Содержание к диссертации
Введение
2. Основная часть диссертации 9
2.1 Обзор литературы .9
2.1.1. Особенности физиологии желудочно-кишечного тракта птиц 9
2.1.2. Эффективность кормовых добавок, регулирующих микрофлору желудочно-кишечного тракта сельскохозяйственной птицы
2.1.2.1. Эффективность кормовых антибиотиков в птицеводстве 13
2.1.2.2. Эффективность пробиотиков в птицеводстве 18
2.1.3. Микрофлора желудочно-кишечного тракта сельскохозяйственной птицы 25
2.1.3.1. Общие сведения о микрофлоре желудочно-кишечного тракта 25
2.1.3.2. Сведения о микрофлоре желудочно-кишечного тракта птиц, полученные при помощи методов бактериологических высевов .32
2.1.3.3. Сведения о микрофлоре желудочно-кишечного тракта птиц, полученные при использовании молекулярно-генетических методов .36
2.1.4. Заключение по обзору литературы 42
2.2. Материал и методы исследований... 43
2.2.1. Методика проведения научно-хозяйственных опытов 43
2.2.2. Методика T-RFLP-анализа микрофлоры желудочно-кишечного тракта цыплят-бройлеров 52
2.3. Результаты исследований 61
2.3.1. Микрофлора ЖКТ, физиологические и зоотехнические показатели цыплят-бройлеров при использовании в рационе кормов животного происхождения в течение всего периода выращивания на фоне применения препаратов Стафак-110 и Целлобактерин-Т 61
2.3.1.1. Данные T-RFLP- анализа микрофлоры двенадцатиперстной кишки и слепых отростков цыплят-бройлеров 61
2.3.1.2. Результаты выращивания цыплят-бройлеров 86
2.3.2. Микрофлора ЖКТ, физиологические и зоотехнические показатели цыплят-бройлеров при использовании в рационе кормов животного происхождения до 15-дневного возраста с последующим их полным исключением до конца выращивания на фоне применения препаратов Стафак 110 и Целлобактерин-Т 89
2.3.2.1. Данные T-RFLP-анализа микрофлоры двенадцатиперстной кишки и слепых отростков цыплят- бройлеров .89
2.3.2.2. Результаты выращивания цыплят-бройлеров .114
2.3.3. Микрофлора ЖКТ, физиологические и зоотехнические показатели цыплят-бройлеров при использовании в рационе кормов животного происхождения до 5-дневного возраста с последующим их полным исключением до конца выращивания на фоне применения препаратов Стафак 110 и Целлобактерин-Т 117
2.3.3.1. Данные Т-RFLP-анализа микрофлоры двенадцатиперстной кишки и слепых отростков цыплят-бройлеров 117
2.3.3.2. Результаты выращивания цыплят - бройлеров .
2.3.4. Производственная проверка результатов применения препаратов Стафак-110 и Целлобактерин-Т при выращивании цыплят-бройлеров .147
2.3.5. Обсуждение результатов исследований 150
3. Заключение 152
3.1 Выводы 152
3.2 Предложения производству 154
3.3 Перспективы дальнейшей разработки темы 154
Список сокращений .155
Список литературы
- Эффективность кормовых антибиотиков в птицеводстве
- Методика T-RFLP-анализа микрофлоры желудочно-кишечного тракта цыплят-бройлеров
- Микрофлора ЖКТ, физиологические и зоотехнические показатели цыплят-бройлеров при использовании в рационе кормов животного происхождения до 15-дневного возраста с последующим их полным исключением до конца выращивания на фоне применения препаратов Стафак 110 и Целлобактерин-Т
- Производственная проверка результатов применения препаратов Стафак-110 и Целлобактерин-Т при выращивании цыплят-бройлеров
Введение к работе
Актуальность темы. Птицеводство России является наиболее устойчивой и динамично развивающейся отраслью агропромышленного комплекса, сумевшей в короткие сроки увеличить объем птицеводческой продукции и обеспечить население высококачественными диетическими продуктами — яйцом и мясом. Высокие темпы мирового производства мяса птицы во многом связаны с последними достижениями в области генетики, селекции, кормления, технологии содержания и ветеринарной защиты (И. А. Егоров и др., 2011; В.И. Фисинин и др., 2013; Б.Ф. Бессарабов и др., 2014).
Однако промышленная технология выращивания цыплят-бройлеров фактически не учитывает роли микрофлоры желудочно-кишечного тракта в реализации генетического потенциала и возникает проблема формирования кишечной микрофлоры у цыплят в первые дни жизни, что ставит их существование в зависимость от санитарного состояния кормов, воды, условий содержания и не позволяет своевременно активизироваться процессам пищеварения (А.М. Первова, 2003; Г.Ю. Лаптев, 2012). Кроме того в процессе выращивания и содержания птицы происходит смена питательности комбикормов и замена одних компонентов на другие, практикуется использование комбикормов растительного типа, замена рыбной муки на мясокостную и т.п. Все это в той или иной степени оказывает влияние на состояние микрофлоры желудочно-кишечного тракта и, как следствие, на процессы пищеварения, рост птицы, жизнеспособность и конверсию корма.
Большая часть данных о микрофлоре желудочно-кишечного тракта
сельскохозяйственной птицы была получена с помощью классических
методов микробиологии, имеющих ряд существенных недостатков и без
учета возрастной динамики, особенностей рациона, присутствия в
комбикормах добавок, нормализующих микробиологический баланс. Кроме
того, зарубежными исследователями установлено, что значительная часть
микробных ассоциаций представлена некультивируемыми видами,
неспособными расти на существующих питательных средах (М.А. Тимошко,
1990; Л.А. Ильина, 2015; Engberg et al., 2000). Появление и развитие
современных молекулярно-генетических методов позволяет изучать
разнообразие микроорганизмов, минуя стадию культивирования. К наиболее перспективным методам относят полимеразную цепную реакцию (ПЦР) и в частности T-RFLP-анализ (Terminal restriction fragment length polymorphism) — молекулярно-генетический метод, основанный на оценке полиморфизма
длин амплифицированных рестрикционных фрагментов ДНК
микроорганизмов. Он предназначен для определения общей и
относительной численности, а также таксономической принадлежности всех бактерий в микробной экосистеме, что дает возможность осуществлять широкомасштабное и детальное сравнительное изучение микробных сообществ в их развитии и изменении (Xiang et al., 2002; Amit-Romach et al., 2004).
Степень разработанности темы исследований. Препараты Стафак-110 и Целлобактерин-Т прошли ряд широких производственных испытаний в птицеводстве, свиноводстве и молочном скотоводстве на территории Российской Федерации и за рубежом (Первова, 2005; Пономаренко и др., 2009; Лаптев, 2010; Бушов и др., 2012; Хойцман и др., 2012). По результатам исследований для бройлерного птицеводства была установлена оптимальная дозировка, которая составляет для препарата Стафак-110 180г/т корма, а для Целлобактерина-Т – 1 кг/т.
Цель и задачи исследований. Главной целью диссертационной
работы являлось изучение состава микрофлоры желудочно-кишечного тракта цыплят-бройлеров в возрастной динамике в зависимости от состава комбикорма и наличия в нем кормового антибиотика и пробиотика. Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:
– изучить возрастную динамику микрофлоры желудочно-кишечного тракта
цыплят с помощью метода T-RFLP-анализа, физиологические и
зоотехнические показатели цыплят в зависимости от состава комбикормов;
– изучить микробиологические, физиологические и зоотехнические
показатели цыплят-бройлеров при постоянном применении кормового
антибиотика и пробиотика;
– определить экономическую эффективность использования кормового антибиотика и пробиотика при выращивании цыплят-бройлеров.
Положения, выносимые на защиту. На основании проведенных исследований на защиту выносятся следующие положения:
– характеристика возрастных изменений микрофлоры желудочно-кишечного тракта бройлеров в зависимости от состава комбикорма и наличия в нем кормового антибиотика и пробиотика;
– микробиологическое, физиологическое, зоотехническое и экономическое обоснование к использованию в комбикормах для бройлеров препаратов Стафак-110 и Целлобактерин-Т.
Научная новизна работы. Впервые был проведен комплексный анализ таксономической структуры микробного сообщества желудочно-4
кишечного тракта цыплят-бройлеров с помощью молекулярно-генетического
метода T-RFLP-анализа с учетом возрастной динамики в зависимости от
состава комбикорма и использования кормового антибиотика и
пробиотического препарата.
Теоретическая значимость работы. Получены новые данные о формировании микрофлоры в желудочно-кишечном тракте цыплят-бройлеров в процессе роста и ее изменениях в зависимости от рецептуры комбикорма и использования кормового антибиотика и пробиотика.
Практическая значимость работы. С использованием метода T-
RFLP-анализа в желудочно-кишечном тракте цыплят-бройлеров было
выявлено множество микробных сообществ, установлена их связь с составом
комбикорма, присутствием кормового антибиотика и пробиотика,
физиологическими особенностями пищеварения и зоотехническими
показателями, что позволило разработать способы регулирования
микробиологических процессов в желудочно-кишечном тракте,
направленные на повышение эффективности использования корма и
продуктивности цыплят-бройлеров.
Материалы исследований были использованы при разработке
методических рекомендаций «Руководство по использованию биопрепаратов
и кормовых добавок для обеспечения здоровья и повышения продуктивности
бройлеров (Сергиев Посад, ГНУ ВНИТИП, 2013), «Методика проведения
научных и производственных исследований по кормлению
сельскохозяйственной птицы. Молекулярно-генетические методы
определения микрофлоры кишечника» (Сергиев Посад, ГНУ ВНИТИП, 2013), а также методического руководства «Молекулярно-генетические методы определения микрофлоры кишечника и установление нормы ее содержания в желудочно-кишечном тракте цыплят-бройлеров» (Сергиев Посад, ФГБНУ ВНИТИП, 2015).
Методология и методы исследования. Объектом исследования служили цыплята кросса «Cobb 500» с суточного до 36-дневного возраста. В результате исследований применялись различные методы изучения и анализа: статистические – при учете зоотехнических показателей, физиологические – при определении переваримости и использования питательных веществ корма, биохимические – при изучении состава кормов и помета, экономические – при определении экономического эффекта от применения препарата, аналитические – для сопоставления и анализа полученных результатов и их обсуждения.
Степень достоверности результатов проведенных исследований в
условиях ФГУП «Загорское ЭПХ ВНИТИП» характеризуется значимостью
исследований для производства и экономической эффективностью от
использования препаратов Стафак-110 и Целлобактерин-Т.
Экспериментальные данные получены на большом фактическом материале, обработаны биометрически с применением методов вариационной статистики. Микробиологические и биохимические исследования проведены на сертифицированном оборудовании на базе ООО «Биотроф+» и ФГБНУ ВНИТИП.
Апробация работы. Материалы диссертации были доложены и обсуждены на семинаре молодых ученых «Современные проблемы в ветеринарной науке и практике» (Москва, МГАВМиБ им. Скрябина, 28 мая
2013 года), на 55-ой научно-практической конференции молодых ученых и
аспирантов по птицеводству (Сергиев Посад, ФГБНУ ВНИТИП, 21 октября
2014 года), на XVIII международной конференции Всемирной научной
ассоциации по птицеводству «Инновационное обеспечение яичного и
мясного птицеводства России» (Сергиев Посад, 19-21 мая 2015 года), на
20-ом Европейском симпозиуме по кормлению птицы (Прага, Чешская
Республика, 25-28 августа 2015 года), а также на техническом семинаре
компаний Lohmann и Alltech «Физиология, кормление и качество скорлупы
яичной птицы» (Санкт-Петербург, 19-22 октября 2015 года). Также работа
приняла участие в международном конкурсе «Alltech young scientist»
(Лексингтон, США, май 2015 года), где по результатам данной программы
она заняла 1-е место среди российских публикаций и была отмечена
медалью.
Публикации результатов исследований. По материалам диссертации опубликовано 12 научных работ, в том числе в журналах, рекомендованных ВАК РФ – 4, а также в иностранных изданиях – 2. Все публикации выполнены в рамках гранта российского научного фонда по научному проекту «Современные представления о микрофлоре кишечника птицы при различных рационах питания: молекулярно-генетические подходы» № 14-16-00140.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 181 странице машинописного текста, включает 34 таблицы, 12 рисунков, состоит из оглавления, введения, основной части диссертации, заключения, списка сокращений, списка литературы, включающего 199 источников, в том числе 131 на иностранных языках и приложения.
Эффективность кормовых антибиотиков в птицеводстве
У сельскохозяйственных животных и птицы слизистая оболочка кишечника формирует наибольшую поверхность контакта с внешней средой и играет важную роль во всасывании нутриентов, солей, воды (Nabuurs et al., 1993). Кроме метаболических функций, кишечный эпителий составляет первую линию защиты от патогенов. Таким образом, любые изменения в морфологии кишечника могут привести к подавлению всасывания, повышению секреции, диарее, снижению устойчивости к болезням и продуктивности в целом (Фисинин и др., 2013).
Желудочно-кишечный тракт имеет множество факторов защиты организма от различных негативных факторов. Первая группа факторов включает физические барьеры: наличие слизистого слоя, муцина, поддержание низких значений рН в железистом желудке и кишечнике, протективные свойства секретов поджелудочной железы и желчи, перистальтика и т.п. (Brandtzaeg, 2010).
Слизистая оболочка кишечника покрыта простым микроворсинчатым цилиндрическим эпителием (энтероциты). Эпителий имеет очень высокую способность самовозобновления, и полная замена эпителия происходит каждые 4-5 дней. Энтероциты обладают специфическими рецепторами апикальной мембраны, распознающими бактериальные антигены, активация которых приводит к локальным иммунным реакциям. Наряду с энтероцитами, гоблет-клетки (бокаловидные клетки) и клетки Паннета обеспечивают защиту от патогенов путем синтеза и секреции муцина, антимикробных пептидов и иммунорегулирующих факторов (Deplanсke, 2001).
Секретируемый бокаловидными клетками муцин действует как защитный барьер и система транспорта между содержимым кишечника и эпителиальными клетками. Секретируемый муцин покрывает поверхность энтероцитов двумя слоями – внутренним плотным и внешним более разжиженным. Такое взаимодействие затрудняет доступ бактерий к слизистой оболочке и возможность их прикрепиться к клеткам эпителия. Следует также иметь в виду, что муциновый слой на поверхности слизистой служит источником нутриентов для многих кишечных организмов и некоторые виды бактерий, живущие в кишечнике, могут утилизировать полисахариды муцина (Kim, Ho, 2010).
В кишечнике птиц существует тонкая связь между количеством муцина и микрофлорой. Это доказывает тот факт, что гоблет-клетки могут менять состав секретируемого муцина в ответ на колонизацию Clostridium perfringens (Forder et al., 2007). При этом рН содержимого влияет на рост микроорганизмов, а также кормовые факторы. Например, наличие клетчатки в кормах способствует синтезу муцина. Подавление синтеза муцина у птиц может привести к снижению утилизации питательных веществ корма (Horn et al., 2009).
Огромную роль в поддержании гомеостаза организма у птиц играют антимикробные пептиды (AMP) – компоненты врожденного иммунитета, способные нарушать целостность мембран микроорганизмов. У цыплят хорошо изучены галлицины 10 типов от Ga-1 до Ga-10. При этом в кишечнике в основном синтезируются Ga-1 и Ga-2. Отмечено, что галлицины обладают сильной антибактериальной активностью в отношении Campylobacter spp., Salmonella spp., Clostridia spp., Listeria monocytogenes (Hong et al., 2012).
Большое значение имеют и лизоцим и иммуноглобулины. Лизоцим -фермент, катализирующий расщепление пептидогликана клеточной стенки. Он содержится в фагоцитарных и секреторных гранулах нейтрофилов, синтезируется моноцитами, макрофагами и эпителиальными клетками. Многие грамположительные бактерии очень чувствительны к действию лизоцима, в то время как на большинство грамотрицательных микроорганизмов он не действует (Muir et al., 2000). Функцию нейтрализации выполняют антитела IgG и IgA, которые синтезируются в печени и попадают в кишечник вместе с желчью или через бурсальный канал. Характерной особенностью антител является их строгая специфичность, обусловленная предыдущими воздействиями антигенов на слизистую оболочку кишечника (Klipper et al., 2000).
Однако самую важную роль играет собственно лимфоидная система кишечника, состоящая из отдельных иммунных клеток в эпителиальном слое кишечника и подлежащих слоях. В мышечном и железистом желудке птиц отмечались небольшие скопления лимфоидной ткани, а в двенадцатиперстной кишке были обнаружены кольцевидные лимфоидные образования, называемые пилорическими миндалинами (Lillenhoj et al., 2004). Собственная пластинка кишечника у птиц содержит набор иммунных клеток всех типов, включая плазматические клетки, лимфоциты, макрофаги и гранулоциты (Olah et al., 1984).
В месте перехода подвздошной кишки в слепые отростки обнаруживаются Пейеровы бляшки, а слепые отростки содержат большое количество лимфоидной ткани. Ткань таких образований проникает в подслизистую оболочку и содержит главным образом Т - и В-лимфоциты. Интересен тот факт, что развитие лимфоидной ткани кишечника происходит одновременно с развитием пищеварительных структур и функций (Bar–Shira et al., 2005). Усиление лимфоидной функции связано с присутствием бактерий и совпадает по времени с развитием энтероцитов и ворсинок, а развитие тонкого кишечника происходит позже, чем толстого (Casteleyn et al., 2010).
Взаимодействие между иммунной системой пищеварительного тракта и микрофлорой кишечника цыплят начинается сразу же после вылупления и приводит к низкому уровню воспалительных процессов, характеризующихся увеличением экспрессии интерлейкинов. Такие процессы ведут к проникновению гетерофилов в базальную мембрану или эпителий пищеварительного тракта для нормализации иммунной системы организма (Bar–Shira et al., 2006). Иммунная система кишечника реагирует не только на патогенную флору, но и на колонизацию нормальной микрофлорой. При этом экспрессия интерлейкинов -1; -8; -17; -18 и 22 изменялась в ответ, как на нормальную колонизацию пищеварительного тракта, так и в ответ на инфекцию. Выраженное повышение интерлейкинов выявлялось, как правило, на 4-ый день жизни цыплят. При этом на базальной мембране слепой кишки обнаруживались лимфоцитарные инфильтраты, что указывает на адаптацию иммунной системы к микрофлоре (Lillehoj et al., 1992).
У цыплят, инфицированных в суточном возрасте S.еnteritidis, на 3-ий день после инфекции отмечалось значительное повышение интерлейкинов-1; -8; -17;
-18;-22 в слепой кишке по сравнению с контрольной группой. На 10-ый день после инфекции, гены были экспрессированы на уровнях в 35-40 раз превышающих значения у контрольной группы. С возрастом эти значения снижались лишь до 7-кратного увеличения. Таким образом, созревание иммунной системы организма приводит к ослаблению иммунного ответа к патогенам, что часто приводит к их персистенции в желудочно-кишечном тракте у взрослых особей (Сrhanova et al., 2011).
Методика T-RFLP-анализа микрофлоры желудочно-кишечного тракта цыплят-бройлеров
После разделения фрагментов ДНК посредством электрофореза, при помощи острого скальпеля в геле вырезали полосу с необходимым фрагментом ДНК, после чего ее переносили в микроцентрифужную пробирку. Очистку ДНК из полосы агарозного геля проводили с использованием набора «Genomic DNA Purification Kit» (Fermentas, Литва). В микроцентрифужную пробирку с гелем добавляли 400 мкл лизирующего раствора (lysis solution), перемешивали в вортексе (CVP-2, BioSan, Латвия) и инкубировали при 650С в течение 5 мин в термостате «Гном» (Россия) до полного растворения агарозы. Процедуры преципитации и очистки ДНК выполняли так же, как и при выделении ДНК. По окончании процедур, к полученному осадку добавляли 15 мкл деионизированной воды, смесь перемешивали и полученный раствор использовали для рестрикции. Для проведения рестрикции в каждую пробирку к 100-400 нг. меченой ДНК добавляли реагенты (Fermentas, США): 1,5 мкл буфера для рестрикции; 10 ед. рестриктазы (HaeIII, HhaI и MspI); деионизированной воды – до 15 мкл. Далее смесь перемешивалась в вортексе (CVP-2, BioSan, Латвия) и центрифугировалась в течение 1 мин при 4000 об/мин. Затем полученную смесь ставили в термостат и по истечении срока инкубирования (определенного фирмой-изготовителем), смесь прогревали при 720С – 20 мин.
Следующим этапом подготовки был капиллярный электрофорез. Для этого полученную смесь ДНК с рестриктазой вносили в пробирку эппендорф, добавляли 1 мкл гликогена, 1,5 мкл 3М раствора ацетата натрия и 40 мкл 96% спирта. Полученную смесь в течение 2 мин смешивали в вортексе (CVP-2, BioSan, Латвия), затем центрифугировали 10 мин при 14000 об/мин, удаляли жидкую фазу, а осадок инкубировали в термостате «Гном» (Россия) при температуре 450С до полного высушивания. Затем полученный осадок растворяли в 10 мкл буфера для разделения SLS (Bechman Coulter). К каждой пробе ДНК добавляли 0,2 мкл контрольного маркера – набора для определения размера фрагментов ДНК – 600 («Size Standart 600», Beckman Coulter). Полученную смесь перемешивали в вортексе (CVP-2, BioSan, Латвия) в течение 1-2 мин, добавляли по 10 мкл минерального масла. Затем пробы помещали в автоматический секвенатор CEQ8000 (Bechman Coulter, США), снабженный программой подсчета длины фрагментов каждой пробы относительно заложенных в пробу стандартов. Введение в каждую пробу контрольного маркера («Size Standart 600», Beckman Coulter) позволило провести точное определение длины рестрикционных фрагментов.
После проведения электрофореза его параметры хранятся в файлах, содержащих табулированные данные сканирования геля и его графический имидж – электрофореграмму (рис. 3). Рис. 3. Электрофореграмма бактериального сообщества содержимого кишечника бройлеров: пики красного цвета – маркерные, синего цвета – искомые.
На первом этапе после получения данных T-RFLP производится проверка качества полученных T-RFLP- грамм. Интенсивность флуоресценции должна составлять 10-200 тыс. единиц, длина контрольных фрагментов – 600 п.н. Затем проводился подсчет матрицы данных при помощи таблицы Exel. После этого проводилось определение филогенетической принадлежности микроорганизмов с помощью программы FragSort (http://mica.ibest.uidaho.edu). Эта программа формировала сводную таблицу, в которой каждому пику присуждалось несколько возможных кандидатур микроорганизмов, имеющих соответствующие длины терминальных рестрикционных фрагментов гена 16SрРНК. Для определения точной таксономической принадлежности филотипов, использовались результаты обработки проб как минимум для трех эндонуклеаз (HaeIII, HhaI и MspI). Содержание филотипов микроорганизмов определяли при расчете процентной доли в микробном сообществе.
Далее для определения количественного содержания в пробе конкретной группы микроорганизмов, основываясь на данных T-RFLP-анализа, проводили исследования методом Realime PCR (RT-PCR). Выделение ДНК для проведения RT-PCR и контроль качества препарата проводились аналогично таковым для T-RFLP. Для проведения ПЦР-амплификации ДНК готовили смесь реагентов (Fermentas, США): праймеры – 10 пМ; Taq-полимераза – 10 единиц; х10 буфер для Taq-полимеразы; MgCl2 – 2,5 мМ; смесь дезоксинуклеозидтрифосфатов – до концентрации 2,5 мМ; ДНК - матрица – 10 нг. Для амплификации гена 16S бактерий подбирали специфичные варианты олигонуклеотидов, меченных с 5 конца флуоресцентной меткой. Дополнительно к опытным пробам включали негативный контроль (смесь без ДНК) и 4 позитивных контроля (ДНК определяемого микроорганизма в серии разведений концентраций геномов). Процедуру ПЦР-амплификации проводили в автоматическом программируемом амплификаторе iCycler (Bio-Rad, США) в следующем режиме: 1 шаг (прогрев): 95С – 3 мин; 2 шаг (денатурация, отжиг праймеров, элонгация): (95С – 30 с, 58-60С – 30-60 с, 72С – 1 мин) – 34 раза; 3 шаг: 72С (элонгация) – 10 мин. В режиме реального времени программа амплификатора на основании стандартов с известной концентрацией геномов строила калибровочный график, согласно которому вычислялось количество геномов в опытных пробах. Математическая обработка результатов проводилась с использованием программы Exel.
Микрофлора ЖКТ, физиологические и зоотехнические показатели цыплят-бройлеров при использовании в рационе кормов животного происхождения до 15-дневного возраста с последующим их полным исключением до конца выращивания на фоне применения препаратов Стафак 110 и Целлобактерин-Т
У 14-дневных цыплят в содержимом двенадцатиперстной кишки в опытной группе с введением в рацион пробиотика общее количество бактерий было выше в 2,3 раза, а в опытной группе с кормовым антибиотиком – в 2,1 раза относительно контрольной группы. Общее количество бактерий в содержимом слепых отростков в опытной группе с введением в рацион пробиотика было выше в 3,87 раза, а в опытной группе цыплят с кормовым антибиотиком – в 1,16 раза по сравнению с контролем.
В 21-дневном возрасте в содержимом двенадцатиперстной кишки у цыплят опытных групп с антибиотиком пробиотиком общее количество бактерий было на уровне контрольной группы. Обще количество бактерий в содержимом слепых отростков в опытной группе цыплят с пробиотиком было выше в 2,43 раза и в опытной группе цыплят с введением в рацион антибиотика – в 1,86 раза относительно контрольной группы.
В 36 - дневном возрасте общее количество бактерий в содержимом двенадцатиперстной кишки у цыплят опытной группы с введением в рацион пробиотика было выше в 1,36 раза, а в опытной группе цыплят с кормовым антибиотиком – в 1,13 раза относительно контрольной группы. Общее количество бактерий в содержимом слепых отростков в опытной группе цыплят с пробиотиком было выше в 2,79 раза и в опытной группе цыплят с введением в рацион антибиотика – в 1,14 раза относительно контрольной группы.
Среди представителей нормоценоза кишечника значительную роль играют целлюлозолитические бактерии: бактероиды, лахноспиры, руминококки, термоанаэробактерии, сукцинивибро, клостридии, хелиобактерии. Поскольку у птиц практически отсутствуют собственные пищеварительные ферменты для расщепления целлюлоз и других некрахмалистых полисахаридов роль данных микроорганизмов в пищеварении цыплят-бройлеров трудно переоценить.
Количество данных бактерий в исследуемых отделах кишечника бройлеров на протяжении всего опыта было наиболее высоким с добавлением в рацион антибиотика и пробиотика, наиболее низким – в контрольной группе (Таблица 26).
У суточных цыплят в опытной группе с использованием пробиотика количество данных микроорганизмов в содержимом двенадцатиперстной кишки было выше в 12,97 раза, а в группе цыплят с антибиотиком – в 4,68 раза относительно контрольной группы. Количество целлюлозолитических бактерий в содержимом слепых отростков в опытной группе цыплят с пробиотиком было выше в 5,25 раза, а в группе цыплят, получавших антибиотик – в 1,58 раза относительно контроля.
У 7-дневных цыплят опытной группы с введением в рацион пробиотика численность целлюлозолитической микрофлоры в содержимом двенадцатиперстной кишки была выше в 3,18 раз, а в опытной группе цыплят с антибиотиком – в 1,45 раза относительно контрольной группы. Количество данных микроорганизмов в содержимом слепых отростков цыплят в опытной группе с пробиотиком было выше в 8,21 раза и в опытной группе цыплят с введением в рацион антибиотика – в 2,71 раза относительно контрольной группы.
У 14-дневных цыплят количество целлюлозолитических бактерий в содержимом двенадцатиперстной кишки у опытной группы с пробиотиком было выше в 3,23 раза, а в опытной группе цыплят с кормовым антибиотиком – в 2,15 раза по отношению к контрольной группе. Количество данных микроорганизмов в содержимом слепых отростков в опытной группе цыплят с введением в рацион пробиотика было выше в 8,54 раза, а в опытной группе цыплят с кормовым антибиотиком – в 3,12 раза по сравнению с контрольной группой.
У 21-дневных цыплят опытной группы с введением в рацион пробиотика численность целлюлозолитических бактерий в содержимом двенадцатиперстной кишки была выше в 2,64 раза, а в опытной группе цыплят с кормовым антибиотиком – в 1,32 раза относительно контрольной группы. Количество данных микроорганизмов в содержимом слепых отростков в опытной группе цыплят с пробиотиком было выше в 3,35 раза и в опытной группе цыплят с введением в рацион антибиотика – в 1,65 раза относительно контрольной группы.
В 36-дневном возрасте количество целлюлозолитических микроорганизмов в содержимом двенадцатиперстной кишки у цыплят опытной группы с введением в рацион пробиотика было выше в 3,06 раза и в опытной группе цыплят с кормовым антибиотиком – в 1,47 раза относительно контрольной группы. Количество данных микроорганизмов в содержимом слепых отростков в опытной группе цыплят с пробиотиком было выше в 19,16
Производственная проверка результатов применения препаратов Стафак-110 и Целлобактерин-Т при выращивании цыплят-бройлеров
Однако, вследствие использования нами одинаковых по составу и питательности комбикормов, его цена в новых вариантах была выше, исходя из стоимости добавок: в группе, получающей Стафак-110 в среднем на 1,2% и в группе с Целлобактерином-Т – на 1,0% относительно базового варианта. Таким образом, более высокий прирост живой массы способствовал снижению себестоимости произведенной продукции.
В частности, себестоимость 1 кг прироста живой массы бройлеров, складывающаяся из зарплаты, стоимости кормов, прочих прямых затрат и накладных расходов в новом варианте 1 была ниже на 0,21% и в новом варианте 2 – на 0,80 % относительно контрольной группы, что обеспечило экономический эффект. Расчет экономической эффективности проводили по формуле: Э = (СБ – СН) АН , где СБ, СН – себестоимость 1 кг прироста живой массы бройлеров (контрольная и опытная), руб.; АН – количество произведённой продукции в новом варианте, кг. Э (Новый 1) = (57,41 - 57,29) 214,641 = 25,91 руб. Э (Новый 2) = (57,41 - 56,95) 213,801 = 97,85 руб. В пересчёте на 1000 голов цыплят-бройлеров экономический эффект от использования препарата Стафак-110 бройлерам, составил 246,76 рублей, а эффект от Целлобактерина-Т – 931,90 рублей относительно контрольной группы.
Полученные нами результаты T-RFLP-анализа подтвердили мнение ряда ученых о том, что микробный фон желудочно-кишечного тракта цыплят-бройлеров уже с первого дня жизни имеет огромное биологическое разнообразие и зависит от многих факторов, в т.ч. от рационов, имеющих отличный друг от друга состав (Lev, Briggs, 1956; Mead, Adams, 1975; Георгиевский, 1990; Тимошко, 1990; Engberg et al., 2000; Qui et al., 2001; Hubener et al., 2002; Xiang et al., 2002; Aktan, Sagdic, 2004; Bjerrum et al., 2005; Маилян, 2007; Wise, Siragusa, 2007; Vanden Abbele et al., 2010; Torok et al., 2011; Paul et al., 2013; Zdunczik et al., 2015), а также введения в рацион кормовых антибиотиков и пробиотических препаратов (Егоров, 2003; Лаптев, 2003; Первова, 2005; Фисинин, 2005; Крюков, 2006; Ленкова и др., 2007; Сhoudhary et al., 2008; Li et al., 2008; Пономаренко, 2009; Yang et al., 2009; Chee et al., 2010; Zhou et al., 2010; Лаптев, 2012; Хойцман и др., 2012; Абдельрахман, 2015).
Данные, полученные в научно-практических опытах с помощью молекулярно-генетических, биохимических, физиологических и зоотехнических методов показали, что микрофлора желудочно-кишечного тракта цыплят-бройлеров является динамичной системой. Установлено, что смена стартерного рациона на ростовой, ростового – на финишный, а также введение кормового антибиотика и пробиотического препарата приводили к изменению микробного фона желудочно-кишечного тракта, и как следствие изменению показателей переваримости корма и продуктивности животных, что подтверждается некоторыми авторами (Лаптев и др., 1994; Кислюк и др., 2004; Koenen et al., 2004; Risoen et al., 2004; Li et al., 2008; Zhou et al., 2010; Chee et al., 2010).
Нами было отмечено, что кормовой антибиотик и пробиотик оказали положительное влияние на микрофлору, увеличивая количество полезных бактерий в желудочно-кишечном тракте, таких как лактобактерии, бифидобактерии, бациллы, селеномонады, целлюлозолитические бактерии. При этом численность условно-патогенных бактерий, таких как энтеробактерии, актиномицеты, пастереллы, кампилобактерии, снижалась у цыплят из опытных групп по сравнению с контролем. При этом не было отмечено негативного эффекта от использования кормового антибиотика на полезную микрофлору желудочно-кишечного тракта цыплят. С учетом того, что в ростовой период наблюдался дефицит полезной микрофлоры, то предпочтительнее в данной ситуации использовать пробиотический препарат, однако резкий рост нежелательной микрофлоры в финишный период жизни цыплят-бройлеров требует продолжения использования пробиотика в рационе, либо заменой его более сильный антибактериальный препарат, каким является кормовой антибиотик
Результаты проведенных нами экспериментов свидетельствуют о необходимости использования прогрессивного метода T-RFLP-анализа для получения наиболее полного представления о микробном фоне желудочно-кишечного тракта птиц, поскольку действие каждого препарата зависит не только от его дозировки и схемы применения, но напрямую и от состава конкретного рациона.
В результате комплексных исследований получены данные, которые существенно дополняют знания о микробном фоне цыплят-бройлеров, что открывает новые перспективные направления для поиска способов направленной регуляции микробиологических процессов в желудочно-кишечном тракте. Таким образом, постановка T-RFLP-анализа позволит детально изучить причины снижения или повышения продуктивности сельскохозяйственной птицы, корректировать нарушения микробиоценоза за счет разработки новых биологических препаратов, что позволит увеличить экономическую эффективность птицеводства в целом.