Физиолого-биохимический статус и продуктивность крупного рогатого скота при скармливании суспензии хлореллы, выращенной в электростатическом поле Богданова Алена Андреевна

Содержание к диссертации

Введение

ГЛАВА 1. Обзор литературы 12

1.1. Биологические особенности хлореллы 12

1.2. Способы культивирования хлореллы 14

1.3. Влияние хлореллы на организм различных видов животных

1.3.1. Влияние хлореллы на организм лабораторных животных 18

1.3.2. Влияние хлореллы на организм птиц 20

1.3.3. Влияние хлореллы на организм моногастричных животных 23

1.3.4. Влияние хлореллы на организм жвачных животных

1.4. Влияние электростатического поля на низшие растения и микроорганизмы 29

1.5. Заключение 30

ГЛАВА 2. Методология и методы исследований 33

2.1. Краткое описание мест проведения экспериментов 33

2.2. Общая схема исследований 34

2.3. Объекты исследования и условия постановки экспериментов

2.3.1. Схема постановки эксперимента по подбору концентраций минеральных веществ питательной среды для культивирования суспензии хлореллы, как кормовой добавки 35

2.3.2. Схема постановки экспериментов по влиянию различного напряжения и времени воздействия электростатического поля на морфофизиологические показатели хлореллы 38

2.3.3. Схема постановки экспериментов по оценке мутагенной активности хлореллы, культивируемой в электростатическом поле 41

2.3.4. Определение нормы выпойки суспензии хлореллы различным возрастным группам ярославской породы крупного рогатого скота 42

2.3.5. Схема постановки экспериментов по влиянию суспензии хлореллы на физиологические и биохимические показатели различных возрастных групп ярославской породы крупного рогатого скота 43

2.4. Методы исследований 48

ГЛАВА 3. Результаты исследований и их обсуждение 55

3.1. Физиологические особенности культуры хлореллы как фотосинтезирующей системы 55

3.1.1. Функциональные особенности продуктивности хлореллы в зависимости от количественных характеристик компонентов питательной среды 55

3.1.2. Влияние электростатического поля на качественные и количественные показатели хлореллы 57

3.1.3 Влияние электростатического поля на мутагенность клеток хлореллы 66

3.1.4. Влияние электростатического поля на биохимический состав суспензии хлореллы 68

3.2 Технология выращивания хлореллы в системе замкнутого типа под действием электростатического поля 71

3.3 Определение нормы выпойки суспензии хлореллы различным возрастным группам крупного рогатого скота 75

3.4 Влияние суспензии хлореллы на физиологическое состояние и продуктивные показатели тёлочек ярославской породы скота 78

3.4.1 Влияние суспензии хлореллы на общие физиологические показатели тёлочек ярославской породы скота 79

3.4.2 Влияние суспензии хлореллы на показатели антиоксидантной защиты тёлочек ярославской породы скота 81

3.4.3 Влияние суспензии хлореллы на гематологические показатели тёлочек ярославской породы скота 82

3.4.4 Влияние суспензии хлореллы на показатели белкового, минерального и углеводного обмена тёлочек ярославской породы скота 85

3.4.5 Влияние суспензии хлореллы на среднесуточные приросты живой массы тёлочек ярославской породы скота 89

3.5 Влияние суспензии хлореллы на физиологическое состояние и продуктивные показатели лактирующих коров ярославской породы скота 93

3.5.1 Влияние суспензии хлореллы на общие физиологические показатели лактирующих коров ярославской породы скота 94

3.5.2 Влияние суспензии хлореллы на показатели антиоксидантной защиты организма лактирующих коров ярославской породы скота 95

3.5.3 Влияние суспензии хлореллы на гематологические показатели лактирующих коров ярославской породы скота 96

3.5.4 Влияние суспензии хлореллы на показатели белкового, минерального и углеводного обмена лактирующих коров ярославской породы скота 99

3.5.5 Влияние суспензии хлореллы на молочную продуктивность лактирующих коров ярославской породы скота 103

3.6 Экономическая эффективность применения суспензии хлореллы, выращенной в электростатическом поле, в рационах ярославской породы крупного рогатого скота 107

Заключение 112

Предложения производству

Перспективы дальней разработки темы 115

Список использованной литературы

• Влияние хлореллы на организм различных видов животных
• Объекты исследования и условия постановки экспериментов
• Функциональные особенности продуктивности хлореллы в зависимости от количественных характеристик компонентов питательной среды
• Влияние суспензии хлореллы на общие физиологические показатели тёлочек ярославской породы скота

Введение к работе

Актуальность темы и степень её разработанности. Стратегическая цель продовольственной безопасности РФ - стабильное внутреннее производство и обеспечение населения безопасной сельскохозяйственной продукцией за счет развития в стране скотоводства [Доктрина продовольственной безопасности РФ, 2010]. Это невозможно без использования природных кормовых добавок, стабилизирующих многие физиологические показатели и повышающих продуктивность животных [Кочиш И.И, 2008; Чикалёв А.И., Юлдашбаев Ю.А., 20121. Большое практическое применение в качестве такой добавки имеет суспензия хлореллы [Сальникова М.Я., 1977; Shields J.R., Lupatsch I., 2012]. Отмечено её благотворное действие на микрофлору желудочно-кишечного тракта, обмен веществ и иммунный статус животных, что улучшает их продуктивные показатели [Подольников ВТ., 2010; Походня Г.С., Богданов Н.И., 2012; Походня Г.С, 2015; Chowdhury S.A. et al., 1995; Azamai E.S.M. et al., 2009].

В Ярославской области отсутствует эффективная технология культивирования хлореллы в системе замкнутого цикла. Принимая к сведению стимулирующее действие электростатического поля при выращивании микроорганизмов и низших растений [Глущенко Н.А., 2013; Gusbeth С.A. et al., 2013], оно способно интенсифицировать процесс культивирования водоросли. Данный процесс практически не изучался, есть отдельные работы, демонстрирующие зависимость проницаемости мембраны для ионов при изменении мембранного потенциала у клетки хлореллы [Суховский Н.А., 2015]. Комплексные работы по функционированию хлореллы в электростатическом поле отсутствуют.

В Ярославской области хорошо развито молочное скотоводство, область является центром разведения одной из лучших отечественных молочных пород - ярославской [Муравьева Н.А, 2011; Фураева Н.С., 2013]. Нет данных по влиянию скармливания суспензии хлореллы, выращенной по технологии с использованием электростатического поля, на физиологическое состояние сельскохозяйственных животных, которое в достаточной степени характеризуют гематологические показатели, показатели неспецифической защиты организма и интенсивность обмена веществ. Поэтому исследования, посвященные изучению действия хлореллы, выращенной в электростатическом поле, на организм ярославской породы скота, являются актуальными.

Цель: изучить влияние суспензии хлореллы, выращенной по технологии с использованием электростатического поля, на физиолого-биохимический статус и продуктивность крупного рогатого скота.

Задачи?

1. Разработать технологию культивирования суспензии хлореллы в биореакторе
закрытого типа с использованием электростатического поля постоянного тока.

2. Изучить физиологические особенности культуры хлореллы, как
фотосинтезирующей системы замкнутого типа, выращенной с использованием
электростатического поля постоянного тока.

3. Изучить влияние суспензии хлореллы на общие физиологические показатели
организма и биохимические показатели крови животных различных возрастных
групп ярославской породы крупного рогатого скота.

1. Изучить влияние суспензии хлореллы на продуктивные показатели животных различных возрастных групп ярославской породы крупного рогатого скота.

2. Рассчитать экономическую эффективность применения суспензии хлореллы, выращенной в электростатическом поле, в рационах ярославской породы крупного рогатого скота.

Научная новизна. Впервые была разработана и апробирована технология культивирования хлореллы в системе замкнутого типа с использованием электростатического поля. Установлено влияние электростатического поля на химический состав и питательную ценность хлореллы. Доказано отсутствие патологической гибели клеток хлореллы, выращенной в электростатическом поле. Изучено действие суспензии хлореллы, выращенной по технологии с использованием электростатического поля, на общие физиологические показатели, гематологические и биохимические показатели крови различных возрастных групп ярославской породы скота. Впервые установлена активность каталазы и супероксиддисмутазы в крови различных возрастных групп крупного рогатого скота ярославской породы. Проведено исследование по влиянию суспензии хлореллы на показатели молочной продуктивности лактирующих коров и среднесуточные приросты тёлочек ярославской породы.

Теоретическая и практическая значимость работы. На основании результатов проведенных исследований научно и практически Аргументировано использование электростатического поля в качестве стимулирующего фактора в технологии выращивания хлореллы. Обосновано применение в практике суспензии хлореллы, выращенной по новой технологии, в кормлении различных возрастных групп крупного рогатого скота ярославской породы. Результаты проведенных экспериментальных исследований дополняют и расширяют представление о физиологическом состоянии и продуктивных показателях животных различных возрастных групп ярославской породы скота при скармливании суспензии хлореллы.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Использование электростатического поля с напряжением 15 кВ и временем воздействия 72 ч в технологии культивирования суспензии хлореллы сокращает время получения готовой добавки на 18 ч, положительно влияет на химический состав и питательную ценность водоросли, не оказывая губительного и мутагенного воздействия.

2. Включение суспензии хлореллы, выращенной в электростатическом поле, в дозировке 155 мл на 1 кг сухого вещества рациона различных возрастных групп ярославской породы скота оказывает стимулирующее действие на общие физиологические показатели, усиливая моторику желудочно-кишечного тракта животных.

3. Включение суспензии хлореллы, выращенной в электростатическом поле, в дозировке 155 мл на 1 кг сухого вещества рациона различных возрастных групп ярославской породы скота комплексно влияет на увеличение гематологических показателей, способствует усилению азотистого и минерального обмена веществ и повышению естественной резистентности.

4. Полученная кормовая добавка способствует увеличению среднесуточных приростов живой массы тёлочек в среднем на 13%, среднесуточного удоя коров - на 23%, что является экономически эффективным.

Степень достоверности и апробация результатов исследований.

Научно-хозяйственные опыты проведены согласно методическим рекомендациям [Овсянников А.И., 1976], физиологические исследования проведены согласно общепринятым методикам на достаточном поголовье крупного рогатого скота с использованием современных методов анализа и расчетов. Статистическая обработка полученных результатов проводилась в программе MS Excel 2010. Определяли среднее арифметическое значение (М), стандартную ошибку среднего (т). Для определения достоверности различий между средними значениями использовали t-критерий Стьюдента,/?<^5.

Основные результаты работы были представлены на XXXIV Международной научно-практической студенческой конференции «НИРС -первая ступень в науку» (Ярославль, 2011); XVI Международной научно-практической конференции аспирантов и молодых ученых «Инновационные направления развития АПК и повышение конкурентоспособности предприятий, отраслей и комплексов - вклад молодых ученых» (Ярославль, 2013); Международной научно-практической конференции молодых ученых «Молодежь и инновации - 2013», (Белоруссия, Горки, 2013); V Международной научно-практической конференции «Научно-техническое творчество - путь к обществу, основанному на знаниях» (Москва, 2013); II международной конференции «Инновационные разработки молодых ученых - развитию агропромышленного комплекса» (Ставрополь, 2013); 9^th International scientific conference «Biotechnology and Quality of Raw Materials and Foodstuffs», (Slovak Republic, Nitra, 2014); XXI Всероссийской молодежной научной конференции «Актуальные проблемы биологии и экологии» (Сыктывкар, 2014); XVIII Международной научно-практической конференции аспирантов и молодых ученых «Инновационные направления развития АПК и повышение конкурентоспособности предприятий, отраслей и комплексов - вклад молодых ученых» (Ярославль, 2015); II Международной научно-практической конференции «Повышение уровня и качества биогенного потенциала в животноводстве» (Ярославль, 2016).

Реализация результатов исследования. По результатам исследований разработана технология для выращивания культуры хлореллы, по которой получено 2 патента на изобретение: патент РФ №2562867 Установка для выращивания хлореллы; патент РФ № 2558300 Способ выращивания хлореллы. Полученные патенты используются в производстве опытно-промышленных установок для культивирования суспензии в ООО «Биостатика». Разработанная технология апробирована и внедрена в ООО «Перспективная механизация» и ООО «Молога». Результаты исследований используются в учебном процессе ФГБОУ ВО Ярославская ГСХА.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 14 статей, 3 из них в журналах, входящих в перечень ВАК РФ, 1 в иностранном журнале, получено 2 патента.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, методологии и методов исследований, результатов исследований и их обсуждения, заключения, предложений производству, перспектив дальнейшей разработки темы, списка использованной литературы и приложений. Работа изложена на 139 страницах, иллюстрирована 47 таблицами, 6

Влияние хлореллы на организм различных видов животных

В работах группы исследователей приведено описание основных видов установок биореакторов для массового культивирования суспензии хлореллы [Арутюнян Н.П. и др., 1966; Сальникова М.Я., 1977; Капустин Н.К., 1984; Гладышев П.А., 2007]. Среди установок, описанных в литературных источниках, выделяют два основных вида: биореакторы закрытого и открытого типа.

Биореакторы открытого типа представляют собой открытые бассейны с различной глубиной, перемешивание в которых осуществляется за счет специальных насосов. Как правило, такие системы расположены на открытом воздухе под естественным освещением и характеризуются ограниченным контролем за процессом культивирования [Wong Y.K. et al., 2016].

Установки закрытого типа представлены в основном в виде ёмкостей различных форм и размеров. В таких системах используются естественное и искусственное освещение, они предназначены в основном для культивирования микроводорослей в строго контролируемых условиях [Сальникова М.Я., 1977].

Принцип работы биореакторов обоих типов основан на непрерывном процессе производства культуры микроводоросли, в результате которого через равные промежутки времени происходит отбор готовой части суспензии, которая, в свою очередь, заменяется на питательный раствор, и происходит повторение производственного цикла.

В настоящее время для культивирования хлореллы разработан целый ряд питательных сред: Тамия, Прата, Пиневича, Маерса, Биологического факультета СПбГУ и другие. В их состав преимущественно входят различные по составу и используемым концентрациям минеральные соли, которые влияют на интенсивность роста и химический состав микроводоросли. Исходя из этого, подбор среды зависит от отрасли животноводства, в которой будет использоваться суспензия хлореллы. Компоненты, входящие в состав питательной среды, должны быть безопасны для их использования в кормлении животных и птицы, вместе с тем важным фактором является доступность всех элементов, входящих в питательную среду, кроме того учитываются особенности питания животных.

Установлено, что значение отдельных минеральных веществ для различных видов животных неодинаково из-за их видовых различий. Например, в рационе свиней чаще всего наблюдается недостаток железа, а в кормлении крупного рогатого скота в большинстве случаев отмечается нехватка магния [Сальникова М.Я., 1977; Капустин Н.К., 1984]. Основываясь на потребностях животных в минеральных солях выбирается оптимальный вариант питательной среды для выращивания суспензии хлореллы.

На сегодняшний день для культивирования суспензии хлореллы известно большое количество фотобиореакторов, каждый из которых имеет свои конструктивные особенности. Процесс производства суспензии хлореллы в них основан на фотосинтезе микроводорослей, который осуществляется при наличии нескольких факторов, без которых производство суспензии хлореллы невозможно, а именно это наличие источника света, постоянного перемешивания культуры, определенного температурного режима и необходимых питательных веществ.

Современные установки, основанные на ранее изобретенных моделях биореакторов в различных модификациях, характеризуются полной автоматизацией процесса производства культуры, применением различных источников света с разным спектром, а также системами перемешивания культуры и подачи углекислоты.

Данные биореакторы создают все необходимые условия для эффективного культивирования микроводорослей, в результате чего позволяют получать суспензию хлореллы надлежащего качества круглогодично, вне зависимости от времени года и условий освещения [Богданов Н.И., Куницын М.В., 2003; Богданов Н.И., Куницын М.В., 2006; Гладышев П.А., 2007; Богданов Н.И., Карелин Н.В., 2011; Bamba B.S.B. et al., 2014].

К недостаткам некоторых моделей биореакторов можно отнести их взрывоопасность в результате нарушения герметичности стеклянных колпаков у ламп накаливания и ламп типа ДРЛ при использовании их в качестве источника света. Следует отметить, что спектр излучения таких типов ламп ведет к нарушению зрения обслуживающего персонала установок [Богданов Н.И., Куницын М.В., 2003; Богданов Н.И., Куницын М.В., 2006]. При размещении ламп накаливания и лампы типа ДРЛ (дуговая ртутная люминофорная) снаружи биореакторов снижается интенсивность обогрева культуры микроводоросли, что сказывается на замедлении процесса фотосинтеза клеток, а применение отражающих материалов в конструкции установок с выносными лампами приводит к ее удорожанию [Богданов Н.И., Сидорин А.Г., 2003].

Конструктивные особенности некоторых установок должны предусматривать охлаждение источника света [Гладышев П.А., 2007]. Отдельные модели биореакторов для выращивания суспензии хлореллы хоть и позволяют производить биомассу микроводоросли высокого качества, но отличаются сложностью конструкций и характеризуются высоким энергопотреблением [Грабарник В.Е., Карелин Н.В., 2013; Bamba B.S.B. et al., 2014].

Отсутствие регулятора температуры в конструкции биореакторов является одним из значимых недостатков большинства существующих на данный момент установок. Это сказывается на производительности биореакторов, а при перегреве культуры на несколько градусов может способствовать развитию в монокультуре сине-зеленых водорослей [Богданов Н.И., Куницын М.В., 2003; Богданов Н.И., Сидорин А.Г., 2003; Богданов Н.И., Куницын М.В., 2006].

Объекты исследования и условия постановки экспериментов

Экспериментальные исследования по изучению влияния электростатического поля постоянного тока на качественные и количественные показатели хлореллы проводили в период 2011-2015 гг. на базе научно-исследовательской лаборатории мониторинга и контроля качества ФГБОУ ВО Ярославская ГСХА. В своих исследованиях по разработке технологии производства суспензии хлореллы в электростатическом поле мы использовали планктонный штамм микроводоросли Chlorella vulgaris ИФР № С-111 [Богданов Н.И., 2007], отвечающий требованиям промышленного культивирования.

Экспериментальные исследования по действию суспензии хлореллы на морфофизиологические показатели организма ярославской породы крупного рогатого скота проводили в период 2011-2015 г.г. на базе животноводческих предприятий ЗАО «Племзавод Ярославка» Ярославского района и ООО «Молога» Рыбинского района Ярославской области, которые специализируются на выращивании молочного скота ярославской и черно-пестрой пород.

Физиолого-биохимический статус и продуктивность крупного рогатого скота при скармливании суспензии хлореллы, выращенной в электростатическом поле Разработка технологии выращивания суспензии хлореллы с использованием электростатического поля Способ выращивания суспензии хлореллы в биореакторе замкнутого типа с использованием электростатического поля Определение нормы выпойки суспензии хлореллы различным возрастным группам крупного рогатого скота Исследование влияния суспензии хлореллы на физиолого-биохимические и продуктивные показатели различных возрастных групп животных ярославской породы скота Влияние суспензии хлореллы на физиологическое состояние и продуктивные показатели тёлочек ярославской породы скота Влияние суспензии хлореллы на физиологическое состояние и продуктивные показатели лактирующих коров ярославской породы скота Исследование физиологическ их и биохимических показателей крови тёлочек ярославской породы скота Определение среднесуточных приростов тёлочек ярославской породы скота Исследование физиологических и биохимических показателей крови лактирующих коров ярославской породы скота Исследование качественных и количественных показателей молочной продуктивности лактирующих коров ярославской породы скота Расчет экономической эффективности применения суспензии хлореллы, выращенной в электростатическом поле, в рационах ярославской породы крупного рогатого скота

Для изучения влияния суспензии хлореллы, выращенной по новой технологии с использованием электростатического поля, на организм сельскохозяйственных животных в качестве объекта исследования выбрали ярославскую породу крупного рогатого скота. Животные этой породы имеют ряд исключительных хозяйственно-полезных качеств, отличающих их от других пород, к которым относятся высокое содержание жира и белка в молоке, хорошие адаптационные способности, сопротивляемость организма к инфекционным заболеваниям, крепкая конституция, большая продолжительность жизни [Тамарова Р.В., 2001; Муравьева Н.А., 2011; Фураева Н.С., 2004; Фураева Н.С., 2013].

Эксперимент по определению концентраций минеральных веществ питательной среды для культивирования суспензии хлореллы осуществляли в двух малых экспериментальных биореакторах, которые представляли собой стеклянные ёмкости в форме параллелепипеда размерами 600X150X100 мм, разделённые на две одинаковые локации объемом по 3 литра, каждая из которых снабжалась нагревателем с терморегулятором и помпой. В качестве источника освещения в установках использовались фотолюминесцентные лампы.

Определение оптимальных концентраций минеральных веществ питательной среды для выращивания суспензии хлореллы проводили в серии из 6 опытов (табл. 1).

Каждую серию эксперимента проводили в двух повторностях, для этого в одной из локаций биореактора выращивалась суспензия хлореллы на контрольной среде, в другой локации - на опытной. Контролем служила модернизированная среда Тамия и Биологического факультета СПбГУ, которая состояла из следующих компонентов: макроэлементы (г/л): KNO3 – 5,0, MgSO47H2O – 2,5, KH2PO4 – 1,25; микроэлементы (мг/л): FeSO47Н2O – 5, Са(NO3)2 – 10, Co(NO3)26H2O – 0,02, CuSO45H2O – 0,01, ZnSO47Н2O – 0,04, MnSO4 – 1,0, Н3ВО3 – 0,6, (NH4)6Mo7O244H2O – 0,5; Трилон Б – 5 мг/л [Сальникова М.Я., 1977]. В составе опытной среды использовались те же макро- и микроэлементы, что и в контроле, при этом концентрации макроэлементов в опыте уменьшали в определенной пропорции по отношению к концентрациям макроэлементов в контроле. Для этого количество каждого макроэлемента уменьшали в два раза по сравнению с аналогичными концентрациями макроэлементов в контрольной среде, в последующих опытах количество первого макроэлемента уменьшали на 0,25 г, соблюдая соотношение к нему остальных компонентов. Доля каждого макроэлемента в питательной среде должна быть таковой, чтобы с одной стороны технология выращивания хлореллы являлась экономически выгодной для сельхозтоваропроизводителей, с другой стороны суспензия хлореллы должна оказывать положительное действие на организм крупного рогатого скота.

Длительность каждой из серии опытов составляла 72 ч. Исходные условия серий эксперимента были идентичны: водоросли находились в стадии активного роста, начальная концентрация микроводоросли составляли 28 млн кл./мл, температура выращивания – 28 С.

Функциональные особенности продуктивности хлореллы в зависимости от количественных характеристик компонентов питательной среды

Химический анализ суспензии хлореллы и кормов, входящих в рационы животных, участвующих в экспериментах, предусматривал определение: сырого протеина по методу Кьельдаля (ГОСТ 13496.4-93); сырого жира – методом обезжиренного остатка (ГОСТ 13496.15-97); сырой золы – весовым методом (ГОСТ 26226-95); сырой клетчатки –методом Геннеберга-Штокмана (ГОСТ 13496.2-91); общей влаги – двухступенчатым методом (ГОСТ 27548-97); кальция – комплексонометрическим методом (ГОСТ 26570-95); фосфора – фотометрическим методом (ГОСТ 26657-97); цинка, меди и железа – атомно-абсорбционным методом (ГОСТ 30692-2000, ГОСТ 30178-96). Химический анализ суспензии хлореллы проводили в средней пробе каждой из трёх партий, в кормах – в средней пробе.

Для определения активности супероксиддисмутазы и активности каталазы суспензии хлореллы замораживали центрифугат культуры микроводоросли, которую отбирали после каждых 72-х часов культивирования суспензии хлореллы в течение месяца.

Ферментативную активность хлореллы определяли в гомогенате, для чего клетки отделяли от культуральной среды центрифугированием при 10 тыс. обор./мин в течение 30 мин на микроцентрифуге 5424R фирмы «Eppendorf» (Германия) и гомогенизировали 5 мин с помощью гомогенизатора Ultraurrax T 10 basic (Германия) на холоду. Активность супероксиддисмутазы определяли в гомогенате хлореллы спектрофотометрическим методом, который основан на восстановлении нитротетразолия супероксидными радикалами, образованными в результате взаимодействия феназинметасульфата с восстановленной формой (НАДН). Активность фермента определяли при длине волны 540 нм [Чевари С. и др., 1985].

Активность каталазы хлореллы определяли в гомогенате хлореллы спектрофотометрическим методом после добавления 0,1 мл гомогената к 2 мл 0,03% раствора перекиси водорода. В холостую пробирку вместо гомогената вносили 0,1 мл дистиллированной воды. Остановку реакции осуществляли через 10 мин путём добавления 1 мл 4% раствора молибдата аммония. Интенсивность окраски определяли при длине волны 410 нм [Королюк М.А. и др., 1988].

Использовали следующие методы определения общих физиологических показателей животных: температура тела – измеряли термометром в прямой кишке, пульс – с помощью фонендоскопа на уровне локтевого сустава с левой стороны грудной клетки в течение 1 мин, частота дыхания – при помощи фонендоскопа в области лопаток, количество сокращений рубца в течение 2 мин – продавливанием голодной ямки с левой стороны, частота жевательных движений за 1 мин у лактирующих коров определяли путем наблюдений за животными в течение суток.

Методы определения физиологических и биохимических показателей крови: активность супероксиддисмутазы в крови определяли в гемолизате крови, который получали добавлением к 0,1 мл крови 0,9 мл воды, после чего центрифугировали при 5000 об./мин в течение 30 мин Далее пользовались описанной методикой исследования активности этого фермента в суспензии хлореллы; активность каталазы крови определяли в сыворотке крови, используя описанную методику исследования активности этого фермента в суспензии хлореллы; активность щелочной фосфатазы, количество мочевины, кальция, железа, магния, фосфора, общего белка и альбумина, а также уровень глюкозы в сыворотке крови определяли на автоматическом анализаторе Cobas Integra 400 plus с наборами «Roche Diagnostics Gmb» (США), количество свободного аминного азота в сыворотке крови – колориметрическим методом по интенсивности окрашивания с нингидриновым реактивом при длине волны 536 нм [Колб В.Г., Камышников В.С., 1976], количество остаточного азота - гипобромитным методом [Колб В.Г., Камышников В.С., 1976]. После осаждения белков на азотистые соединения центрифугата воздействовали щелочным раствором гипобромита, йодометрически определяя его остаток. Содержание остаточного азота определяли по разности количества гипосульфита, пошедшего на титрование контрольной и опытной пробы, состав и соотношение лейкоцитов изучали на мазках крови, которые фиксировали этиловым спиртом и окрашивали по Романовскому-Гимза. При идентификации лейкоцитов использовали «Атлас клеток крови сельскохозяйственных и лабораторных животных» [Никитин В.Н., 1949]. Под микроскопом МИКМЕД-6 на каждом мазке крови подсчитывали 200 клеток, выделяя лимфоциты, моноциты, нейтрофилы, эозинофилы, базофилы, количество лейкоцитов подсчитывали в камере Горяева под микроскопом МИКМЕД-6. Для этого 0,02 мл крови подкрашивали 0,4 мл 3%-го раствора уксусной кислоты и метиленового синего [Кондрахин И.П., 2004], гематокрит определяли стандартным методом с использованием пипеток Панченкова в 500 мкл цельной крови [Кондрахин И.П., 2004],

Влияние суспензии хлореллы на общие физиологические показатели тёлочек ярославской породы скота

Таким образом установлено, что больший размер имели клетки, подвергавшиеся воздействию электростатического поля с напряжением 15 кВ в течение 72 ч. Форм-фактор клеток в данной серии эксперимента составил 1,01±0,04, клеток с нетипичной формой для данного вида микроводорослей и повреждениями в области клеточной стенки и плазматической мембраны не отмечено. Протопласт имел привычный зеленый оттенок и характерную для этого вида клеток форму.

По результатам исследования установлено увеличение общего количества клеток хлореллы в 1 мл суспензии при напряжении 15 кВ и времени воздействия 24 ч и 72 ч после 48 ч и 72 ч выращивания. Вместе с тем отмечено, что после 72 ч в пробах, простимулированных электростатическим полем в течение 72 ч, прирост клеток был достоверно выше, чем в пробах, простимулированных полем в течение 24 ч (табл. 17).

Показано, что соотношение мёртвых клеток хлореллы к их общему количеству в суспензии было достоверно ниже после 48 ч выращивания в пробе, простимулированной электростатическим полем с напряжением 15 кВ и временем воздействия 72 ч по сравнению с контрольными значениями.

Процентное соотношение мёртвых клеток к общему их количеству в суспензии, % 24 3,3±0,8 2,5±0,5 2,5±0,6 2,6±0,3 2,3±0,2 2,1±0,1 72 2,3±0,6 1,8±0,5 1,7±0,5 Примечание: p 0,05 по ґ-критерию при сравнении с контролем. Продолжительность стимулирования суспензии хлореллы не оказывает влияние на гибель клеток, так как в течение всего эксперимента было выявлено снижение доли мёртвых клеток в суспензии, при этом после 48 часов опыта этот показатель был достоверным по отношению к контролю.

Таким образом, результаты исследований показали, что воздействие электростатическим полем постоянного тока с напряжением 15 кВ в течение 5 мин оказывало наибольший стимулирующий эффект на прирост клеток хлореллы, среди которых гибель клеток оказалась наименьшей.

В результате стимуляции клеток хлореллы электростатическим полем с напряжением 15 кВ в течение 24 ч и 72 ч установлено, что стимулирование полем в течение 72 ч по показателям прироста, размеров и выживаемости клеток являлось наиболее эффективным параметром воздействия электростатического поля.

Одними из ключевых параметров, характеризующих безопасность применения суспензии хлореллы в качестве кормовой добавки для животноводства является её нетоксичность и отсутствие большого числа мутаций клеток.

Исследования мутагенного эффекта электростатического поля на клетки хлореллы проводили на напряжениях 5, 15 и 45 кВ. Выбранные напряжения электростатического поля в результате стимулирования хлореллы показывали лучший стимулирующий эффект на качественные и количественные показатели хлореллы.

При учете мутантных макроколоний 100% составили колонии с морфологическими мутациями, пигментных мутаций обнаружено не было.

В ходе анализа представленных данных отмечали, что выбранные значения напряжения не способны индуцировать видимые мутации хлореллы. В первом эксперименте частота возникновения мутантных колоний у хлореллы при действии напряжения различалась в зависимости от значения напряжения (табл. 18).

Влияние воздействия различного напряжения электростатического поля на выраженность мутагенного эффекта в тесте учета видимых мутаций у хлореллы Напряжение, кВ Времявоздействия,мин Частота мутантных колоний, % Выраженностьмутагенного эффекта, балл контроль - 0,90±0,41 1 опыт 5 5 0,43±0,30 0,5 5 0,34±0,19 0,4 5 0,60±0,45 0,7 Наибольшая частота видимых мутаций (0,60±0,45%) установлена при стимуляции суспензии хлореллы напряжением 45 кВ, однако, результаты для всех опытных групп достоверно от контроля не отличались. Выраженность мутагенного эффекта в опытных группах варьировала от 0,4 до 0,7 баллов. Результаты исследования свидетельствовали об отсутствии мутагенного эффекта при воздействии различных значений напряжения (табл. 18). Во втором эксперименте при воздействии длительностью 24 часа напряжением 15 кВ установлено, что частота видимых мутаций хлореллы составила 0,63±0,21%, длительностью 72 часа – 1,09±0,16%, спонтанный уровень мутаций равнялся 0,90±0,55% (табл. 19). Полученные результаты для обеих опытных групп от контроля достоверно не отличались, и, таким образом, мутагенный эффект воздействия не наблюдали.