хитозана .74
2.3.8. Исследование комплексообразования в системе полимер – лекарственное вещество – физиологический раствор .76
2.3.9. Исследование реологических свойств гидрогелей 78
2.3.10. Определение степени набухания полимерных гидрогелей 79
2.3.11. Исследование диффузии лекарственного соединения из полимерной матрицы 80
2.3.12. Статистическая обработка результатов 81
ГЛАВА III. Результаты и их обсуждение .84
3.1. Исследование взаимодействий между гиалуроновой кислото й и хитозаном в растворе .84
3.2. Модификация гиалуроновой кислоты эпихлоргидрином 94
3.3. Модификация гиалуроновой кислоты периодатом натрия 99
3.4. Модификация хитозана янтарным ангидридом 104
3.5. Получение гидрогелей на основе диальдегида гиалуроновой кислоты и сукцината хитозана .113
3.6. Свойства гидрогелей на основе диальдегида гиалуроновой кислоты и сукцината хитозана 117
3.6.1. Реологические свойства гидрогелей 117
3.6.2. Транспортные свойства гидрогелей 122
3.7. Практическое применение лекарственных форм
пролонгированного действия .125 3.7.1. Диффузия митомицина С из гидрогелей на основе диальдегида гиалуроновой кислоты и сукцината хитозана в
физиологический раствор .126
3.7.2. Испытания гидрогелей на основе диальдегида гиалуроновой кислоты и сукцината хитозана в качестве дренажа при антиглаукоматозных операциях в эксперименте на кроликах 132
3.7.3. Диффузия цитостатиков из пленок на основе поливинилового спирта в физиологический раствор 135
3.7.4. Испытания пленок на основе поливинилового спирта и митомицина С в качестве дренажа при антиглаукоматозных операциях .139
Выводы .141
Список использованной литературы
- Гидрогели на основе гиалуроновой кислоты и хитозана
- Приготовление полиэлектролитного комплекса на основе гиалуроновой кислоты и хитозана
- Определение молекулярной массы полимеров методом седиментационного равновесия
- Получение гидрогелей на основе диальдегида гиалуроновой кислоты и сукцината хитозана
Введение к работе
Актуальность работы. В настоящее время полимерные гидрогели, благодаря ряду уникальных механических и физико-химических свойств, применяются в фармацевтике, медицине и других отраслях. Так, использование гидрогелей в качестве лекарственной формы обеспечивает пролонгирование действия лекарственного соединения, адресную доставку к системам и органам, а в некоторых случаях и заметный синергетический эффект действия препарата и фармакопейной основы.
В литературе описаны примеры создания гидрогелей с различными свойствами в
соответствии с предъявляемыми требованиями. В большинстве случаев проводится
предварительная модификация полимеров введением функциональных групп, способных
участвовать в реакциях сшивания, либо для закрепления лекарственного соединения на
полимерной матрице. При этом используются достаточно токсичные кросс-линкеры, что в
большинстве случаев недопустимо для гидрогелей медицинского назначения. Кроме того,
введение сшивающего агента в систему полимер – лекарственное вещество в результате
химической модификации лекарственного соединения может привести к изменению его
биологической активности. Поэтому методы получения гидрогелей без использования
кросс-линкеров, за счет образования поперечных связей между комплементарными
функциональными группами полимеров вполне актуальны. Перспективным направлением
в этом смысле представляется получение гидрогелей при совместном использовании
природных полиэлектролитов, таких как гиалуроновая кислота и хитозан, которые
обладают высокой биосовместимостью, биологической активностью и клеточной
адгезией. Таким образом, исследования закономерностей взаимодействия между
гиалуроновой кислотой и хитозаном, приводящего к образованию гидрогелей, и
исследование их свойств являются актуальными и имеют практическое значение.
Работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ ИОХ УНЦ РАН (с 12.01.2015 УфИХ РАН) по темам: «Высокоэффективные каталитические и инициирующие системы на основе металлокомплексных соединений для модификации синтетических и биогенных полимеров» на 2011 – 2013 г.г. (№ ГР 0120.1152188) и «Создание комплексных и супрамолекулярных структур на основе синтетических и биогенных полимеров и лекарственных веществ с управляемыми параметрами поведения в физиологически активных средах» на 2014 – 2016 г.г. (№ 01201458018), а также при поддержке Федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» исследовательских проектов (госконтракт №02.740.11.0648 на 2010 – 2012 г.г. и соглашение 8444 от 31.08.12 г. по заявке 2012-1.1-12-000-1015-027 на 2012 – 2013 г.г.).
Цель работы. Выявление закономерностей образования гидрогелей на основе гиалуроновой кислоты и хитозана, их комплексов с некоторыми цитостатиками и исследование транспортных и реологических свойств полученных гидрогелей.
В соответствии с поставленной целью решались следующие задачи:
исследование возможности получения гидрогелей за счет электростатического взаимодействия между гиалуроновой кислотой и хитозаном в растворе с образованием полиэлектролитного комплекса; выявление влияния на процесс гелеобразования изменения содержания ионогенных групп в полиэлектролитах при их взаимодействии с цитостатиками или химической модификации полимеров;
проведение модификации гиалуроновой кислоты и хитозана с целью снижения содержания ионогенных групп и введения новых функциональных групп, способных к ковалентному связыванию с функциональными группами другого полиэлектролита с образованием сшитого гидрогеля;
исследование взаимодействия гиалуроновой кислоты, хитозана, сукцината хитозана с цитостатиками (митомицином С, 5-фторурацилом);
оценка реологических и транспортных свойств полученных гидрогелей; исследование влияния концентрации полиэлектролитов в растворе и их молекулярной массы на процесс формирования гидрогеля и проявляемые гидрогелем свойства;
исследование возможности использования полученных гидрогелей в качестве дренажа для проведения антиглаукоматозных операций.
Научная новизна. В ходе диссертационного исследования:
– впервые показано образование гидрогеля на основе диальдегида гиалуроновой
кислоты и сукцината хитозана за счет формирования интерполимерного
полиэлектролитного комплекса и их последующего ковалентного сшивания; установлена зависимость реологических и транспортных свойств полученных гидрогелей от условий их формирования, ММ и концентрации растворов сукцината хитозана; выявлена возможность регулирования высвобождения лекарственных веществ из гидрогелей путем их направленной химической и структурной модификации, приводящей к изменению частоты сшивок;
– обнаружено, что при взаимодействии гиалуроновой кислоты и хитозана в нейтральной среде формируется полиэлектролитный комплекс в виде осадка, либо золя; изменение условий: соотношение компонентов, предварительное формирование комплекса между гиалуроновой кислотой, либо хитозаном и цитостатиками (митомицином С, 5-фторурацилом) не приводит к образованию гидрогеля; показано формирование комплексов между гиалуроновой кислотой, диальдегидом гиалуроновой кислоты,
хитозаном, сукцинатом хитозана и цитостатиками (митомицином С или 5-фторурацилом); определены состав и константа устойчивости полученных комплексов;
– показано, что модификация гиалуроновой кислоты (ГК) эпихлоргидрином (ЭХГ), протекающая по первичной гидроксильной группе с образованием простого эфира, приводит к получению водорастворимого образца при мольном соотношении ЭХГ: ГК = 2.5. Взаимодействие модифицированной эпихлоргидрином гиалуроновой кислоты и митомицина С при повышении температуры до 45 С протекает с раскрытием азиридинового цикла в молекуле митомицина С.
Практическая значимость. На основе гидрогелевой системы диальдегид гиалуроновой кислоты – сукцинат хитозана разработан дренаж, содержащий цитостатик (митомицин С, 5-фторурацил). Оптимизированы условия формирования гидрогелевой лекарственной системы. Разработанный дренаж испытан в эксперименте на кроликах1. Показано, что в отличие от инстилляций раствором митомицином С, использование гидрогеля не оказывает выраженного воспалительного эффекта на оболочки глаза за счет снижения токсичности цитостатиков в результате пролонгирования их действия.
На основе поливинилового спирта получены лечебные пленки, содержащие цитостатики (митомицин С, 5-фторурацил). Клинические исследования показали, что использование пленки поливиниловый спирт – митомицин С дает возможность достичь длительной стабилизации внутриглазного давления. Небольшая дозировка препарата 0.015-0.1 мг, действующая в течение 1-2 месяцев, позволяет минимизировать его токсическое действие и в то же время достичь длительного гипотензивного эффекта за счет профилактики рубцовых сращиваний.
Апробация работы. Основные результаты работы доложены на конференциях
различного уровня: Международной научно-практической конференции по
офтальмохирургии «Восток – запад» (Уфа, 2010 г.), Х Международной научной конференции "Ломоносов" (Москва, 2013 г.), ХІІІ Украинской конференции по высокомолекулярным соединениям (Киев, 2013 г.), XXVIII Международной конференции "Химические реактивы, реагенты и процессы малотоннажной химии" (Уфа, 2014 г.), VII Международной школе-конференции "Фундаментальная математика и ее приложения в естествознании" (Уфа, 2014 г.), Международном научном симпозиуме “Инновационные подходы к развитию: полученный опыт и взгляды в будущее” (Одесса, 2015 г.), Всероссийской научной конференции «Инновационный потенциал молодежной науки»
1 Испытания полученных дренажей проводились в ГБУ Уфимском научно-исследовательском институте глазных болезней АН РБ
(Уфа, 2013 г.), VI Всероссийской Каргинской конференции "Полимеры – 2014" (Москва, 2014 г.), IX и X Всероссийских конференциях "Химия и медицина" (Уфа – Абзаково, 2013 г., 2015 г.), I, II и III Всероссийской научной конференции "Теоретические и экспериментальные исследования процессов синтеза, модификаций и переработки полимеров" (Уфа, 2013, 2014, 2015 г.г.), Всероссийской молодежной конференции «Достижения молодых ученых: химические науки» (Уфа, 2015 г.), XI Республиканской конференции молодых ученых "Научное и экологическое обеспечение современных технологий" (Уфа, 2014 г.).
Публикации. Материалы диссертации изложены в 26 печатных работах, из них 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК, 10 статей в монографии и сборниках научных трудов, тезисы 13 докладов на конференциях.
Структура и объем диссертации
Диссертационная работа изложена на 169 страницах и состоит из введения, литературного обзора, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов, списка цитируемой литературы, включающего 184 работы, и приложения. Диссертация содержит 17 таблиц, 73 рисунка и 41 схему.
Автор выражает глубокую благодарность доктору химических наук, профессору С.В. Колесову и доктору химических наук, профессору О.С. Куковинец за научные консультации, оказанные в процессе выполнения данной работы.
Гидрогели на основе гиалуроновой кислоты и хитозана
Гидрогели представляют собой дисперсные бинарные системы, состоящие из трехмерной сетки, образованной сшитыми гидрофильными полимерами, в которой распределено значительное количество молекул воды в качестве дисперсионной среды [1]. Большое водопоглощение позволяет гидрогелям быть материалом исключительно чувствительным по отношению к изменению внешних условий. В то же время частицы дисперсной фазы, соединенные между собой в пространственную сетку, лишают систему текучести. Поэтому гидрогели проявляют механические свойства, в большей или меньшей степени подобные свойствам твердых тел [2-4].
Благодаря своей биосовместимости, эластичности, разнообразию состава и физических характеристик, гидрогели сами по себе или в комбинации с клетками или лекарствами нашли применение во многих областях медицины. Биодеградируемые гидрогели могут использоваться как системы доставки лекарственных препаратов или носителей клеток, а также материала для тканевой инженерии. Гидрогели могут быть получены в относительно мягких условиях и быть доставлены в минимально инвазивной форме. Гидрогели по своей микроструктре имеют сходство с межклеточным матриксом (МКМ) многих тканей. Высокогидратированные гидрогели способны имитировать физические и химические свойства МКМ и, таким образом, являются идеальной клеточной микросредой для пролиферации и дифференциации клеток [4-11].
Как основа для создания 3D микроструктуры внутри человеческого организма, инъецируемые гидрогели должны удовлетворять нескольким требованиям: 1) они должны состоять из биосовместимых материалов и разрушаться на биосовместимые продукты; 2) вязкость растворов полимеров до момента гелеобразования должна быть достаточно низкой; 3) для избежания токсичности, перегрева в результате протекания побочных реакций, и быстрого проникновения в окружающие ткани, а также для эффективной инкап-11 суляции клеток или лекарств необходимы мягкие условия гелеобразования и подходящие скорости гелеобразования после in vitro или in vivo инъекции; 4) гидрогели должны иметь достаточную стабильность, вязкость, адгезию, разрывную прочность для удерживания клеток или лекарств и предотвращения больших выплесков лекарств, т.е. пролонгирования их высвобождения; 5) должны иметь подходящие количество и размер пор для обеспечения клеточной активности, свободного обмена кислородом и питательными веществами; 6) должны быть биодеградируемыми для создания среды роста клеток, их перегруппировки и образования новых тканей [4].
Свойства гидрогелей главным образом зависят от прочности связей и степени сшивки. Химический состав и ММ отрезка макромолекулы между двумя узлами определяют плотность поперечных сшивок, которая в свою очередь влияет на фундаментальные свойства гидрогелей, такие как, степень набухания, механическая прочность и эластичность, проницаемость (величина ячеек сетки), диффузионные характеристики [1, 2, 12].
Степень набухания полимерных гидрогелей зависит от природы макромолекул, их сродства к воде, содержания ионогенных групп, степени сшивания и внешних условий (температуры, рН, ионной силы раствора) и обратно пропорциональна плотности сшивок [1, 2, 12].
Химическая структура определяет набухание гидрогелей. Так, гидрогели, содержащие гидрофильные группы, набухают больше по сравнению с гидрогелями, содержащими гидрофобные группы [13]. Наибольшей степенью набухания в воде обладают гидрогели полиэлектролитов. Способность полиэлектролитных гелей поглощать и удерживать высокие объемы воды определяется взаимными отталкиваниями включенных в сетку геля одноименно заряженных полимерных цепей и осмотическим давлением, обусловленным наличием подвижных противоионов. В результате проникновения воды в структуру геля и разворачивания полимерных цепей полиэлектролита гидрогель оказывается способным значительно увеличиваться в объеме и удерживать растворитель, в количестве в сотни раз превышающем собственный объем [12].
При набухании сравнительно редко сшитого каркаса неизменной остается его топология – число узлов сшивок не изменяется, однако расстояние между ними может значительно увеличиваться за счет набухания каждой отдельно взятой цепи, заключенной между узлами сшивки. Очевидно, что эффект поглощения экстремальных количеств воды может быть присущ только полимерным соединениям, клубки макромолекул которых могут значительно изменять свой размер [1, 2].
Набухшие гидрогели при приложении напряжения проявляют эластичные свойства: растяжение или сжатие. Высокая плотность поперечных сшивок приводит к более высокой механической прочности, но в то же время и к понижению эластичности и набухания. Значительное повышение количества поперечных сшивок в некоторых гидрогелях вызывает образование хрупких гелей. Вследствие этого, оптимальная плотность поперечных сшивок обеспечивает баланс между эластичностью и желаемой прочностью [13].
Пористость гидрогелей или размер ячеек – структурное свойство гидрогелей, определяющееся расстоянием между соседними поперечными сшивками. Пористость является следствием плотности поперечных сшивок, состава и концентрации мономеров [14]. Установлено, что в стабильной сетке размер ячеек растет с увеличением степени набухания [15, 16].
Диффузия питательных веществ, метаболитов и других растворенных веществ из гидрогелей зависит от множества факторов: морфологии сетки, состава полимеров, содержания воды, концентраций растворенных веществ и полимеров, набухания и деградации гелей [14]. Данные основополагающие факторы могут комбинироваться, вызывая химическое или физическое влияние, замедляющее диффузию растворенного вещества. Химическое влияние связано с образованием связей между растворенными веществами и матрик-сом гидрогеля, в то время как вытеснение физического объема характеризует влияние трения на диффузию в гидрогеле [3, 15]. Механически, гидрогелям можно придать модуль накопления и потерь, схожий с мягкими тканями. Физически, гидрогели имеют большую площадь внутренней поверхности, что облегчает эффективный контроль диффузии в зависимости от ММ как из гидрогелевой фазы (для доставки лекарств), так и внутрь гидрогелевой фазы (для тканевой инженерии). Химически, можно разработать гидрогели, способные сохранять или удерживать различные заряды или домены, что позволит связать различные классы лекарств или биологических соединений в гидрогелевой фазе. Биологически, гидрогели обычно обладают низкой адсорбцией протеинов, благодаря высокому содержанию воды, и низким межфазным натяжением [11].
Основным условием, необходимым для получения гидрогелей является наличие в полимере функциональных групп, которые не только могут реагировать с бифункциональными реагентами, но и способны к ионизации [4, 9, 10, 17].
К методам образования гидрогелей относятся: термическое гелеобразо-вание, ионные взаимодействия, физическая самоорганизация, фотополимеризация и химическое сшивание различными агентами.
Согласно механизму гелеобразования гидрогели можно разделить на 2 класса: физические (образованные в результате электростатического взаимодействия или водородных связей) и химические (сформированные за счет ко-валентных связей). В физических гелях при нагревании происходит разрушение узлов сетки, сетка носит флуктуационный характер, затем гель переходит в состояние истинного раствора. Гели, образованные ковалентными связями, не способны к течению, так как макромолекулы, будучи сшиты, не могут перемещаться относительно друг друга. Ковалентно сшитые гели значительно более устойчивы к нагреванию, но при высоких температурах происходит полное необратимое разрушение химической структуры геля [1, 2].
Приготовление полиэлектролитного комплекса на основе гиалуроновой кислоты и хитозана
N-карбоксиэтилхитозан (N-КЭХ) имеет различные свойтва: растворимость в воде в широком диапазоне рН, актиоксидантные свойства, антимутагенную активность, высокую селективность сорбции по отношению к ионам переходных металлов, улучшенную биодеградацию по сравнению с натив-ным хитозаном. Данный полимер получают при взаимодействии хитозана с 3-галопропионовыми кислотами при рН = 8 – 9 в присутствии NaHCO3 (схема 1.30) [17, 150]. Схема 1.30. Получение N-карбоксиэтилхитозана
В промышленности водорастворимый хитозан получают путем введения сукцинатных групп в N-концы глюкозаминных звеньев хитозана. Данное производное растворяется в воде, обладает низкой токсичностью и биоразла-гается в организме. Сукцинат хитозана обладает большим количеством функциональных групп: аминогруппы, карбоксильные, первичные и вторичные гидроксильные, что делает возможным применение данного полимера для хелатирования различных ионов металлов. Сукцинат хитозана получают при взаимодействии хитозана с янтарным ангидридом (схема 1.31) [17, 151].
Синтез водорастворимого О-сукцината хитозана (О-СХ) заключается в следующем: так как аминогруппы являются более сильными нуклеофилами, чем гидроксильные, фталоильные группы были выбраны для защиты аминогрупп хитозана, затем их убирали обработкой гидразингидратом. Благодаря введенным сукцинатным группам вместо гидроксильных, растворимость в воде поддерживается, в то время как свободные аминогруппы могут подвергаться дальнейшей модификации (схема 1.32) [17, 152]. Схема 1.32. Получение О-сукцината хитозана (DMF – диметилформамид)
Синтезированные карбоксиметильные производные хитозана способны адсорбировать ионы металлов. КМХ имеет большую степень адсорбции по отношению к ионам кальция. Магнитный наноадсорбент разработан путем ковалентного связывания О-КМХ на поверхности магнитных наночастиц Fe3O4. Исследованы адсорбционные свойства О-КМХ по отношению к ионам цинка, меди, кобальта, никеля, кадмия, ртути [17].
Синтезированы амидоксимы хитозана различной ММ полимеранало-гичными превращениями полиглюкозамина в реакции с акрилонитрилом и последующим взаимодействием продукта с гидроксиламином (схема 1.33). Проведено цианэтилирование хитозанов в реакции с акрилонитрилом и ок-симирование цианэтилхитозанов [153]. Выявлена высокая бактерицидность амидоксима хитозана по отношению к ряду бактерий [153]. В этой же работе показано влияние ММ хитозана на степень замещения его функциональных групп в реакциях нуклеофильного присоединения. Описаны способы получения и свойства водорастворимых композиций на основе хитозана, модифицированного метакрилатами и изучена их флоку-57 лирующая способность. Привитые сополимеры хитозана с мономерами акрилового ряда получали с использованием комплексов Со (III), блок-сополимеры – механохимически, обработкой ультразвуком водно-мономерных растворов хитозана [154]. Схема 1.33. Получение амидоксимов хитозана с помощью реакций а) цианэ-тилирования, б) оксимирования
Получению хитозана из хитина и получению ряда производных хито-зана в твердой фазе в условиях совместного воздействия высокого давления и сдвиговых деформаций посвящен ряд работ [155-157]. Авторами предлагается способ получения карбоксиметилового эфира хитозана из хитина в присутствии твердой щелочи, совмещающий дезацетилирование хитина с образованием хитозана и его последующее карбоксиметилирование. Полученые продукты, различались степенью замещения по карбоксиметильным группам.
Синтезированы блок- и привитые сополимеры хитозана с метилакрила-том с различной молекулярной массой фрагментов цепей природного и синтетического полимеров. Привитые сополимеры хитозана и метилакрилата получали в водно-уксуснокислых растворах полисахарида с использованием в качестве инициатора 2,2 -азо-бис-изобутиронитрила (ДАК) при 333 – 353 К. Модификация хитозана метилакрилатом позволяет получить пленочные материалы с высокими физико-механическими свойствами с регулируемым временем биоразложения [158]. Термическое поведение (термодинамические и теплофизические свойства) блок-сополимера хитозана с метилакрилатом (мольное соотношение 1:2.4) исследовано в работе [159].
Возможность применения модифицированных производных хитозана для доставки лекарств показана в работе [150]. Так, КМХ был связан с ме-тамфетамином с помощью бионеразлагаемого спейсера 1-аминобутана. Спейсер на основе пептида фенилаланина, связанного с лекарством, стабилизирован по отношению к энзимному гидролизу [17].
Биоразлагаемые композиционные пленки на основе хитозана и поли-3-гидроксибутирата предложены для адресной и пролонгированной доставки инкапсулированных лекарственных веществ, в частности, антибиотика - ри-фампицина [160-164]. Варьирование соотношения полимеров влияет на механизм транспорта лекарственного вещества и кинетический профиль его десорбции. В работах показано изменение морфологии полимера под действием разрыхляющего эффекта лекарственного вещества.
Получены нерастворимые в воде конъюгаты митомицина С и хитозана при использовании КДИ [17, 164, 165]. Митомицин С (MMC), N-сукцинат хитозана и водорастворимый 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид (КДИ) растворяли в воде в течение 45 мин и доводили значение pH до 5.0. Полученный конъюгат содержал 12% MMC.
Разработаны микрочастицы сшитых конъюгатов N-сукцината хитозана с MMC с оптимальным размером для доставки в печень (0.2 – 3 м) [166]. Показано моноэкспоненциальное высвобождение MMC из коньюгатов при pH 7.4. Водорастворимые конъюгаты на основе сукцината хитозана и глутаро-вого производного ММС получены в N,N -диметилформамиде при 4 С. Содержание ММС в конъюгате составило 1.3% (схема 1.34) [167].
По другой методике (схема 1.35) на первой стадии гидроксиэтил-хитозан модифицировали янтарным ангидридом для введения сукцинатных групп.
Схема 1.35. Модификация хитозана янтарным ангидридом с последующей прививкой митомицина С с помощью КДИ Полученный продукт подвергали взаимодействию с ММС в присутствии гидрохлорида 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида в течение 1 ч. Затем в качестве сшивающего агента добавляли диглицедиловый эфир бутандиола, в результате чего были получены пористые мембраны. Содержание ММС составило 12%. Показано полное выделение ММС из полученных мембран примерно в течение 15 суток.
Из анализа литературных данных следует, что проблема разработки методов получения гидрогелей на основе биополимеров, в том числе гиалу-роновой кислоты и хитозана, остается актуальной и на сегоднящний день. Известно, что при определенных условиях как гиалуроновая кислота, так и хитозан образуют гидрогели за счет межмолекулярных взаимодействий (водородных связей). Однако такие гидрогели являются как механически, так и термически неустойчивыми. Кроме того, нативная гиалуроновая кислота под действием ферментов и свободных радикалов подвергается быстрой деградации. Поэтому для получения гидрогелей эти полимеры в большинстве случаев предварительно модифицируют, а затем сшивают макромолекулы с помощью кросс-линкеров. В ряде случаев примение сшивающих агентов недопустимо, поэтому возникает необходимость получения гидрогелей другими способами.
Одним из таких способов представляется получение сетчатой структуры путем сшивки комплиментарных функциональных групп макромолекул двух биологически активных полимеров, таких как гиалуроновая кислота и хитозан, без использования кросс-линкеров. Простота технологии получения таких гидрогелей и отсутствие токсичных компонентов в полимерной матрице являются важными факторами в случае их медицинского использования.
Определение молекулярной массы полимеров методом седиментационного равновесия
Нагрев смеси до 45С не влияет на значение константы устойчивости комплекса. Митомицин С образует комплексы с гиалуроновой кислотой в физиологическом растворе более устойчивые, чем с хитозаном (105 и 5х104 л/моль соответственно). Вероятно, комплексообразование связано с формированием водородных связей между аминогруппами ММС и более нуклеофильными карбоксильными группами ГК или менее нуклеофильными карбонильными группами хитозана.
По сравнению с 5-фторурацилом, митомицин С образует более устойчивые комплексы с полисахаридами, по-вилимому, из-за большей основности азота в аминогруппах митомицина, по сравнению с амидными группами 5-фторурацила, которые находятся в кольце.
Образование комплекса ММС – полимер обуславливает возможность закрепления ММС на полимерной матрице и его пролонгированного высвобождения.
Несмотря на то, что часть ионогенных групп полиэлектролитов была связана с цитостатиками, что должно было привести к ослаблению электростатических взаимодействий между полисахаридами, значительных изменений в формировании ПЭК между ГК и ХТЗ не наблюдалось, также выпадал осадок. То есть частичное блокирование ионогенных групп как поликатиона, так и полианиона, за счет образования комплекса с цитостатиком является недостаточным для формирования гидрогеля. В связи с этим для получения гидрогелей был использован способ ковалентного связывания полимерных цепей ГК и ХТЗ, для чего необходимо было ввести в их макромолекулы соответствующие функциональные группы, т.е. модифицировать гиалуроновую кислоту и хитозан.
Как было описано в главе 1, разработано достаточно большое количество методик модификации ГК, которые затрагивают ее карбоксильные или гидроксильные функциональные группы. Однако карбоксильные группы ГК являются сайтами распознавания для рецепторов ГК и гиалуронидазы, и химическая модификация по данным группам меняет биологическое поведение ГК в организме [8, 181], что является нежелательным фактором при разработке материала для медицинского применения. Поэтому модификацию макромолекул ГК проводили по ее гидроксильным группам. Наиболее простым методом в этом отношении является взаимодействие ГК с эпоксидными соединениями в щелочной среде.
Так, в качестве модифицирующего агента использовали эпихлоргидрин (ЭХГ). В работах [35, 116, 182, 183] указывается, что в зависимости от условий реакции взаимодействие ЭХГ с ГК может протекать как по первичной гидроксильной группе, так и по аминогруппе, образующейся при деацетили-ровании ГК.
Реакцию модификации ГК эпихлоргидриномом проводили в аммиачно-щелочном растворе, изменяя относительные количества ЭХГ (табл. 3.2). Обнаружено, что при использовании большого избытка ЭХГ (5-10 моль/ на моль дисахаридных звеньев ГК) реакция протекает с образованием сшитых макромолекул ГК, которые выпадают в нерастворимый осадок.
При уменьшении количества ЭХГ до 2.5 моль продукт реакции растворялся в воде, в отличие от работы [116], в которой растворимые образцы были получены только при соотношении ЭХГ: ГК = 10. Таблица 3.2. Характеристики полимеров после модификации ГК эпихлор-гидрином. Соотношение (моль/моль) NH4OH:ГК = NaOH:ГК = Соотношение ЭХГ:ГК, моль/моль Растворимость полимера в воде
Исследование растворимого образца модифицированной гиалуроновой кислоты эпихлоргидрином (МГК), методом спектроскопии ЯМР 13С (рис. 3.19) показало, что в спектре исчез сигнал в области 60.46 м.д., характерный для углерода первичной CH2OH группы, но появились два триплетных сигнала при 65.07 и 65.09 м.д., принадлежащие двум –СH2O– в модифицированном фрагменте и триплет при 48.0 для –СН2Сl. Сигнал при 25 м.д., принадлежащий атому углерода метильной группы ацетамидного остатка, сохраняется.
Можно предположить следующую структуру сшитого полимера, образующегося при большом избытке ЭХГ:
Формирование структуры сшитого полимера, образующегося при использовании большого избытка эпихлоргидрина В спектре ЯМР 1Н (рис. 3.20) наблюдается появление двух дублетов с центром при 3.65 и 3.68 м.д. от двух диастереотонных протонов CH2Cl группы с константами 7.0 и 8.0 Гц соответственно. Рис. 3.20. Фрагменты спектров ЯМР 1Н образцов ГК (а), МГК (б). Растворитель: D2O
Сравнением интегральных интенсивностей сигналов протонов метиль-ной группы ацетамидного фрагмента и сигналов, соответствующих протонам СН2Cl-группы, была рассчитана степень модификации МГК, которая составила 88%.
Как показали исследования (рис. 3.21), растворимый образец модифи-цирвоанной гиалуроновой кислоты эпихлоргидрином не образует комплекс с митомицином С при комнатной температуре, вероятно, из-за имеющего место внутримолекулярного формирования водородных связей между гидро-ксильной группой модифицированного фрагмента при С-6 и близко расположенной карбоксильной группой. Образование внутримолекулярной водородной связи подтверждается сдвигом полосы поглощения карбоксильной группы для МГК в слабопольную область на 2.5 м.д. (ЯМР 13С). Это взаимодействие блокирует образование межмолекулярного комплекса в силу стери-ческих и электронных факторов.
Получение гидрогелей на основе диальдегида гиалуроновой кислоты и сукцината хитозана
Формирование разлитой фильтрационной подушки происходит благодаря уменьшению процесса рубцевания в области фильтрации между конъюнктивой и поверхностным склеральным лоскутом, а также в интраскле-ральном пространстве за счет действия цитостатика.
Гидрогелевый дренаж не имеет запаха, не окрашен. Благодаря гигроскопичности материала дренаж набухает во влаге передней камеры глаза, увеличивается в объеме, не травмирует внутренней биологической поверхности, способствуя снятию воспаления и болевого синдрома. Дренаж прочно фиксируется краями операционной раны, что исключает необходимость дополнительной фиксации и исключает риск дислокации дренажа.
Таким образом, использование предложенного дренажа позволяет добиться устойчивой фильтрации внутриглазной жидкости, структура дренажа позволяет избежать таких ранних послеоперационных осложнений как быстрое опорожнение передней камеры, и как следствие, отслоек сосудистой оболочки и макулярных отеков. Использование гидрогеля обеспечивает пролонгирование действия цитостатика, что приводит к ненадобности инстилля-ций при лечении, уменьшению воспалительной реакции, развитию избыточных процессов пролиферации в зоне хирургического вмешательства. Все это улучшает фильтрацию внутриглазной жидкости и, таким образом, нормализует внутриглазное давление.
Небольшая дозировка, действующая в течение 1-2 месяцев, позволяет устранить токсическое действие препарата и в то же время достичь длительного гипотензивного эффекта за счет профилактики рубцовых сращений.
Известно, что помимо гелей пленки также могут являться лекарственной формой, позволяющей пролонгировать действие лекарственного препарата.
Одним из полимеров, позволяющим получать пленки и получившим большое распространение в качестве носителя лекарственных средств с пролонгированным действием является поливиниловый спирт (ПВС). ПВС участвует в создании лекарственных форм, в которых лекарственное вещество включено в полимерную матрицу (блоки, пленки, гели). У полимерных матриц пролонгированность действия лекарственного препарата обусловлена замедленной диффузией из матрицы, за счет чего и растет время действия лекарственного препарата. Важным свойством ПВС является незначительное взаимодействие со структурными элементами организма и, прежде всего, с клеточными мембранами и биополимерами.
В то же время наличие гидроксильных групп ПВС обусловливает возможность возникновения межмолекулярных водородных связей. За счет формирования водородных связей, а также гидрофобных и других некова-лентных взаимодействий, он образует комплексы с широким кругом веществ как с низко-, так и с высокомолекулярными. Кроме того, макромолекулы ПВС способны легко ассоциироваться с образованием сетки межмолекулярных водородных связей. Поэтому в качестве носителя с пролонгированным действием цитостатиков при антиглауматозных операциях были использованы пленки на основе ПВС.
На рисунке 3.56 приведены УФ-спектры поглощения 2% (0.45 моль/л) водного раствора ПВС (кривая 11), раствора ММС (кривая 10) и их смесей различного состава.
Как следует из данных рисунка 3.58, вид УФ-спекторов смеси водных растворов ММС и ПВС практически не меняется при экспозиции в течение 10 суток и более. Возможно, за счет возникновения водородных связей между молекулами ПВС и воды происходит уменьшение активности нуклеофила и раскрытие азиридинового цикла не имеет места. Это, безусловно, положительное явление при создании пролонгированных лекарственных форм.
Рис. 3.58. УФ-спектры поглощения водного раствора смеси ММС : ПВС = 7:3. Время выдержки, сутки: исходный (1), 5 (2), 8 (3), 10 (4). [ММС] = 4.3х10-5 моль/л, [ПВС] = 2% (0.45 моль/л). Температура 25 С
При погружении пленки ПВС в воду или физиологический раствор происходит ее набухание и выделение лекарственного препарата. Как следует из данных, представленных на рис. 3.59, все кинетические кривые выходят на явно выраженный предел, соответствующему равновесному выделению цитостатика. Однако 5-фторурацил выделяется полностью из пленки в течение получаса, авастин выделяется за 2 часа на 96%, диффузия митомицина за это же время происходит только на 60%.
Такой характер кинетических зависимостей свидетельствует о том, что часть молекул митомицина С связывается ПВС, вероятно за счет формирования водородных связей. В случае 5-фторурацила доля молекул, формирующих комплексную связь с макромолекулами ПВС меньше, ввиду меньшей активности аминогрупп в кольце 5-фторурацила, по сравнению с мито-мицином С. Авастин, по-видимому, выделяется быстро по причине своей большой молекулярной массы. Макромолекулы авастина не диффундируют в поры, образованные водородными связями ПВС, а адсорбируются на по верхности пленки.
Кинетика выделения 5-фторурацила (1), авастина (2), митомицина С (3) в физиологический раствор из пленок ПВС. Температура 25 С
Митомицин С выделяется медленно в течение двух месяцев (рис. 3.60). Поэтому дальнейшие исследования проводились с пленками, содержащими ММС.
Испытания пленок на основе поливинилового спирта и ми-томицина С в качестве дренажа при антиглаукоматозных операциях7
В УфНИИ ГБ проведено изучение в эксперименте на 8 кроликах (16 глаз) эффективности применения глазной пленки, в которой в качестве связующего использовали поливиниловый спирт, а лечебного вещества – митомицин С.
После экспериментального моделирования глаукомы (коалиновая модель), проводилась глубокая склерэктомия с введением разработанного дренажа.). Было подобрано оптимальное содержание митомицина С в одной пленке (одна доза), которое составляет 0.015-0.1 мг. При снижении количества лекарственного вещества менее 0.015 мг лечебный эффект проявляется недостаточно. Увеличение дозы более 0.2 мг нецелесообразно, так как проявляется эффект передозировки митомицина С. Наиболее удобны в обращении пленки площадью 2х4.0 мм и толщиной 80 мкм.
Морфологические исследования показали: по ходу сформированного канала с наружной стороны глазного яблока и со стороны сосудистой оболочки канал был покрыт относительно узкой соединительно-тканной капсулой, состоящей из слоя фибробластоподобных клеток. В основном это были клетки фибробластического ряда и пигментные клетки, вероятно, мигрировавшие из цилиарного тела. Признаков рубцевания окружающих тканей не определялось. Цилиарное тело, роговица, радужная оболочка глаза и конъюнктива имели структуру, характерную для нормы, воспалительные явления в данных оболочках не проявлялись. Все ткани глазного яблока вокруг канала в данной зоне имели нормальную интактную структуру.