Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 14
1.1 Источники микроэлементов в питании сельскохозяйственных животных 14
1.2 Современные препараты микроэлементов: достоинства и недостатки 27
1.3 Биологические эффекты ультрадисперсных металлов микроэлементов в животноводстве .
1.4 Перспективность дальнейших исследований по применению препаратов-микроэлементов на основе ультрадисперсных частиц 50
1.5 Заключение по обзору литературы 55
2. Результаты собственных исследований 57
2.1 Материалы и методы исследования 57
2.2. Результаты лабораторных исследований 72
2.2.1 Результаты лабораторных исследований по физико-химической и биологической оценке препаратов ультрадисперсных частиц металлов-микроэлементов 72
2.2.1.1Физико-химические характеристики препаратов ультрадисперсных частиц металлов-микроэлементов 72
2.2.1.2 Результаты биологической оценки препаратов металлов-микроэлементов на модели бактериальной люминесцентной тест-системы 78
2.2.1.3 Результаты биологической оценки препаратов металлов-микроэлементов на модели инфузорий Stylonichia mytilus 86
2.2.2 Результаты исследований биологической оценки препаратов микроэлементов на цыплятах-бройлерах 90
2.2.2.1 Корма и кормление цыплят-бройлеров 90
2.2.2.2 Рост и развитие цыплят-бройлеров 93
2.2.2.3 Микробиоценоз кишечника цыплят-бройлеров 94
2.2.2.4 Минеральный обмен в организме цыплят-бройлеров 102
2.2.3 Резюме по итогам исследований 104
2.3 Изучение влияния различных способов введения
ультрадисперсных частиц железа на обмен веществ и
продуктивные качества цыплят-бройлеров 105
2.3.1. Корма и кормление подопытной птицы 105
2.3.2 Рост, развитие и продуктивные качества цыплят-бройлеров 108
2.3.3 Морфологические и биохимические показатели крови цыплят бройлеров 110
2.3.4 Переваримость питательных веществ рационов 112
2.3.5 Химический состав тканей тела цыплят-бройлеров 114
2.3.6 Обмен энергии в организме подопытной птицы 117
2.3.7 Минеральный обмен в организме цыплят-бройлеров 119
2.3.8 Исследования по оценке микроструктуры и других характеристик тканей при внутримышечном способе введения ультрадисперсных частиц железа 124
2.3.9 Результаты производственной проверки 135
2.3.10 Резюме по итогам исследований 136
2.4 Исследования по оценке перспективности различных путей введения ультрадисперсных частиц меди на обмен веществ и продуктивные качества цыплят-бройлеров 137
2.4.1 Пилотные исследования по оценке различных способов введения ультрадисперсных частиц меди в организм цыплят-бройлеров 137
2.4.1.1 Корма и кормление подопытных цыплят-бройлеров 138
2.4.1.2 Рост и развитие подопытных цыплят-бройлеров 139
2.4.1.3 Морфо-биохимический состав крови цыплят-бройлеров 142
2.4.2 Результаты исследований по оценке различных способов введения ультрадисперсных частиц меди на переваримость кормов,
продуктивность и обмен веществ в организме цыплят-бройлеров 146
2.4.2.1.1 Корма и кормление подопытной птицы 147
2.4.2.1.2 Рост и развитие подопытной птицы 149
2.4.2.1.3 Переваримость питательных веществ рационов 150
2.4.2.1.4 Химический состав тканей тела цыплят-бройлеров 151
2.4.2.1.5 Особенности межуточного обмена 154
2.4.2.1.6 Минеральный обмен в организме цыплят-бройлеров 155
2.4.3 Микроструктурная характеристика тканей при различных способах введения ультрадисперсных частиц меди 167
2.4.4 Результаты производственной проверки 179
2.4.5 Резюме по итогам исследований 180
2.5 Разработка препаратов-микроэлементов антагонистов на основе ультрадисперсных частиц сплавов 182
2.5.1 Изучение влияния микроэлементов антагонистов Fe и Co на основе ультрадисперсных частиц их сплава на обмен веществ и продуктивные качества цыплят-бройлеров 182
2.5.1.1 Корма и кормление подопытной птицы 182
2.5.1.2 Рост и развитие корма цыплят-бройлеров 184
2.5.1.3 Биохимические и морфологические показатели крови цыплят-бройлеров 185
2.5.1.4 Оценка влияния ультрадисперсных частиц сплава Fe-Co переваримость корма 188
2.5.1.5 Минеральный обмен в организме цыплят-бройлеров 189
2.5.2 Результаты производственной проверки 194
2.5.3 Исследование по оценке действия ультрадисперсных частиц сплава Cu-Zn на обмен веществ и продуктивные качества цыплят бройлеров 196
2.5.3.1 Корма и кормление цыплят-бройлеров 197
2.5.3.2 Рост подопытной птицы 199
2.5.3.3 Минеральный обмен в организме цыплят-бройлеров 201
2.5.3.4 Биохимические и морфологические показатели крови цыплят бройлеров, антиоксидантный статус 207
2.5.3.5 Оценка влияния ультрадисперсных частиц сплава Cu-Zn на микроструктуру органов-мишений (печень, фабрициева сумка, селезёнка, тимус) цыплят-бройлеров 218
2.5.3.6 Оценка влияния ультрадисперсных частиц сплава Cu-Zn на микробиоценоз кишечника цыплят-бройлеров 225
2.5.3.7 Резюме по итогам исследований 231
3. Обсуждение полученных результатов 232
4. Заключение 253
5. Предложения производству 257
6. Перспективы дальнейшей разработки темы 258
7. Список используемой литературы .
- Перспективность дальнейших исследований по применению препаратов-микроэлементов на основе ультрадисперсных частиц
- Результаты лабораторных исследований по физико-химической и биологической оценке препаратов ультрадисперсных частиц металлов-микроэлементов
- Пилотные исследования по оценке различных способов введения ультрадисперсных частиц меди в организм цыплят-бройлеров
- Оценка влияния ультрадисперсных частиц сплава Cu-Zn на микроструктуру органов-мишений (печень, фабрициева сумка, селезёнка, тимус) цыплят-бройлеров
Введение к работе
Актуальность темы. По мере повышения генетического потенциала пород и кроссов сельскохозяйственных животных перечень нормируемых минеральных веществ неуклонно увеличивается и для некоторых видов уже превышает 30 наименований (Фисинин В.И., Егоров И.А., 2015). Причём наряду с валовым содержанием минеральных веществ в рационе всё большее значение уделяется биодоступности компонентов и их антагонистическим взаимоотношениям (Goyer R.A., 1997; Rohner F. et al., 2007). Наиболее широко используемые источники эссенциальных химических элементов (минеральные соли), как правило, характеризуются низкой биодоступностью, прооксидантным эффектом (Альберт А., 1989), их применение в кормлении животных сопровождается дисбиозами (Dostal A. et al, 2012); энтеральными расстройствами (Cancelo-Hidalgo M.J. et al, 2013) и др. Этим, в частности, объясняется неоднозначное восприятие металлотерапии и особый интерес к низкотоксичным препаратам химических элементов (Шацких Е.В., и др., 2009; Егоров И.А., 2013). В связи с чем, перспективный путь развития современного высокоинтенсивного животноводства состоит в поиске и использовании новых источников химических элементов. В их числе могут рассматриваться препараты ультрадисперсных частиц (УДЧ) металлов (Глущенко Н.Н. и др., 1989; Zhang J. et al, 2005; Hao L. et al, 2014), получающие всё более широкое применение в медицине и биологии (Ruparelia J.P. et al, 2008; et al, 2010), в том числе в качестве новых источников микроэлементов, для проведения диагностических исследований в качестве контраста (Mahamad F.A. et al, 2014; Neubert J. et al, 2015) и др.
В значительной степени интерес к применению ультрадисперсных
препаратов металлов-микроэлементов в животноводстве связан с
деятельностью ведущих мировых корпораций и объединений
производителей, в числе которых Американская ассоциация производителей кормов (AFIA).
Степень разработанности темы. Наукой накоплен значительный багаж знаний в области разработки и применения ультрадисперсных химических элементов в питании животных. Причём наиболее активно в этом направлении работают китайские и американские исследовательские центры. Однако, началом исследований по проблеме стали экспериментальные исследования, начатые в СССР во Всесоюзном НИТИ птицеводства (Куренева В.П., Егоров И.А., Фёдоров Ю.И. и др., 1987), где на птице были апробированы разработки научной школы нобелевского лауреата Н.Н. Семёнова, по биологической оценке, созданных, левитационно – струйным методом, ультрадисперсных материалов. Одни из первых комплексные исследования по оценке биологических свойств созданных материалов проведены Натальей Николаевной Глущенко (ИЭПХФ РАН).
Вместе с тем, только в последние 5-10 лет исследования по созданию и использованию ультрадисперсных препаратов для животноводства получили дальнейшее развитие, что связано с появлением новых методов их синтеза
(Sarkar B., еt al, 2015). Перспективы ультрадисперсных препаратов металлов
– микроэлементов с диаметром около 100 нм определяются как меньшей
токсичностью (Zhang J. et al, 2005; Hao L. et al, 2014), так и более высокой
биодоступностью микроэлементов в сравнении с неорганическими
соединениями и органическими формами (Rohner F. et al, 2007); выраженным
продуктивным действием (Яушева Е.В., 2016); способностью корректировать
микроэкологический статус животных (Yausheva E., Sizova E., 2016;
Bouwmeester H., et al, 2017) и многое другое. Превосходство
ультрадисперсных препаратов микроэлементов над аналогами показана для
таких потенциально токсичных элементов как селен (Safdari-Rostamabad M.
et al, 2016; Skalickova S. еt al, 2017). Однако, в большинстве исследований по
проблеме, как правило, освещаются только отдельные свойства новых
веществ, отсутствует единый регламент подбора и апробации
ультрадисперсных частиц, наука не располагает комплексом знаний о биологических эффектах препаратов при различных способах их использования в животноводстве. В связи с чем, актуальными представляются следующие исследования.
Цель и задачи исследований. Целью исследований в соответствии Федеральной целевой программой «Приоритетные направления развития работ в области нанотехнологий и наноматериалов» и «Программой фундаментальных и приоритетных прикладных исследований по развитию Агропромышленного комплекса РФ на 2011-2015 годы» (госрегистрация: № 0120853615; №01200959205; №АААА-А16-116122310005-8; №114102740041) явилось изучение особенностей метаболизма и продуктивного действия, ультрадисперсных препаратов эссенциальных элементов на организм цыплят-бройлеров.
При этом решались следующие задачи:
-
Провести комплексную физико-химическую и биологическую аттестацию ультрадисперсных препаратов-микроэлементов на моделях Echerichia coli K12 TG1 и Stylonychia mytilus, в том числе в сравнении с минеральными и органическими их аналогами.
-
Дать сравнительную оценку ультрадисперсных препаратов – микроэлементов, их минеральных и органических форм по биодоступности, особенностям действия на рост и обмен веществ в организме цыплят-бройлеров.
-
Дать комплексную оценку действия на обмен веществ и продуктивность птицы внутримышечных инъекций и приёма «per os» препаратов ультрадисперсных частиц металлов-микроэлементов.
-
Провести таксономические исследования влияния ультрадисперсных препаратов – микроэлементов на микробиоценоз пищеварительного тракта птицы методом метагеномного секвенирования.
-
Изучить влияние ультрадисперсных препаратов отдельных микроэлементов и их сплавов на микроэлементный статус и особенности минерального обмена в организме цыплят-бройлеров.
-
Изучить морфологический и биохимический состав крови, отдельные характеристики антиоксидантного статуса и показатели естественной резистентности цыплят-бройлеров при скармливании ультрадисперсных препаратов микроэлементов.
-
Дать оценку морфо-функционального состояния органов-мишеней и мест инъекций ультрадисперсных препаратов – микроэлементов.
-
Определить экономическую эффективность использования ультрадисперсных препаратов в кормлении цыплят-бройлеров.
Научная новизна работы состоит в комплексном решении задач по биологической аттестации ультрадисперсных препаратов – микроэлементов на различных биологических моделях с последующим изучением их действия на обменные процессы, продуктивность, морфо-функциональные характеристики, элементный статус цыплят-бройлеров, в том числе в сравнении с препаратами аналогами.
Впервые установлены константы концентраций ультрадисперсных металлов-микроэлементов, определяющих «тушение» биолюминесценции, тесно связанные с отсутствием продуктивного действия металлов-микроэлементов на модели цыплят-бройлеров, что в совокупности с методикой оценки безопасности наночастиц (RU 2477485), позволило разработать новые решения по аттестации ультрадисперсных препаратов для использования в птицеводстве. В том числе через введение нового критерия для прогнозирования продуктивного действия ультрадисперсных металлов – индекса толерантности; определение его оптимальных значений, связанных с ростостимулирующими эффектами; обоснование причин расхождений в продуктивном действии УДЧ одних и тех же микроэлементов, полученных по разной технологии.
В эксперименте показана низкая информативность модели Stylonychia mytilus для биотестирования препаратов УДЧ металлов-микроэлементов.
Получены новые данные по морфо-функциональной характеристике мест внутримышечной инъекции лиозолей УДЧ металлов при многократных инъекциях. Дана общая биохимическая оценка метаболизма и элементного статуса организма цыплят-бройлеров при внутримышечном и пероральном введении УДЧ.
Впервые в ходе комплексных исследований показана наиболее низкая биотоксичность, высокая биодоступность микроэлементов и выраженное продуктивное действие УДЧ железа, меди, сплавов (FeCo, CuZn) в сравнении с минеральными и органическими аналогами.
Впервые методом T-RFLP изучен кластерный состав микрофлоры
кишечника птицы при поступлении с кормом УДЧ металлов-
микроэлементов, что позволило объяснить повышение переваримости питательных веществ рационов через изменение видового состава микробиоты.
Впервые показано, что использование в кормлении птицы УДЧ металлов в биотических дозах не сопровождается антагонизмом с другими элементами на этапе всасывания в пищеварительном тракте. Разработаны новые решения
по созданию новых препаратов металлов-антагонистов.
Впервые предложены способы снижения содержания кадмия в птицеводческой продукции через использование УДЧ меди (RU 2468595); предложены решения по подготовке лиозолей УДЧ металлов для наружного и внутреннего применения (RU 2610171) и оценки нанодисперсных форм (RU 2593366).
Предложены решения по созданию новых кормовых средств для сельскохозяйственной птицы, защищённые патентами РФ (RU 2577907, 2601812, 24050532, 2611715).
Теоретическая и практическая значимость работы. В работе разработана новая концепция подбора и апробации ультрадисперсных препаратов металлов-микроэлементов для использования в животноводстве, включающая положение о тестировании УДЧ на бактериальных моделях, определены величины апоптоза в органах мишенях и др. Теоретически обоснованы перспективы прогнозирования продуктивного действия УДЧ металлов-микроэлементов на основании данных о EC50 E. coli K12 TG1 и величине биотического уровня потребления эссенциального элемента.
В работе выявлены и теоретически обоснованы продуктивные эффекты отдельных препаратов УДЧ металлов-микроэлементов как результат изменения особенностей белкового обмена и снижения синтеза жира, оптимизации элементного статуса и коррекции микрофлоры кишечника птицы.
Теоретическая значимость работы состоит в разработке и апробации гипотезы об отсутствии антагонистических взаимодействий между микроэлементами при использовании в питании птицы УДЧ сплавов металлов-антагонистов.
На основании комплексных исследований производству предложены новые решения по оптимизации минерального питания цыплят-бройлеров через использование препаратов УДЧ металлов-микроэлементов. Внедрение разработки обеспечивает повышение рентабельности производства мяса птицы на 3 – 4 %.
В работе предложены решения по снижению норм минеральных веществ в рационе птицы через использование УДЧ металлов, что позволит создать предпосылки к снижению экологической нагрузки промышленных птицеводческих предприятий.
Методология и методы исследования. Для достижения поставленной
цели и решения задач по проблеме физико-химической и биологической
аттестации УДЧ использованы методы электронной микроскопии,
бактериальной люминесценции; по проблеме воздействия УДЧ на организм
цыплят-бройлеров использованы биохимические и физиологические методы
исследования; при изучении продуктивного действия, оценке экономической
эффективности использованы стандартные зоотехнические методы; качество
продукции подтверждено сертификатом соответствия №РОСС
RU.SQS.C00094, №00249. Результаты обработаны с применением
общепринятых методик при помощи программного пакета «Statistica 10.0».
Основные положения, выносимые на защиту:
- реализация теста бактериальной люминесценции позволяет оценить
биологическую активность ультрадисперсных металлов-микроэлементов с
последующим обоснованием перспектив их использования в птицеводстве;
- рекомендуемые формы и способы введения модифицированных
ультрадисперсных металлов-микроэлементов, обеспечат повышение
переваримости корма и продуктивности цыплят-бройлеров, что позволит
снизить затраты кормов и повысить рентабельность производства мяса
птицы;
- использование препаратов ультрадисперсных сплавов
микроэлементов-антагонистов (Fe-Co, Cu-Zn) в питании цыплят-бройлеров
позволит повысить продуктивность и экономическую эффективность
производства;
- инъекционное введение УДЧ железа с индексом толерантности выше
единицы формирует депо железа в миосимпластах мест инъекций,
длительность элиминации железа из депо, позволяет рассматривать
ультрадисперсные препараты железа в качестве источника микроэлемента;
- энтеральный путь, является наиболее перспективным способом
введения ультрадисперсных препаратов металлов-микроэлементов.
Степень достоверности и апробация работы. Научные положения,
выводы и предложения производству обоснованы и базируются на
аналитических и экспериментальных данных, степень достоверности
которых доказана путем статистической обработки с использованием
программного пакета Statistica 10.0. Выводы и предложения основаны на
научных исследованиях, проведенных с использованием современных
методов анализа и расчета. Основные материалы диссертационной работы
доложены на международных научно-практических конференциях: «Био
элементы» (Оренбург, 2007, 2016); «Проблемы экологии Южного Урала»
(Оренбург, 2007, 2011); «Инновационные технологии обеспечения
безопасности питания и окружающей среды» (Оренбург, 2007); «XXIII
Любищевские чтения» (Ульяновск, 2009); «Человек и лекарство» (Москва,
2009); «Trace Elements in Man and Animals» (Enshi, Hubel, China, 2011); «5th
Congress of the Festem: Bridging between New Advances and Public Health
Issues» (Avignon, 2013); «Trace elements between deficiency and toxicity: update
and perspectives» (Modena, 2015); «Эколого-физиологические проблемы
адаптации» (Сочи, 2015); «Selenium in Biology, Chemistry and Medicine»
(Guangzhou-Shenzhen-Meizhou, China, 2016); расширенных заседаниях
научных сотрудников и специалистов отдела кормления
сельскохозяйственных животных и технологии кормов им. профессора С. Г.
Леушина ФГБНУ «Всероссийский НИИ мясного скотоводства» и Института
биоэлементологии ФГБОУ ВО «Оренбургский государственный
университет» (Оренбург, 2017). Работа выполнена при финансовой поддержке: РФФИ: № 09-04-13596 «Исследования процессов создания и испытания новых препаратов эссенциальных микроэлементов на основе микро – и наночастиц металлов»; № 08-04-13544 «Оценка безопасности
введения наночастиц металлов-микроэлементов в организм животных»;
№11-04-97077 «Биологические эффекты, сопряженные с поступлением
наночастиц металлов-микроэлементов в организм животных»;
правительством Оренбургской области в сфере научной и научно-технической деятельности «Разработка новых препаратов корректоров метаболизма на основе наноматериалов» (Постановление № 411-п от 15.06.2016); РНФ № 14-36-00023.
Реализация результатов исследований. Результаты исследований внедрены на предприятиях Оренбургской области: птицефабрика ЗАО «Оренбургская», ЗАО «Птицесовхоз Родина», ПАО «Уральский бройлер» и в крестьянско-фермерских хозяйствах.
Публикации результатов исследований. По теме диссертации опубликовано 64 научных работы, в том числе 34 в изданиях, рекомендованных ВАК РФ для публикации основных результатов диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук, 17 из которых опубликованы в журналах баз Web of Science и Scopus. Новизна исследований защищена 8 патентами РФ на изобретения.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 344 страницах компьютерной верстки, состоит из введения, обзора литературы, главы с описанием материалов и методов исследований, глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, предложений производству. Содержит 77 таблиц, 61 рисунок и 14 приложений. Список использованной литературы включает 592 источника, в том числе 321 зарубежных авторов.
Перспективность дальнейших исследований по применению препаратов-микроэлементов на основе ультрадисперсных частиц
На протяжении многих лет препаратами выбора для коррекции минерального статуса в животноводстве являлись неорганические соединения металлов-микроэлементов (Беренштейн Ф.Я., 1966; Георгиевский В.И., 1979; Combs G.F., Scott M.L., 1979; Кальницкий Б.Д., 1985; Miller E.R., 1991; Галочкин В.А., 2001). Так, в рационе птицы дефицит цинка восполнялся нитратом цинка (Лисунова Л.И., 2005, 2008), меди – сернокислыми солями, кобальта – сульфатом, карбонатом или хлоридом кобальта, железа – (Хенниг А., 1976), йода - йодистым и йодноватокислым калием (Улитько В.Е., 2015), селена – селенитом натрия, сульфатом натрия (Wang Y.B., 2008)
Однако биодоступность химических элементов из минеральных солей низкая (Седых Л., 1975; Evans, 1980; Авцын А.П. , 1991; Кузнецов С.Г., 1991; Переслегина И., 1999; Шипилов В., 1999, Егоров И.А., 2004), т.к. эти соединения в желудочно-кишечном тракте образуют не только соединения с веществами, способствующими всасыванию данного микроэлемента (белками, аминокислотами), но и нерастворимые соединения (гидроокиси, фитаты), которые осаждаются на стенках кишечника или естественным путём удаляются из организма (Agget P.I., 1985; Ashmead H.D., 1995; Pallauf J., 1997; Егоров И., 2002; Егоров И., Селина Н., 2004; Егоров И., Папазян Т., 2007). Причём, помимо низкой биодоступности, минеральные соли подавляют в кишечнике патогенных микроорганизмов (Jacob M.E. et al., 2010). Введение медных и цинковых солей в рацион птицы предрасполагает к развитию устойчивости микрофлоры кишечника к традиционным антибиотикам (Yazdankhah S. et al., 2014).
Стоит сказать, что на практике птица нередко испытывает дефицит микроэлементов, прежде всего по причине низкой биологической доступности из разных неорганических солей (от 5 до 50%). Дальнейшее повышение нормы ввода солей вносимых премиксов ограничено их токсичностью. При этом важно учитывать и тот факт, что соли микроэлементов в составе кормосмесей часто ведут к разрушению витаминов в рационе и, в первую очередь, жирорастворимых (Головня Е., 2001; Ших Е. В., 2004; Лавникович А.А., 2015). Неусвоенные организмом птицы металлы выделяются с пометом и загрязняют почву и воду (Ричардс Д.Д., 2011; Егоров И., 2014).
Недостаточное поступление и усвоение микроэлементов в организме вызывает хронический комплексный элементоз со всеми неблагоприятными для животных последствиями (Горбачев В.В., 2002; Лисунова Л.И., 2005; Водолажченко С., 2010; Топурия Г.М., Жуков П.А, 2012).
В связи с этим, на смену минеральным источникам эссенциальных элементов приходят их аналоги с более высокой биодоступностью и продуктивным действием (Чарлтон П., Нолле Л., 2010; Околелова Т.М., 2012; Хворостова Т.Ю., 2012; Kralik Z., 2012; witkiewicz S., 2014; Галиев Д.М., 2015).
Традиционное использование неорганических минералов в кормлении птицы сегодня подлежит коренному пересмотру (Berta E., 2004; Tronina W., 2007; Dobrzaski Z., 2008; Грибанова Е.А., 2013; Кузнецова Е.А., 2013).
В связи с этим, в практику кормления вошли органические формы минеральных веществ, в том числе хелаты (Кадырова Р.Г., 2013; Темираев Р.Б., 2013; Upadhaya S.D., 2016; Подобед Л.И. и др., 2012; Paik I.K. et al., 1999; Ma W.Q. et al., 2012), которые представляют собой химические соединения микроэлементов с простыми белками, продуктами их деструкции и отдельными аминокислотами (Калимулин Ю.Н., 1987).
Предполагают, что белковые части или присоединенные аминокислоты экранируют минерал от реакционной способности и взаимодействия с другими соединениями в кишечнике. Например, хелат цинка защищен от химической активности и более подготовлен к всасыванию (поглощению) в кишечнике, чем его неорганическая форма. (Miles R. D. et al, 1998; Luo X. G. et al 2005). В органической форме элементы всасываются из кишечника в лимфу, не конкурируя между собой. В составе корма они не взаимодействуют с другими веществами, не образуют нерастворимые соединения, не разрушают витамины. Например, показано, что использование хелатных соединений различных элементов оказывает оптимальное стимулирующее влияние на морфофизиологические функции организма (в сравнении с неорганическими формами) и способствует повышению показателей жизнеспособности и продуктивности цыплят-бройлеров (Шацких Е.В., 2006, 2008; Vieira S.L., 2008; Дроздова Л.И., 2009; Котомцев В.В., 2009). Так, совместное использование неорганической и органической форм соединений селена в предстартовом рационе цыплят-бройлеров характеризуется повышением живой массы петушков, сохранности петушков-бройлеров (Шацких Е.В., 2009). Исследованиями других авторов также подтверждается, что использование органических форм минеральных веществ увеличивает продуктивность цыплят-бройлеров (Топорова Л., 2011; Яковлева И.Л., 2012; Zhao J., 2016; Abd-El-Samee D. L., 2013; Abdallah A.G., 2014; Carvalho L.S., 2015).
Хелатный комплекс марганца аскорбината повышает эффективность использования питательных веществ корма, возрастает живая масса молодняка птицы; сохранность поголовья увеличивается, снижаются затраты корма, повышается иммунный статус птицы, содержание иммуноглубинов в крови цыплят (Панина Н.В., Капустин Р.Ф., 2008). Применение комплексных соединений железа с рибофлавином и аминокислотами в кормлении цыплят оказывает положительное влияние на продуктивность, интенсивность метаболизма, использование питательных и минеральных веществ корма и качество мяса птицы (Кебец А.П., 2006).
Д. Пчельников и Т. Скрипкина (2008) исследовали биокоординационные соединения микроэлементов с этилендиаминдиянтарной кислотой (кормовая добавка гемовит-плюс). Была показана высокая эффективность ее применения в рационах кур-несушек. В результате увеличилась их продуктивность, снизились затраты корма на единицу продукции. И. Бойко (2009) были проведены исследования по оценке влияния марганца цитрата на обмен веществ и продуктивные качества цыплят-бройлеров кросса «ISAJV». В ходе эксперимента было установлено, что скармливание цыплятам марганца цитрата способствует более интенсивному обмену азотсодержащих соединений, повышает усвоение кальция и фосфора.
Было сделано заключение, что применение органической формы цинка в течение всего цикла выращивания цыплят сопровождалось повышением отношения съедобных частей тушки к несъедобным, ростом коэффициента биологической полноценности мяса (Рогозинникова И.В., 2010).
Исследования Т. Ao et al (2006, 2007, 2009) доказали лучшую усвояемость органического цинка по сравнению с его неорганической формой. При этом наилучшее усвоение цинка у цыплят-бройлеров наблюдалось из лизината и глицината, поскольку при использовании данных соединений не происходит накопления элемента в тканях, и он более эффективно используется организмом, чем сульфат цинка (Михальская В.М., 2013).
При включении в рацион цыплят бройлеров препаратов производных двухвалентных катионов железа, марганца, цинка, меди, кобальта и органических кислот (лимонной и яблочной), отмечалось увеличение в крови эритроцитов, общего белка, глобулинов в сыворотке крови, улучшалась продуктивность и снижалось количество используемого корма (Кочеткова Н.А., 2012).
Результаты лабораторных исследований по физико-химической и биологической оценке препаратов ультрадисперсных частиц металлов-микроэлементов
Формирование рационов для подопытной птицы проводилось с учетом рекомендаций ВНИТИП (Фисинин В.И. и др., 2009; Егоров И.А. и др., 2015;). Микроклимат в помещении соответствовал рекомендациям и требованиям ВНИТИП. В ходе экспериментов производилась оценка роста и развития цыплят. Контроль над ростом производился ежедневно, путем индивидуального взвешивания, с последующим расчетом среднесуточного прироста. Сохранность учитывали ежедневно по числу павших особей и суммировали в конце исследования. Поедаемость кормов учитывали ежедневно в каждой группе. Переваримость питательных веществ изучалась в ходе балансовых опытов, по методикам ВНИТИПа (Фисинин В.И. и др., 2010). Сбор, взвешивание помета и формирование средней пробы проводилось ежедневно в одно и тоже время. Формирование средней пробы включало отделение от помета пера, гомогенизацию и отбора в количестве 10 % от общей массы экскрементов. Фиксацию аммиака осуществляли 0,1 н раствором щавелевой кислоты (4 мл на 100 г помета). По завершению балансового опыта отбирали 10 % от общей массы и высушивали при температуре 60-70 0С и хранили в емкости с притертой крышкой. По данным ежесуточного учета массы помета и его состава рассчитывалась потеря веществ, за вычетом которых находилось усвоенное количество корма.
Перед убоем птицу не поили 4-6 часов и не кормили 12 часов. Взвешивание производилось до и после убоя, также взвешивали отдельные ткани и органы подопытной птицы. В процессе обработки тушек были сформированы средние пробы мякоти, костной ткани + ткани центральной нервной системы, кожи, внутренних органов и жира по каждой голове. Гомогенизированные образцы высушивались при температуре 60-70 0С и хранились в пробирках с притертой крышкой.
В ходе убоев были сформированы средние пробы мякоти тушки, костной ткани, пера, съедобных внутренних органов (сердце, мышечный желудок, легкие, почки, печень), желудочно-кишечного тракта, которые были использованы для определения химического и элементного состава тканей тела птиц.
Химический состав помета, кормов и тканей тела бройлеров определялся по стандартизированным методикам (ГОСТ 31640-2012, ГОСТ 32044.1.2012, ГОСТ 13496.15-97, ГОСТ 51479-99, ГОСТ 23042-86, ГОСТ 25011-81, ГОСТ Р 53642-2009). Элементный состав биосубстратов и комбикормов, который включал определение 25 химических элементов:Ca, Cu, Fe, Li, Mg, Mn, Ni, As, Cr, K, Na, P, Zn, I, V, Co, Se, Ti, Al, Be, Cd, Pb, Hg, Sn, Sr исследован методами атомно-эмиссионной спектрометрии и масс спектрометрии с индуктивно связанной плазмой (Optima 2000 V, «Perkin Elmer», США) и масс-спектрометрии (Elan 9000, «Perkin Elmer», США) в лаборатории АНО «Центра биотической медицины», Москва. Озоление биосубстратов проводили с использованием микроволновой системы разложения Multiwave-3000 («Anton Paar», Австрия).
Размер пула химического элемента в организме устанавливали суммированием массы элемента в отдельных органах и тканях.
Расчет биодоступности микроэлементов из различных источников производился из допущения, что коэффициент трансформации оцениваемого элемента (Fe, Cu, Co) из кормов основного рациона остается неизменным во всех опытных и контрольных группах. Расчет коэффициента трансформации элемента из кормов основного рациона производился на основе величин совокупного поступления элемента с кормами и размера прироста пула этого элемента в организме цыплят контрольной группы.
На основании определения количества химических элементов в корме и организме цыплят-бройлеров проведен расчет скорости накопления () химических элементов по формуле: = (Эк-Эн)/( W0,75))/Кс, (3) где Эк-Эн – содержание химического элемента в организме в конце и начале эксперимента, соответственно, мг/гол; Кс – количество суток эксперимента; W0 75 - средняя обменная масса цыплят за эксперимент рассчитывалась на основании результатов ежесуточного взвешивания, кг
Среди показателей мясной продуктивности определяли массу потрошенной тушки и убойный выход (Агеев В.Н., Квиткин Ю.П., Паньков П.Н., 1992).
При выполнении исследований был предложен новый оценочный критерий ультрадисперсных добавок - потенциальных препаратов -микроэлементов, представленный нами как индекс толерантности (Кт): Кт= (4) где: ЕС50 - концентрации препарата, вызывающие 50 %-ное тушение свечения биосенсора (E.coli К12 TG1с клонированными ІихСОАВЕ-генами P.leiongnathi 54D10) по сравнению с контролем, М;
С - биотический уровень потребления, ммоль/кг W 75сутки. В свою очередь, величина биотического уровня потребления рассчитывалась как отношение рекомендованного ВНИТИПом оптимального содержания химического элемента в рационе (моль/кг корма) к обменной массе птицы (W075) за единицу времени (сут.).
Морфологические показатели крови определяли с помощью автоматического гематологического анализатора URTT-2900 Vet Plus, (UPJT Medial Electronic Co., Китай). Среди морфологических показателей крови определяли: эритроциты, концентрацию гемоглобина, среднее содержание гемоглобина в эритроците (МСН), тромбоциты, лейкоциты, лимфоциты, моноциты, гранулоциты, гематокрит.
Пилотные исследования по оценке различных способов введения ультрадисперсных частиц меди в организм цыплят-бройлеров
С целью изучения влияния препаратов – микроэлементов минерального, органического происхождения, ультрадисперсных частиц на рост, продуктивность, минеральный состав тела и микробиоценоз кишечника цыплят – бройлеров было сформировано семь групп (шесть опытных групп и одна контрольная). На протяжении всего периода выращивания (42 дня) начиная с семисуточного возраста в рационе опытных групп минеральные соли изучаемых элементов заменили на УДЧ и органические формы. Контрольная птица получала с кормом премикс по рекомендации ВНИТИП, (2009), в котором в качестве источника железа и меди использованы железный и медный купоросы, цыплятам I опытной FeSO47H2O заменяли на УДЧ FeI , II опытной на Fe4(P2O7)3 , III на УДЧ FeII.. Методикой исследований предполагалось кормление цыплят IV опытной группы контрольным рационом с заменой CuSO45H2O на УДЧ CuI, в рационе V опытной CuSO45H2O заменяли на аспарагинат Cu, VI на УДЧ CuII.
На протяжении исследований цыплята контрольной и опытных групп содержались в одинаковых условиях. Кормление бройлеров осуществлялось комбикормами, разработанными по рекомендациям ВНИТИПа (Фисинин В.И. и др., 2009). Формирование стартового комбикорма осуществлялось на пшенично – кукурузной основе с содержанием обменной энергии 12,61 – 12,99 Дж/кг (таблицы 12, 13). Состав комбикорма: усв. метионина + пшеница 425 цистина, % 0,58 кукуруза 220 усв. треонина, % 0,83 шрот соевый 150 усв. триптофана, % 0,18 шрот подсолнечный 100 линолевая кислота, % 3,99 масло подсолнечное 50 хлора, % 0,27 премикс 20 кальция, % 1,02 соль поваренная 3 фосфора общего, % 0,7 монокальций фосфат 10 фосфора усвояемого, % 0,39 известняковая мука 1 натрия, % 0,19 DL-метионин 98,5 % 1,2 железа, мг 47,14 L-треонин 98% 3,5 меди, мг 8,42 монохлоргидрат лизина 98 % 2,3 цинка, мг 110,42 сода пищевая 1 марганца, мг 152,86 мел кормовой 13 кобальта, мг 1,36 В комбикорме содержится: йода, мг 0,88 обменной энергии, МДж 12,99 селена, мг 0,2 сухого вещества, % 82,6 витаминов: сырого протеина, % 19 А, тыс МЕ 13,58 сырого жира, % 7 Д, тыс МЕ 4,18 сырая клетчатка, % 4,22 Е, мг 95 сырая зола, % 5,46 В1, мг 3,16 БЭВ, % 53,1 В2, мг 6,6 лизина, % 1 В3, мг 13,5 аргинина, % 1,09 В4, мг 579 метионина, % 0,45 В5, мг 19 метионина+цистина, % 0,75 В6, мг ЗД треонина, % 0,98 В12, мг 0,025 триптофана, % 0,23 валина, % 0,77 усв. лизина, % 0,87 усв. метионина, % 0,39 При оценке потребления корма установлено, что максимальная поедаемость отмечена в контрольной группе (таблица 14). Низкая поедаемость корма была характерна для цыплят – бройлеров I, II, IV, V опытных групп. Высокие цифры разницы с контролем обеспечило поедание корма с УДЧ FeI, УДЧ СuI, внесение аспарагинатов увеличило поедаемость, и разница с контролем сократилась. Таблица 14 – Поедаемость кормов цыплятами – бройлерами, г
Показатель Группа контрольная I опытная II опытная III опытная IV опытная V опытная VI опытная Стартовый комбикорм 1705 1663 1693 1676 1609 1677 1709 Ростовой комбикорм 2332 1987 2047 2303 1917 2223 2320 Всего за эксперимент 4037 3650 3740 4089 3526 3900 4029 Скармливание УДЧ FeII и УДЧ СuII приближало цифры поедаемости к контрольному значению с минимальным его превышение в IV опытной группе.
Анализ динамики живой массы за эксперимент показал отсутствие продуктивного эффекта (V опытная группа) или наличие токсического эффекта в IV опытной группе, где живая масса к концу периода выращивания была минимальной среди всех опытных групп (таблица 15).
Подтверждением полученных результатов является анализ величин индекса толерантности (Кт), который превышает единицу при отсутствии токсичного эффекта. Так, выявленное нами отсутствие продуктивного действия для УДЧ FeI подтверждается значениями Кт меньшими единицы -0,96, в то время как Кт для УДЧ FeII больше единице (4,8). Сходную динамику значения Кт демонстрировали ультрадисперсные частицы меди. Таким образом, продуктивные и биологические эффекты УДЧ препаратов – микроэлементов зависят от их физико-химических характеристик и технологии производства.
Исследование микробного разнообразия слепой кишки цыплят-бройлеров показало, что 76 % от общего числа микроорганизмов микробиоценоза являются представителями таксона Firmicutes, 21 % таксона Bacteroidetes, и менее 3 % являются представителями других таксонов (рисунок 12).
Доминирующим классом являлся Clostridia, составляющий 55 % от общего числа бактерий и представленный в основном семействами Ruminococcaceae (32 % от общего числа) и Lachnospiraceae (20 % от общего числа). Среди более малочисленных классов были идентифицированы Bacteroidia (21 % от общего числа) и Bacilli (18 % от общего числа), представленные семействами Lactobacillaceae (17 % от общего числа), Rikenellaceae (11 % от общего числа), Bacteroidaceae (6 % от общего числа). Анализ результатов секвенирования показал, что видовой состав микрофлоры представлен микроорганизмами р. Anaerotruncus (18 % от общего числа), р. Blautia (11 % от общего числа), р. Lactobacillus (17 % от общего числа), р. Alistipes (11 % от общего числа), р. Bacteroides (6 % от общего числа) и др. Количество не классифицированного материала на уровне рода составило 3 %.
Ведение в рацион УДЧ FeI не приводило к существенным изменениям в соотношении численности грамотрицательных микроорганизмов и грамположительной микрофлоры в сравнении с контролем в слепой кишке цыплят-бройлеров (приложение 1, рисунок 13).
Наблюдалось увеличение представителей классов Clostridia (на 4 % от контроля) и Bacteroidia (на 7 % от контроля), и снижение численности микроорганизмов относящихся к таксонам Bacilli (на 10 % от контроля), что выражалось в изменении количества бактерий семейств Lachnospiraceae , Lactobacillaceae, Bacteroidaceae, Rikenellaceae и др. Изменения видового состава были связаны с со снижением численности бактерий р. Anaerotruncus, р. Lactobacillus и повышением количества микроорганизмов р. Alistipes, р. Bacteroides и др. в сравнении с контролем.
В отличие от УДЧ FeI введение Fe4(P2O7)3 в рацион цыплят-бройлеров сопровождалось более значимым изменением соотношения грамположительной и грамотрицательной микрофлоры слепого отростка кишечника. Отмечалось увеличение числа микроорганизмов филума Bacteroidetes на 15 % от контроля, в частности класса Bacteroidia (на 7 % от контроля), и снижение численности бактерий таксонов Firmicutes на 16 % соответственно, что выражалось в уменьшении представителей классов Clostridia (на 8 % от контроля) и Bacilli (на 7 % от контроля). Исследование видового состава в сравнении с контролем показало рост численности бактерий р. Alistipes на 10 %, р. Bacteroides на 9 %, и снижение числа бактерий р. Anaerotruncus на 9 %, р. Lactobacillus на 6 % и др. (приложение 1, рисунок 14).
Оценка влияния ультрадисперсных частиц сплава Cu-Zn на микроструктуру органов-мишений (печень, фабрициева сумка, селезёнка, тимус) цыплят-бройлеров
В эксперименте инъекции УДЧ FeII сопровождались значительным повышением концентрации железа в сыворотке крови уже в первые сутки на 22,2%, и на 12,2% на седьмые сутки после введения (приложение 3).
Содержание ферритина при инъекции ультрадисперсных частиц в первые сутки увеличилось до 27,6±0,004 мкг/л, на седьмые сутки до 31,8±0,001 мкг/л, что достоверно превышало значение контроля.
В крови содержание моноцитов достоверно превышало уровень контроля только через сутки после инъекции. Таким образом, в ходе эксперимента были обнаружены изменения в обмене железа в организме вызванные внутримышечными инъекциями ультрадисперсных частиц. Длительность элиминации железа из депо, созданного внутримышечными инъекциями, позволяет рассматривать препараты на основе ультрадисперсных частиц железа в качестве источника микроэлемента при лечении элементозов.
В результате еженедельных внутримышечных инъекциях (всего 7) препаратов ультрадисперсных частиц железа формируется депо железа в миосимпластах мест инъекций. Количество мышечных волокон, с положительной окраской по Перлсу возрастает на седьмые сутки с 0,4 % после 1 инъекции до 8,1% после 7 инъекций. Однако концентрация подавляющего числа химических элементов и железа в совокупности скелетной мускулатуры (без учёта места инъекции) достоверно снижается (Fe - на первые сутки после первой инъекции на 54,8%) с последующим повышением до уровня контроля после шестой и седьмой инъекций. Среди изучаемых органов (печень, почки, селезёнка) выявлена экспрессия антигена каспазы – 3 только в селезенке с прямой зависимостью уровня экспрессии и количества инъекций (2,1±0,1 после первой инъекции до 2,9±0,06 после 7 инъекции). Выявлена активизация работы клеток Купфера после пятой инъекции, подтверждаемая очаговой пролиферацией клеток внутри отдельных долек.
Таким образом, морфологический анализ органов в опытных группах при многократном внутримышечном введении ультрадисперсных частиц железа в дозе 2 мг/кг живой массы позволил сделать следующие выводы: 1. Часть введенного внутримышечно железа используется в месте введения и идет на образование миоглобина, а так же захватывается макрофагами эндомизия. Интенсивность реакции выявляющей железо в месте введения по мере увеличения количества инъекций умеренно увеличивается. 2. В печени при введении используемой дозы ультрадисперсных частиц железа и разной кратности введения значимых структурных изменений не обнаружено, только единичные клетки Купфера и гепатоциты в ходе исследования дают положительную реакцию на выявление в них железа, однако выявленная после пятой иньекции ультрадисперсных частиц железа очаговая пролиферация клеток Купфера внутри отдельных долек свидетельствует об активизации работы этих клеток. 3. В почках железо выявляется в отдельных почечных тельцах и отдельных проксимальных канальцах уже на первые сутки после однократного введения. Кратность введения не сказывается на структуре органа. Хотя после многократных введений железо и обнаруживается в отдельных проксимальных канальцах, структурно-функциональной реорганизации в органе не наблюдается. 4. Однократное введение ультрадисперсных частиц железа не сказывается на структуре одного из основных депо железа – селезенке вне зависимости от срока исследования. После последующих инъекций, особенно после третьей инъекции, в селезенке по сравнению с контролем увеличивается на условной единице площади число макрофагов, содержащих железо и число гигантских макрофагов, дающих интенсивную реакцию Перлса. Это возможно связано с активным поступлением ультрадисперсных частиц железа и депонированием железа в макрофагах органа. Уменьшение клеток, за счет гибели путем апоптоза, дающих положительную реакцию Перлса, на условной единице площади красной пульпы после шести- и семикратного введения ультрадисперсных частиц железа свидетельствует о развертывании компенсатоно-приспособительных реакций направленных на предотвращения гемосидероза в органе.
Таким образом, ультрадисперсные частицы железа не обладают модулирующими апоптоз свойствами.
С учетом положительных результатов от использования в составе комбикормов для цыплят бройлеров ультрадисперсных препаратов, в условиях ЗАО «Птицефабрика Оренбургская» на 600 цыплятах-бройлерах кросса «Смена 8» проведен научно-хозяйственный эксперимент, в ходе которого оценены продуктивные качества бройлеров и экономическая эффективность производства мяса птицы (таблица 31).
В процессе производственной проверки была проведена оценка эффективности замены FeSO47H2O на УДЧ FeII.в дозе 1 мг/кг живой массы в день (опытный вариант). Контрольная группа (базовый вариант) получала рацион, сформированный по нормам, рекомендуемым ВНИТИП (2009).
Так, расход корма в базовом варианте не превышало 3,2 кг на голову, сохранность поголовья увеличилась с 96,7 до 97 %, что повлияло на увеличение валового прироста в опытном варианте до 517,3 кг, что на 26,3 кг, или 5,3% больше, чем в базовом варианте.
Комплекс факторов, выражающийся в снижении затрат на выращивание, увеличения живой массы, и как следствие большим выходом продукции при использовании альтернативных источников микроэлементов в рационе цыплят бройлеров, что в итоге, привело к увеличению рентабельности производства мяса птицы до 14,7 %.