Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы .10
1.1. Состав и роль микробиоты желудочно-кишечного тракта птицы 10
1.2. Влияние компонентов комбикормов биологически-активных веществ на состояние миробиоты кишечника птицы 26
2. Материал и методика исследований 41
2.1. Методика проведения научно-хозяйственных опытов 41
2.2. Методика T-RFLP- анализа микрофлоры желудочно-кишечного тракта птицы 50
2.3. Методики NGS- (высокопроизводительное секвенирование) и количественного ПЦР-анализа микрофлоры желудочно-кишечного тракта птицы 58
3. Результаты исследований 60
3.1. Продуктивность, переваримость и использование питательных веществ корма бройлерами, состояние микрофлоры желудочно-кишечного тракта при использовании в рационе кормов, содержащих кукурузу и пшеницу (опыт 1) 60
3.2. Продуктивность, переваримость и использование питательных веществ корма бройлерами, состояние микрофлоры желудочно-кишечного тракта при использовании в рационе кормов, содержащих кукурузу и ячмень (опыт 2) 70
3.3. Продуктивность, переваримость и использование питательных веществ корма бройлерами, состояние микрофлоры желудочно-кишечного тракта при использовании в рационе кормов, содержащих соевый и подсолнечный шрота (опыт 3) 82
3.4. Экологические индексы биоразнообразия .95
3.5. Результаты корреляционного анализа 99
3.6. Производственная проверка результатов исследования .106
Заключение 109
Предложения производству 111
Перспективы дальнейшей разработки темы .112
Список сокращений .113
Список литературы .114
Приложение 130
- Состав и роль микробиоты желудочно-кишечного тракта птицы
- Методика T-RFLP- анализа микрофлоры желудочно-кишечного тракта птицы
- Продуктивность, переваримость и использование питательных веществ корма бройлерами, состояние микрофлоры желудочно-кишечного тракта при использовании в рационе кормов, содержащих кукурузу и ячмень (опыт 2)
- Результаты корреляционного анализа
Введение к работе
Актуальность темы. Современное птицеводство отличается высокой
индустриализацией отрасли, использованием закрытых помещений с регулируемым микроклиматом, автоматизацией технологических процессов. Благодаря успехам генетики и селекции, скорость анаболических процессов у современных кроссов птицы становится всё выше, и лимитирующим фактором развития отрасли оказывается способность пищеварительной системы птицы с соответствующей скоростью вовлекать питательные вещества, сосредоточенные в комбикорме, в биосинтетические процессы внутри организма. Основные затраты (70-80%) современной птицефабрики составляют затраты на корма, поэтому биологические особенности сельскохозяйственной птицы, как конвертора растительных полимеров, требуют функциональной поддержки пищеварительной системы, особенно – коррекции микрофлоры желудочно-кишечного тракта.
Поскольку макроорганизм и его микрофлора – единая экологическая система, находящаяся в состоянии динамического равновесия, а микроорганизмы участвуют в метаболических процессах, состав его микробиома относительно постоянен. Между тем, на микробиоту, колонизирующую пищеварительный тракт птицы, способны оказывать влияние ряд факторов: возраст, состав кормов, антибиотики и другие вещества (Biggs, P. et al., 2007; Chichlowski, M., McBride, B.W., 2007; Stanley, D. et al., 2014). В связи с этим, актуальным является вопрос изучения влияния различной структуры комбикормов на качественный и количественный состав микробиоты кишечника птицы.
Уникальные возможности перед исследователем, изучающим состав микробиома кишечника птицы, открывают современные молекулярно-генетические методы, которые продемонстрировали, что в нем обнаруживаются представители до 140 родов бактерий, из которых только 10% идентифицированы по гену 16S рРНК, а остальные принадлежат к новым видам или даже новым родам (Amit-Romach, E. et al., 2004; Apajalahti, J. et al., 2004, Manukyan, V.A., et al., 2014).
Степень разработанности темы исследований. Изучению переваримости и использования питательных веществ комбикормов различной структуры посвящены многолетние исследования специалистов птицеводов (Фисинин В.И. и др., 2009, 2013, 2016; Егоров И.А. и др., 2010, 2017; Ленкова Т.Н. и др. 2013, 2015).
Большинство сведений о микрофлоре, населяющей кишечник птицы, получено с использованием классических методов микробиологии (Грозина, А.А., 2014).
Однако данные о состоянии микробиоты кишечника бройлеров на фоне изменения структуры комбикормов немногочисленны и носят разрозненный характер. Поэтому выполненная работа направлена на восполнение пробелов по оценке действия изменений в структуре комбикормов на микрофлору кишечника бройлеров.
Цель и задачи исследований. Целью диссертационной работы являлось изучение состава микрофлоры желудочно-кишечного тракта цыплят-бройлеров на фоне применения комбикормов различной структуры и питательности. Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:
– изучить основные зоотехнические показатели цыплят-бройлеров на фоне применения комбикормов различной структуры;
– определить переваримость и использование питательных веществ комбикорма организмом цыплят-бройлеров;
– исследовать состояние микробиоты кишечника цыплят-бройлеров на фоне применения комбикормов различного состава и питательности с использованием различных молекулярно-генетических подходов (T-RFLP-анализ, NGS, ПЦР в реальном времени);
– определить экономическую эффективность использования кормовой добавки Целлобактерин-Т в рационах цыплят-бройлеров для нормализации микрофлоры кишечника и повышения переваримости компонентов комбикормов.
Научная новизна работы. Впервые проведен комплексный анализ
состояния микробиоценозов кишечника цыплят-бройлеров с применением различных молекулярно-генетических подходов на фоне изменений в структуре комбикормов. Определены структурные изменения в микробиоте с применением экологических подходов на основе индексов: показатель доминирования Симпсона, показатель сходства по Серенсену, показатели видового биоразнообразия (по Маргалефу и Менхинику), индекс выровненности по Пиелу, Шенноновский показатель биоразнообразия. Материалы исследований вошли в разработку,
удостоенную Премии Правительства Российской Федерации в области науки и техники за 2017 год.
Теоретическая и практическая значимость работы. Проведенные
исследования по изучению микрофлоры кишечника бройлеров на фоне
комбикормов различной структуры состоят в расширении и углублении знаний об
обмене веществ у птицы, использовании ею питательных веществ кормов.
Установлена связь структуры микробиоценозов с физиологическими особенностями
пищеварения и зоотехническими показателями, что позволяет разработать способы
регулирования микробиологических процессов в желудочно-кишечном тракте,
направленные на повышение эффективности использования корма и
продуктивности бройлеров.
На основании исследований и производственных проверок установлена
целесообразность использования кормовой добавки Целлобактерин-Т с
ферментативной и пробиотической активностями для повышения переваримости некрахмалистых полисахаридов, повышения усвояемости компонентов комбикорма и нормализации микрофлоры кишечника при изменении структуры комбикормов.
Материалы исследований были использованы при разработке методических рекомендаций «Руководство по использованию биопрепаратов и кормовых добавок для обеспечения здоровья и повышения продуктивности бройлеров (Сергиев Посад, ГНУ ВНИТИП, 2013), «Методика проведения научных и производственных исследований по кормлению сельскохозяйственной птицы. Молекулярно-генетические методы определения микрофлоры кишечника» (Сергиев Посад, ГНУ ВНИТИП, 2013), а также методического руководства «Молекулярно-генетические методы определения микрофлоры кишечника и установление нормы ее содержания в желудочно-кишечном тракте цыплят-бройлеров» (Сергиев Посад, ФГБНУ ВНИТИП, 2015), «Наставления по использованию нетрадиционных кормов в рационах птицы» (Сергиев Посад, ФГБНУ ВНИТИП, 2016).
Методология и методы исследований. Объектом исследования служили цыплята кросса «Cobb 500» с суточного до 36-суточного возраста. Исследования, представленные в диссертации, проводились в соответствии с методологией, принятой при изучении вопросов питания, обмена веществ и здоровья сельскохозяйственной птицы (Сергиев Посад, ГНУ ВНИТИП, 2013).
В ходе выполнения работы использовали общие методы научного познания:
анализ, сравнение, обобщение; экспериментальные методы: наблюдение,
сопоставление; специальные методы: зоотехнические, физиологические,
биохимические, экономические. Полученные экспериментальные данные
обрабатывали методом вариационной статистики, руководствуясь методическими указаниями (Сергиев Посад, ГНУ ВНИТИП, 2013), на персональном компьютере с использованием программного обеспечения Micrsoft Excel.
Положения, выносимые на защиту:
– состав и структура микробиоты кишечника у цыплят-бройлеров на фоне
применения комбикормов различной структуры;
– зоотехнические и физиологические показатели у цыплят-бройлеров при
изменении структуры и питательности комбикорма; – результаты поиска взаимосвязей между микрофлорой кишечника и основными
зоотехническими и физиологическими показателями бройлеров; – экономическая эффективность использования кормовой добавки Целлобактерин-Т на фоне комбикорма с высоким уровнем некрахмалистых полисахаридов.
Степень достоверности и апробация результатов. Исследования выполнены на высокопродуктивном кроссе бройлеров «Cobb 500» с использованием современных методик сбора и обработки информации; биохимические исследования выполнены на сертифицируемом оборудовании в Испытательном центре ФНЦ «ВНИТИП» РАН, молекулярно-генетические исследования выполнены в лаборатории ООО «БИОТРОФ». Статистическая обработка полученных экспериментальных данных, их производственная проверка подтверждают обоснованность и достоверность основных выводов и предложений производству, сформулированных в диссертации.
Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на:
семинарах по повышению квалификации специалистов птицеводческих
предприятий (Сергиев Посад, 2013-2017г.г.), XVIII международной конференции Российского отделения Всемирной научной ассоциации по птицеводству «Инновационное обеспечение яичного и мясного птицеводства России» (19-22 мая 2015 года, г. Сергиев Посад), XXV World’s Poultry Congress (05-09 сентября 2016 года, Пекин, Китай), научно-практической (очно-заочной) конференции с
международным участием «Современные тенденции научного обеспечения в развитии АПК: фундаментальные и прикладные исследования» (26 октября 2017 года, г. Омск).
Публикации результатов исследований. По материалам диссертации опубликовано 15 научных работ, в том числе в журналах, рекомендованных ВАК РФ – 7. Все публикации выполнены в рамках гранта российского научного фонда по научному проекту «Современные представления о микрофлоре кишечника птицы при различных рационах питания: молекулярно-генетические подходы» № 14-16-00140.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 133 страницах машинописного текста, включает 26 таблиц, 13 рисунков, состоит из введения, обзора литературы, материала и методов исследований, результатов собственных исследований и их обсуждения, выводов, предложений производству, списка литературы, включающего 143 источника, в том числе 104 на иностранных языках.
Состав и роль микробиоты желудочно-кишечного тракта птицы
Современное птицеводство характеризуется высоким уровнем индустриализации, что подразумевает высокую концентрацию поголовья на сравнительно небольших производственных площадях, использование безоконных птичников с регулируемым микроклиматом, автоматизацию технологических процессов и т.д. (Фисинин В.И, 2009). При этом основные производственные затраты (68-72%) в мясном птицеводстве приходятся на корма (Aggrey S.E. et al., 2010). Благодаря успехам генетической селекции птицы, скорость метаболических процессов у современных мясных кроссов становится все выше, и лимитирующим фактором развития птицеводства оказывается способность пищеварительной системы птицы обеспечить высокий уровень и физиологическую эффективность метаболизации питательных веществ рационов. За последние 50 лет в мире достигнут значительный прогресс по скорости роста бройлеров и эффективности использования ими кормов (Havenstein G.B. et al., 2003, Панин И.Г. и др., 2011), причем этот генетический прогресс привел к изменениям в физиологии питания современной мясной птицы и составе микрофлоры ее желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) (Lumpkins B.S., et al., 2010, Подобед Л.И. и др., 2017). Поэтому для реализации своего генетического потенциала продуктивности она требует адекватной функциональной поддержки пищеварительного тракта и, в частности, регуляции состава его микрофлоры.
Известно, что состав кормов оказывает непосредственное влияние на качественные и количественные характеристики микробного сообщества желу-дочно-кишечного тракта. Несбалансированное кормление бройлеров приводит к нежелательным изменениям микробиоценоза, что является причиной снижения продуктивности и возникновения ряда заболеваний вследствие нарушения процессов пищеварения (Панин И.Г. и др., 2011). В связи с этим, на протяжении последних десятилетий изучение роли микроорганизмов желудочно-кишечного тракта цыплят-бройлеров в пищеварении и обмене веществ вызывает повышенный интерес как ученых, так и практиков-птицеводов, поскольку результаты этих исследований способствуют организации более рационального и полноценного кормления и других мероприятий, необходимых для повышения продуктивности и улучшения состояния здоровья птицы (Ленкова Т.Н. и др. 2013, 2015, Манукян В.А., 2015, 2016).
Некоторые сведения о составе и роли микрофлоры желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) сельскохозяйственных птиц были получены с помощью классических методов микробиологии (Тимошко М.А., 1990, Engberg R.M. et al., 2000, Тараканов Б.В., 2006).
Одним из наиболее перспективных на сегодняшний день является Т-RFLP-анализ (Terminal restriction fragment length polymorphism) – молекулярно-генетический метод, основанный на анализе полиморфизма длин ам-плифицированных рестрикционных фрагментов ДНК микроорганизмов. Он предназначен для определения количества, относительной численности и таксономической принадлежности всех бактерий микробной экосистемы. Это дает возможность широкого и глубокого сравнительного изучения микробиологических сообществ в их развитии и изменении.
В России метод T-RFLP в связи с высокой стоимостью оборудования для анализа, а также отсутствием квалифицированных кадров используется в основном лишь для анализа почвы и кала человека.
В связи с этим сотрудниками лаборатории молекулярно-генетических исследований научно-производственной компании «БИОТРОФ» впервые в России на основе анализа зарубежных исследований методика Т-RFLP была модифицирована для изучения микрофлоры желудочно-кишечного тракта сельскохозяйственных птиц (Егоров И.А. и др., 2010, Егорова Т.А. и др. 2016). Известно, что в просвете кишечника птицы, на всём его протяжении от ротовой полости до края клоаки, обитает многочисленное разнотипное сообщество, состоящее из бактерий, грибковых, одноклеточных и вирусных микроорганизмов.
Считается, что количество бактериальных клеток ЖКТ превышает количество клеток самого организма птицы в пропорции, примерно, 10:1.
Последние исследования кишечника позволили сделать предположение, что желудочно-кишечный тракт птицы (на примере бройлеров) содержит около 640 разновидностей бактериальных микроорганизмов. Численность и разнообразие кишечной микрофлоры варьируют в разных отделах кишечника, и очевидно, что отделы, имеющие менее благоприятные условия (желудок) или более быстрое прохождение содержимого кишечника (двенадцатиперстная кишка), имеют меньшее число бактерий (Фисинин В.И. и др, 2016).
Принято считать, что развитие микрофлоры ЖКТ цыплёнка начинается в момент его вывода. Это происходит благодаря поступлению бактериальных микроорганизмов в пищеварительную трубку из окружающего воздуха, корма и от людей, работающих с цыплятами после вывода.
Зоб птицы быстро колонизируется бактериальными организмами в течение первых 24 часов после вывода цыплят. Кроме того, за этот период микроорганизмы эпифитной микрофлоры из ротового отверстия продвигаются по всему желудочно-кишечному тракту и достигают слепых отростков толстого кишечника. Это возможно только за счёт того, что в желудке суточного цыплёнка ещё нет характерного и достаточного кислотного барьера, а активность пепсина в желудке, способного затормозить развитие микрофлоры, ещё очень низка.
Через три дня после вылупления цыплёнка число бактериальных микроорганизмов в тонком и толстом кишечнике увеличивается примерно в 10 раз. К 2-х недельному возрасту микрофлора тонкого кишечника полностью стабилизируется по видовому и количественному составу, а к 30 суткам жизни заканчивает формирование микрофлора слепых отростков. Естественно, что сроки и характер формирования биоценоза ЖКТ птицы существенно меняется в зависимости от фона микроорганизмов воздуха и оборудования птичника, где содержатся цыплята. Ещё больший эффект на формирование микрофлоры ЖКТ оказывают: использование антибиотиков, про-биотиков, подкислителей, состав кормового рациона и микробиологические характеристики питьевой воды (Руководство…: Сергиев Посад, 2013). По своему влиянию на организм птицы всю микрофлору желудочно-кишечного тракта можно разделить на нормальную, условно-патогенную и патогенную (Современные представления о микрофлоре…, 2017).
Нормальная микрофлора (симбионтная) помогает пищеварительной системе птицы переваривать питательные вещества корма в пристеночной области кишечника и служит барьером от негативного влияния патогенной флоры.
Условно-патогенная флора в клинически здоровом организме со стабильным ценозом работает так же, как и нормальная. Однако, при нарушении установившегося сообщества флоры и на фоне значительной гибели микроорганизмов первой группы, условно-патогенная флора (например, кишечная палочка) начинает превалировать над нормальной и быстро приобретает свойства патогенной.
Патогенная микрофлора является главной причиной желудочно-кишечных расстройств. При попадании в организм на фоне ослабленной группы нормальной микрофлоры, она начинает превалировать над последней, вызывая срыв пищеварения, образование большого количества непереваренных остатков. Её токсины разрушают всасывающую поверхность кишечника и в значительном количестве всасываются в кровь, вызывая острые отравления.
У птицы в любом её клиническом состоянии в просвете пищеварительного канала всегда присутствуют все три указанные группы микроорганизмов. Однако у клинически здоровой птицы нормальная микрофлора занимает главенствующее положение по количеству и активности, условно-патогенная – проявляет весьма умеренную активность, а патогенная – присутствует только в малых количествах (Современные представления о микрофлоре…, 2017).
При любых кормовых нарушениях: частой и резкой смене состава рациона, попадании в комбикорм компонентов с высокой бакобсеменённостью, частиц помёта, не свойственных птице кормовых компонентов, а также при массовом поступлении с воздухом, кормом и водой болезнетворного начала состав и соотношение отдельных групп микроорганизмов существенно меняется.
Кроме классификации микроорганизмов по их влиянию на организм хозяина важно учитывать их дифференциацию по дислокации и поведению в пищеварительном канале. Согласно современным представлениям все микроорганизмы делятся на 2 группы – резидентную (облигатную) микрофлору и транзитную (факультативную) (Современные представления о микрофлоре…, 2017).
Методика T-RFLP- анализа микрофлоры желудочно-кишечного тракта птицы
Большинство сведений о микрофлоре, населяющей кишечник птицы, получено с использованием классических методов микробиологии, согласно которым основу микробного сообщества кишечника птицы составляют бифи-добактерии, стрептококки, лактобактерии, лактат-ферментирующие бактерии, эубактерии, бактероиды и энтеробактерии (Тимошко М.А., 1990; Barnes E.M. et al, 1979).
Уникальные возможности перед исследователем, изучающим состав микробиома кишечника птицы, открывают современные молекулярно-генети 51 ческие методы, которые уже продемонстрировали, что в кишечнике птицы обнаруживаются представители до 140 родов бактерий, из которых только 10% идентифицированы по гену 16S рРНК, а остальные принадлежат к новым видам или даже новым родам (Amit-Romach E. et al., 2004; Apajalahti J. et al., 2004).
Одним из наиболее перспективных на сегодняшний день является T-RFLP – анализ (Terminal restriction fragment length polymorphism) – молекулярно – генетический метод, основанный на анализе полиморфизма длин ам-плифицированных рестрикционных фрагментов гена 16S рРНК микроорганизмов. Он предназначен для определения количества, относительной численности и таксонометрической принадлежности всех бактерий микробной экосистемы. Это дает возможность широкого и глубокого изучения микробиологических сообществ в их развитии и изменении.
В связи с этим сотрудниками лаборатории молекулярно-генетических исследований ООО «БИОТРОФ» в 2008 году впервые в России на основе анализа зарубежных исследований (Torok, V.A. et al., 2008) и отечественных данных (Ильина и др., 2015) методика T-RFLP была модифицирована для изучения микрофлоры желудочно-кишечного тракта сельскохозяйственных птиц. T-RFLP – анализ микрофлоры кишечника птицы включает следующие стадии (рис.1):
1. Выделение общей (тотальной) ДНК микроорганизмов;
2. ПЦР – амплификацию фрагментов генов бактерий (16S рДНК) с флуоресцентно-мечеными праймерами (обычно с 5 -конца);
3. Ферментативную обработку амплификата с помощью эндонуклеаз рестрикции (обычно используют эндонуклеазы, узнающие последовательности из 4 нуклеотидов);
4. Разделение полученных в результате рестрикции фрагментов ДНК в по-лиакриламидном геле в секвенаторе вместе с флуоресцентно меченым ДНК-маркером известного размера. Каждый пик T-RFLP – анализа отражает вид микроорганизма, а интенсивность флюоресценции пика – его процентное содержание в микробном сообществе. Определение филогенетической принадлежности микроорганизмов проводили с помощью программ и баз данных Arlequin, FragSort, TRAMPR и T-REX.
Дополнить и расширить результаты T-RFLP- анализа позволяет RT-PCR-анализ – молекулярно-генетический метод, основанный на полимеразной цепной реакции с детекцией результатов в режиме реального времени. Применение данного метода дает возможность провести количественное определение доли микроорганизмов в сообществе.
Тотальную ДНК из образцов выделяли с помощью набора «Genomic DNA Purification Kit» («Fermentas, Inc.», Литва) согласно рекомендациям производителя.
Для лизиса клеточных стенок микроорганизмов в стерильной микроцентрифужной пробирке Эппендорф объемом 1,5 мл к навеске 200 мкг пробы добавляли 400 мкл лизирующего раствора (lysis solution) и перемешивали смесь на вортексе (CVP-2, BioSan, Латвия). Затем полученную смесь инкубировали в термошейкере при 65С в течение 30 мин при постоянном перемешивании. Далее проводили процедуру преципитации с целью осаждения ДНК. Готовили раствор для преципитации ДНК (precipitation solution): к 720 мкл стерильной очищенной воды добавляли 80 мкл концентрированного раствора для преципитации. Полученный раствор перемешивали на вортексе в течение 1-2 мин.
В каждую микроцентрифужную пробирку с пробой добавляли 800 мкл готового раствора для преципитации ДНК, перемешивали смесь на мультивор-тексе (V-32, Biosan, Латвия на максимальной скорости и помещали в центрифугу. Смесь центрифугировали на настольной центрифуге (Beckman Coulter, США) в течение 10 мин при 14000 оборотов.
Полученную жидкую фазу тщательно и аккуратно удаляли из микроцентрифужных пробирок, осадок ДНК оставляли в пробирке.
К осадку ДНК добавляли 100 мкл раствора хлорида натрия (NaCl solution), 300 мкл 96% этилового спирта и тщательно перемешивали на вортексе в течение 1-2 мин.
Полученную смесь центрифугировали на настольной центрифуге в течение 10 мин при 14000 оборотов. Жидкую фазу аккуратно удаляли из микроцентрифужных пробирок, осадок оставляли в пробирке. Далее осадок инкубировали в настольном термостате «Гном» при температуре 45С до полного высушивания (5-10 мин).
К осадку ДНК добавляли 100 мкл стерильной дистиллированной воды и перемешивали 1-2 мин на вортексе. Полученный раствор ДНК замораживали и хранили в холодильнике при температуре - 20С до использования для дальнейших исследований.
Качество препарата ДНК оценивают с использованием электрофореза, количество ДНК определяют с использованием метода флюоресценции при добавлении интеркалирующих красителей во флуорометре.
Количественную оценку качества ДНК проводили при анализе флюоресценции при добавлении интеркалирующих красителей с использованием флуориметра Qubit и набора реагентов для определения концентрации ДНК Quant-iT Assays.
Для проведения анализа брали пробирки Эппендорф из набора Quant-iT Assays: для контрольного анализа и по количеству проб ДНК. Далее готовили реакционную смесь согласно рекомендациям изготовителя.
Полученную реакционную смесь смешивали на вортексе в течение 2-3 с. Затем инкубировали смесь 2 мин при комнатной температуре.
По истечении времени инкубации пробирки помещали во флуориметр и снимали показания с прибора. Концентрацию ДНК в пробе пересчитывали по следующей формуле:
Концентрация ДНК = Результаты анализа Qubit количество мкл пробы
Количество ДНК в результате выделения ДНК должно составлять 1-20 нг/мкл.
Качество препарата ДНК оценивали с использованием электрофореза в 1%-агарозном геле.
В каждую пробу ДНК (20 мкл) вносили 2 мкл буферного раствора для внесения проб в гель.
В каждую лунку агарозного геля, помещенного в камеру для электрофореза под электрофорезным буфером, вносили полученную смесь ДНК+рас-твор для внесения в гель.
В крайние лунки на агарозный гель вносили по 3 мкл стандартного маркера (Gene Ruler или Mass Ruler, Fermentas) для оценки качественного состава фрагментов ДНК.
После электрофореза агарозный гель анализировали его в трансиллюминаторе в проходящем УФ-свете при длине волны 260 нм и документировали при помощи фотоаппарата или системы гель-документирования.
Анализ гелей проводили в специальных защитных очках и в маске, а также пользуясь защитным экраном трансиллюминатора.
Продуктивность, переваримость и использование питательных веществ корма бройлерами, состояние микрофлоры желудочно-кишечного тракта при использовании в рационе кормов, содержащих кукурузу и ячмень (опыт 2)
Следующим этапом наших исследований стало изучение микрофлоры слепых отростков цыплят-бройлеров при использовании в рационе кормов, содержащих кукурузу и ячмень, а также обогащение ячменного Целлобакте-рином-Т. Среди используемых для кормления птицы злаковых у ячменя гораздо ниже энергетическая ценность, содержание протеина – около 9-12%, а сырой клетчатки незначительно больше, чем у кукурузы. Крое того, по сравнению с кукурузой в ячмене выше уровень растворимых (4,5%) и нерастворимых НПС (12,2%). По сравнению с пшеницей в ячмене выше на 2,1% растворимых и на 3,2% нерастворимых НПС (Choct, M,1997).
Причем преобладают в нем - глюканы (3,6% против 0,4% в пшенице и отсутствие их в кукурузе). Основные зоотехнические результаты опыта 2 представлены в таблице 12
Из данных, представленных в таблице, следует, что сохранность птицы в опытной группе 2 была ниже, чем в контроле, на 2,9%, однако отход не был связан с кормовыми факторами. Живая масса цыплят зависела от состава комбикорма. Так, в 21- дневном возрасте она была ниже, чем в контроле, в опытной группе 2 на 0,4%, опытной группе 3 – выше на 0,7%. К концу выращивания средняя живая масса бройлеров в опытной группе 2, получавшей ячмень, была меньше, чем в группе 1, на 6,4%, в том числе петушков – на 6,1% (Р0,01), курочек – на 6,7%(Р0,01). Обогащение аналогичного комбикорма Целлобак-терином-Т способствовало увеличению средней живой массы 36-дневных цыплят на 5,1%, в том числе петушков – на 4,9% (Р0,05), курочек – на 5,5% (Р0,05) по сравнению с опытной группой 2.
Разница по средней живой массе птицы в опытной группе 3 по сравнению с контролем составила 1,5% в пользу группы 1, в том числе различия по петушкам были равны 1,5%, курочкам – также 1,5%.
Полученные результаты согласуются со среднесуточным приростом живой массы, который был выше в контрольной группе, чем в опытных. Бройлеры опытной группы хуже потребляли комбикорма: на 1,5% и 0,3% по сравнению с контрольной группой 1 и опытной группой 3.
При этом затраты корма на 1 кг прироста живой массы были минимальными в контрольной группе 1, в опытных группах 2 и 3 – выше на 5,3 и 1,2% соответственно. Следовательно, используемый в опыте пробиотик Целлобак-терин-Т, способствовал улучшению рост бройлеров и конверсии корма.
Об этом свидетельствуют и данные балансового (физиологического) опыта (табл. 13).
Согласно приведенным в таблице данным, замена легкопереваримого компонента рациона кукурузы на ячмень оказала отрицательное влияние на переваримость и использование питательных веществ корма. Так, бройлеры опытной группы 2 хуже, чем сверстники контрольной группы, переваривали органическое вещество корма (на 8,4%), протеин (на 2,8%), жир (на 3,8%), клетчатку (на 10,8%). Использование азота было также хуже на 3,4%.
Использование Целлобактерина-Т в комбикормах, содержащих ячмень, позволило улучшить показатель переваримости и использования питательных веществ рациона цыплятами-бройлерами, хотя они и были несколько ниже, чем в контроле (рис.6).
Замена кукурузы на ячмень отразилась на состоянии микрофлоры желудочно-кишечного тракта цыплят (табл.14).
Микробные сообщества кишечника бройлеров заметно различаются по таксономическому составу в зависимости от рационов, которые они получали во время эксперимента, особенно если корм обогащен пробиотическим препаратом. Так, бациллы были обнаружены у птицы из 3-ей группы – 0,3±0,4, у птиц из второй группы данный показатель был равен нулю, тогда как в контрольной группе – 1,0±1,3. Во 2-ой подопытной группе произошел резкий сдвиг микробиоты в сторону лактобацилл – 12,5 ± 14,0, тогда как в контрольной группе и 3-й этот показатель составлял – 4,4 ± 1,8 и 4,5 ± 0,3 соответственно. Это на 184%, больше чем в 3-ей группе и контроле.
Лактобациллы для организма бройлерной птицы - очень важный компонент резидентной микробиоты желудочно-кишечного тракта, обеспечивающих иммуностимулирующий и антагонистический в отношении патогенов эффект, лактобактериям присущи и другие важнейшие физиологические функции. Помимо перечисленных функций, они также активно участвуют в метаболизме углеводов, белков, липидов, нуклеиновых кислот и ферментации корма при переваривании. Так, лактобациллам также, как и бифидобактериям, принадлежит важная роль в регуляции и поддержании рН, водно-солевого обмена и анаэробиоза в кишечнике, деконьюгации желчных кислот, синтезе витаминов, аминов и других биологически активных соединений.
Показатели группы целлюлозолитиков в 3-ей группе, были равны 75,5 ± 0,9 и превышали, их уровень во 2-ой группе на 20,41%, а в контроле на – 10%. По остальным показателям у бройлеров 3-ей группы микрофлора, в т.ч. – лахноспиры, превышали показатели во 2-ой подопытной группе на – 100%, в контроле на – 50%; руминококки – на 58% во 2-ой группе и на – 36,8% в контроле, группа клостридий в 3-ей группе была выше на – 13,1%, чем во второй, и на – 35,6%, чем в контроле: бактероидов во второй группе оказалось больше на 13,22%, чем у птицы в 3-ей группе, но на – 25,6%, меньше чем в контроле; показатель эубактерий в контроле составлял – 0,2±0,1, во 2-ой подопытной группе – 0,3±0,1 ,а в 3-ей – 0,4±0,2.
Анализируя полученные данные с результатами из опыта по изучению микрофлоры ЖКТ цыплят-бройлеров, при использовании в рационе кормов, содержащих кукурузу и пшеницу, в нем мы получили абсолютно другие результаты. Там показатели у птицы получавшей специальную добавку с про-биотиком, были ниже, чем в контроле: так целюлозолитики на – 5,3%, в т.ч. – лахноспиры – на 44,4%, руминококки – на 29,9% выше, чем у контроля, но на 19,6% ниже, чем у птицы из 2-ой группы; клостридии на – 16,8%, бактероиды на – 24,11%, эубактерии на – 50%, чем в контроле соответственно. На основании этого можно предположить, что для переваривания комбикорма с включением 45% ячменя по массе комбикорма с ферментативный пробиотиком Целлобактерин-Т, нужно больше целюлозолитических микроорганизмов, чем при кормлении рационом с пшеницей и кукурузой, так как для переваривания ячменя необходимо больше ферментативных веществ.
В обеих подопытных группах была обнаружена условно-патогенная микрофлора: кол-во энтеробактерий в них было одинаковым по 0,2±0,2. В контроле данный показатель был равен нулю. В условиях кислой среды бактероиды проявляют антагонистическую активность по отношению к сальмонеллам, эшерихиям, другим микроорганизмам и, по-видимому, играют существенную роль в резистентности организма к инфекциям. Хотя они и относятся на сегодняшний день к условно-патогенным микроорганизмам, однако результаты исследований ряда авторов за последние несколько лет свидетельствуют об их участии в этиологии многих патологических процессов: энтеритов, некротических гепатитов, перитонитов у птицы, особенно мясных пород.
Актиномицеты также относятся к нежелательным микроорганизмам кишечника птицы, т.к. являются частыми возбудителями актиномикозов. У цыплят из контроля количество актиномицетов было ниже, чем в подопытных группах, получавших с кормом ячмень 45% и пробиотик по сравнению с контрольной группой и составляло - 0,4±0,3. Так, количество данных бактерий во 2-ой подопытной группе было выше на 75%, а в 3-ей подопытной группе цыплят, получавших ферментативный пробиотик, – на 350% по отношению к контрольной группе.
Результаты корреляционного анализа
Выполнен анализ корреляции между содержанием микроорганизмов и показателями переваримости и использования питательных веществ в опытах по включению в рацион цыплят пшеницы, ячменя и подсолнечного шрота в комбинации с пробиотиком Целлобактерином- Т. Показатели переваримости учитывались для оценки количества питательных веществ, поступивших в организм цыплят, энергетической, белковой и аминокислотной питательности корма. Значения микробного фона ЖКТ птицы необходимы для определения изменения параметров качества кормления и дисбаланса в составе микрофлоры, при которых возможно развитие дисфункции физиологических и биохимических процессов, нарушение пищеварения и усвоения питательных веществ (Torok V.A. 2011). Для коммерческого птицеводства это является серьёзной проблемой, связанной с ухудшением конверсии корма, развитием у птицы заболеваний различной этиологии и снижением прибыльности (Alemka A. et al, 2010; Scupham А., 2009). С помощью ряда исследований доказано, что состав микрофлоры кишечника существенно сказывается на приросте живой массы у бройлеров (Kerr А.К. et al, 2013; Brisbin J.T., et al. 2010). Несмотря на то, что для птицы характерно пищеварение, при котором источником ферментов служат пищеварительные железы, значительная роль в переваривании трудногидролизуемых компонентов корма отводится микрофлоре в слепых отростках и толстом отделе кишечника (Svihus В et al, 2013; Zdunczyk Z. et al, 2015).
Результаты вычисления коэффициента ранговой корреляции Спирмена между содержанием микроорганизмов в слепых отростках ЖКТ испытуемой группы цыплят и показателями переваримости и использования питательных веществ в корме представлены на рисунке 13.
Положительная зависимость установлена между бациллами (А.1) и показателями переваримости азотсодержащих органических компонентов корма (а, е), что характерно для активных протеолитиков, которыми являются бактерии бациллярной группы. Содержание лактобактерий (А.2) - активных участников ферментации корма, положительно коррелировало только с параметрами переваримости и использования жира (в), сырой золы (е) и азота (ж). Характерно, что функция расщепления клетчатки оказалась тесно связана с содержанием лахноспир (г = 0,75), энтеробактерий (г = 0,76), пастерелл (г = 0,74), некультивируемых видов бактерий (г = 0,67), кампилобактерий, пептококков и псевдомонад (г = 0,24; 0,26 и 0,25, соответственно).
Для остальных представителей бактериального сообщества установлена стойкая отрицательная корреляция между указанными параметрами.
Для энтеробактерий (В.1), пастерелл (В.8), псевдомонад (С.1) и некульти-вируемых видов бактерий (С.2) коэффициент корреляции Спирмена имел положительные значения для большинства исследуемых показателей переваримости корма и изменялся от 0,05 до 0,76. Наиболее сильная связь (0,76) установлена между соотношением энтеробактерий и показателями переваримости как органических (0,56), так и неорганических веществ (для сырой золы – 0,56). Вероятно, перечисленные условно-патогенные, патогенные и транзитор-ные бактерии активно используют в своем метаболизме не усвоенные в ЖКТ питательные вещества, что является показателем недостаточной переваримости большинства компонентов корма для исследуемых групп птиц.
На фоне рациона с добавлением подсолнечного шрота, с наибольшим уровнем сырой клетчатки, обнаружено самое высокое содержание облигатных представителей кишечной нормофлоры птицы – молочнокислых бактерий рода Lactobacillus и Eubacterium spp., которые, как правило, благодаря своим свойствам, синтезу органических кислот и бактериоцинов способны к антагонистическому вытеснению патогенных видов.
Основываясь на полученных результатах, можно заключить, что структура питательного рациона обладает способностью оказывать определенное воздействие на состав бактериального сообщества слепых отростков кишечника птицы, что, благодаря синергическим отношениям микроорганизмов с организмом-хозяином, позволяет получить физиологический ответ на продуктивные качества птицы.