Функционализация полимерных носителей для иммунохимического анализа Шманай, Вадим Владимирович

Введение к работе

Актуальность темы диссертации. Полимерный носитель - один из основных компонентов твердофазного иммунохимического анализа, определяющих его качественные характеристики: чувствительность, воспроизводимость результатов, вид калибровочной кривой, срок хранения иммуносорбен-та. Наиболее распространенные макроносители для иммуноанализа изготовлены из пемодифицнрованного полистирола и предназначены для физической сорбции иммунореагентов.

Инактивация сорбированных на полистироле антител и ограниченная способность белков и многих антигенов небелковой природы к гидрофобной сорбции ставят перед исследователями задачи по созданию новых носителей, сочетающих операционные достоинства формованных полистирольпых матриц (прозрачность, легкость дозирования, низкая стоимость) с функциональными качествами активированных микрочастиц и гелей, применяемых в аффинной хроматографии и энзимологии (высокая емкость и прочность связывания, минимальная инактивация белков, низкий уровень неспецифической сорбции). Один из путей решения этой проблемы - функционализация полистирола, позволяющая в широких пределах изменять свойства поверхности для ковалентной иммобилизации биологических макромолекул и создания для них оптимального микроокружения. Известно небольшое число таких матриц. Формилированные полистирольные макроносители ранее не были описаны.

Создание более качественных по сравнению с традиционными твердофазных матриц актуально для Беларуси, поскольку способствует обеспечению потребности Республики в современных иммунодиапюстических наборах реагентов и созданию конкурентоспособной продукции. Наличие в стране соответствующей научной базы (Институт биоорганической химии НАНБ, Биологический факультет БГУ) и технологических возможностей (Хозрасчетное эпытное производство ИБОХ НАНБ) позволяет успешно решать эти задачи.

Связь работы с крупными научными программами, темами. Диссертационная работа выполнена по плаїгу НИР ИФОХ НАНБ в рамках программы 'Полимер 01" по темам: "Исследование закономерностей процессов синтеза и физико-химических свойств новых функциональных и реакционноспособных полимеров, органических электролитов" (1991-1995, номер госрегистрации 1993585), "Разработка, исследование свойств и изыскание путей рационального применения новых функциональных и реакционноспособных полимеров и композиционных материалов для охраны окружающей среды, здоровья человека и технического использования" (1996-2000, номер госрегистрации 19962777), а также по гранту БРФФИ № Х98М-079 "Функционализация полисахаридами твердофазных полимерных носителей для иммунохимического анализа" (1999-2001, номер госрегистрации 19991821).

Цель и задачи исследования. Цель проведенного исследования получение новых функционализированных матриц для иммуноанализ; активацией отлитых под давлением шаров из линейного полистирола і модификацией бумаги полимерами, приготовление на их основі иммуносорбентов и разработка методик иммуноферментного анализа (ИФА) с их использованием. Поставлены следующие задачи:

1. Получить формилированные полистирольные шары (ФПСШ) и исследовать структуру их активного поверхностного слоя;

2. Разработать методы получения носителей, содержащих альдегидные, амин-ные, ацетильные, гидразидные, карбоксильные, гидроксильные, амидные. углеводные группы на спейсерах различной длины и структуры химической модификацией полистирольных матриц полифункциональными соединениями;

3. Разработать методы получения гетерофункциональных матриц;

4. Разработать методы получения бумажных матриц с повышенной влаго-прочностыо, способных к периодатному окислению, армированием или импрегнированием фильтровальной бумаги полимерами различной структуры;

5. Разработать методы количественного определения активных функциональных групп на синтезированных носителях;

6. Изучить закономерности ковалентной иммобилизации белков на функционализированных матрицах;

7. Исследовать неспецифическую сорбцию пероксидазных конъюгатов на ФПСШ и оптимизировать условия ее блокировки;

8. Установить зависимость активности иммуносорбентов на основе функционализированных носителей от условий их получения и хранения;

9. Получить гидразидсодержащие матрицы для направленной иммобилизации антител;

10. Получить иммуносорбенты и разработать методику конкурентного ИФА IgG человека с использованием ФПСШ и поликлональных антител к IgG;

11. Получить иммуносорбенты и разработать методику двухцентрового ИФА хорионического гонадотропина человека (ХГч) с применением ФПСШ и моноклональных антител к а- и р-субъединицам ХГч;

12. Получить иммуносорбенты и разработать методики ИФА прогестерона и
кортизола с использованием различных типов модифицированной полиме
рами бумаги и поликлональных антител к стероидным гормонам.

Объекты и предмет исследования. Объекты исследования - функцио-нализированные производные полистирола и целлюлозы. В качестве предмета исследования определено активирование полистирольных шаров диаметром 0,63 см и модифицирование фильтровальной бумаги для использования в ИФА.

Методология и методы проведенного исследования. В работе использованы физические, физико-химические, химические и биохимические методы: ЯМР- и ИК-спектроскопия; спектрофотометрия и фотоколориметрия; атомно-силовая микроскопия; элементный микроанализ; газовая и ионообменная хроматография; гель-фильтрация; рН-метрия; кислотно-основная и окислительно-восстановительная титрометрия; химическая модификация природных и синтетических полимеров; методы органического синтеза; радикальная полимеризация; определение концентрации белков; очистка и химическая модификация белков; иммунизация животных, получение и выделение специфических антител; простая и двойная иммунодиффузия; ферментативные реакции окисления ароматических аминов; прямой ИФА; конкурентный ИФЛ; "сэндвич"-ИФА. Разработаны методики количественного анализа карбонильных, аминных и гидразидных групп на модифицированных полистирольных матрицах.

Научная новизна и значимость полученных результатов. Получено 23 макроносителя для иммуноанализа химической модифицикацией полистирола полифункциональными соединениями с образованием на поверхности спейсеров различной длины и структуры, содержащих альдегидные, ацетильные, аминные, гидразидные, карбоксильные, гидроксильные, амидные и углеводные группы. Получен ряд новых бумажных носителей, отличающихся повышенной влагопрочпостыо и способных к периодатному окислению.

Разработаны методики анализа активных карбонильных, аминных и гидразидных групп на твердых носителях, отличающиеся простотой выполнения и универсальностью.

Установлены закономерности ковалентной иммобилизации различных белков па ФПСШ. Оптимизированы условия получения иммунных и аффинных сорбентов с использованием ФПСШ и модифицированной бумаги в качестве твердофазных носителей иммунореагентов.

Получены матрицы для иммуноанализа, позволяющие проводить пространственно направленную (ориентированную) ковалентную иммобилизацию (ПНИ) антител. Впервые получены макроносители для иммуноанализа с химически привитыми акриловыми сополимерами и функциональными производными полисахаридов.

Разработаны методики ИФА четырех антигенов с использованием ковалентно иммобилизованных поликлональных и моноклональных антител на носителях, содержащих активные альдегидные группы.

Полученные данные могут стать основой для дальнейших исследований свойств функционализированных поверхностей полимерных материалов, а также физико-химических характеристик иммобилизованных иммунореагентов при их использовании в ИФА.

Научная значимость полученных результатов определяется их использованием в изучении механизмов молекулярной сорбции на твердой поверхне-

сти, в исследовании свойств белков и других макромолекул при их взаимодей ствии с функционализированньши полимерами, при получении препарате для атомно-силовой микроскопии, в разработке методик иммунохимическог анализа, в иммунологических и других биохимических исследованиях. Опи санные активированные матрицы использованы сотрудниками учреждени НАН Беларуси при проведении собственных исследований.

Предложенные подходы к дизайну активированных носителей могу быть применены в работе с разнообразными полимерными матрицами органи ческой или неорганической природы.

Практическая значимость полученных результатов. Полученные рс зультаты использованы при разработке иммунодиагностических наборов і иммуносенсорных систем. Возможно их коммерческое использование в произ водстве наборов реагентов и активированных матриц. Разработанная методик: экспресс-анализа IgG, позволяющая быстро и с высокой точностью определят! концентрацию этого белка, уже использована сотрудниками ИБОХ НАНБ і научных исследованиях.

Кроме описанных в диссертации методик ИФА в ИБОХ НАН Бсларуи на основе ФПСШ разработаны наборы реагентов для анализа стероидных гор монов, строфантина К и для иммунорадиометрического анализа (ИРМА) фер ритина, методики ИРМА и ИФА легких цепей IgG человека. Все эти наборь реагентов успешно прошли медицинские испытания в учреждениях Мини стерства здравоохранения Беларуси.

Практическая значимость работы определяется универсальностью разработанных матриц и возможностью использования тест-систем на их основе с применением специализированного оборудования фирм "Abbott", "F. Hoffmann-La Roche" и многих других.

На основе данных представленной работы возможно изготовление активированных матриц, производство наборов реагентов для иммуноанализа і разработка новых средств иммуноанализа.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту.

12. Получение полистирольных макроносителей с различными функциональными группами для ковалентной иммобилизации иммунореагентов.

13. Получение бифункциональных матриц, содержащих альдегидные и суль-фогруппы, карбоксильные и аминогруппы.

14. Получение армированных и имнрегнированных полимерами бумажных носителей иммунореагентов.

15. Способ стабилизации активного слоя ФПСШ при высушивании.

16. Закономерности иммобилизации белков на ФПСШ.

17. Методики количественного анализа карбонильных, аминных и гидразид-ных групп на полистирольных макроносителях.

. Метод блокировки неспецифической сорбции пероксидазных конъюгатов

на ФПСШ. . Направленная иммобилизация антител на гидразидсодержанщх матрицах. . Получение иммуносорбента и методика конкурентного экспресс-ИФА IgG

с использованием ФПСШ.

18. Получение иммуносорбента и методика "сэндвич"-ИФА ХГч с использованием ФПСШ.

19. Получение иммуносорбентов на основе модифицированной бумаги и методики ИФА кортизола и прогестерона с их использованием.

Личный вклад соискателя. Основная часть результатов получена лично втором и сотрудниками группы функциональных полимеров ИФОХ НАНБ од его руководством. Планирование экспериментов, теоретическое обсужде-ие и оформление результатов проводилось совместно с научным руководите-ем, научным консультантом и лично автором. Экспериментальные'данные с спользованием ЯМР-спектроскопии, AFM-микроскопии и элементного мик-оанализа получены сотрудниками ИФОХ НАНБ.

Опубликоваиность результатов. Результаты диссертации опубликова-ы в 13 статьях с общим количеством страниц - 86.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, бщей характеристики работы, обзора литературы (глава 1) и пяти глав основой части, заключения и приложений.