Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 15
1.1. Сахарный диабет 2 типа и синдром диабетической стопы 15
1.2.Системы определения глубины поражения при СДС 18
Классификация Вагнера 19
Классификация язвенных дефектов при СДС Техасского университета 19
Классификация язвенных дефектов WIFI 21
1.3.Воспаление.Представители миелоидных клеток. 25
1.4.Цитокины и хемокины 29
TNF– (Tumor necrosis factor –) или ФНО– (Фактор некроза опухоли – ) 31
CCL18 (Хемокиновый (СС мотив) лиганд 18) 33
1.5.Экспериментальные работы по М1/М2 фенотипам 34
1.6. Цитокинотерапия в клинической практике 37
Глава 2. Материалы и методы 40
2.1.Дизайн исследования 40
2.2. Математико–статистическая обработка полученных результатов 42
2.3. План обследования 42
2.4. Общая характеристика обследованных добровольцев 44
2.5. Пациенты с впервые выявленным СД-2 и группы контроля 45
2.6. Пациенты с длительным течением СД–2 без СДС и с СДС 46
2.7. Характеристика пациентов при нейропатической и нейроишемической формах СДС 47
2.8.Лабораторные методы 49
2.8.1. Многоэтапная процедура выделения моноцитов /макрофагов из крови человека и стимуляция клеток по провоспалительному (М1) и противовоспалительному (М2) фенотипам 50
Глава 3.Результаты исследования 52
3.1. Сравнительный анализ показателей про– и противовоспалительной активности моноцитов у пациентов с впервые выявленным СД–2, без сахароснижающей терапии, пациентов с ИБС без СД и здоровых добровольцев 52
3.2. Сравнительный анализ показателей про– и противовоспалительной активности моноцитов у пациентов с длительным течением СД–2 без СДС и с язвенными дефектами 61
3.2.1. Показатели про– и противовоспалительной активности моноцитов при ожирении у пациентов с длительным течением СД–2 61
3.2.2. Показатели про– и противовоспалительной активности моноцитов у пациентов длительно страдающих СД–2 в зависимости от метаболизма липидов 62
3.2.3. Показатели про– и противовоспалительной активности моноцитов у пациентов длительно страдающих СД–2 в зависимости от углеводного обмена 63
3.2.4. Показатели про– и противовоспалительной активности моноцитов при хронической ишемии нижних конечностей (ХИНК) у пациентов длительно страдающих СД–2 65
3.2.5. Показатели про– и противовоспалительной активности моноцитов при сахароснижающей терапии у пациентов с длительным течением СД–2. 69
3.3. сравнительный анализ показателей про– и противовоспалительной активности моноцитов у пациентов с осложненными формами СДС 73
3.3.1. Сравнительный анализ показателей про– и противовоспалительной активности моноцитов у пациентов с СДС в зависимости от степени и глубины поражения 75
3.3.2. Сравнительный анализ показателей про– и противовоспалительной активности моноцитов у пациентов с язвенными дефектами нижних конечностей в зависимости от площади 83
3.3.3. Сравнительный анализ показателей про– и противовоспалительной активности моноцитов у пациентов с язвенными дефектами в зависимости от длительности раневого процесса 85
3.4. Влияние метаболической терапии на показатели про– и противовоспалительной активности моноцитов у пациентов с длительным язвенным дефектом – более 6 месяцев 86
Глава 4. Обсуждение собственных результатов 91
Заключение 99
Выводы 99
Практические рекомендации 100
Список сокращений 101
Список литературы 102
- Сахарный диабет 2 типа и синдром диабетической стопы
- Цитокинотерапия в клинической практике
- Показатели про– и противовоспалительной активности моноцитов при хронической ишемии нижних конечностей (ХИНК) у пациентов длительно страдающих СД–2
- Влияние метаболической терапии на показатели про– и противовоспалительной активности моноцитов у пациентов с длительным язвенным дефектом – более 6 месяцев
Сахарный диабет 2 типа и синдром диабетической стопы
Около 100 лет назад с началом использования инсулина для лечения пациентов диабетом, диабет был взят под контроль [Дедов И.И., 2015]. Однако до сих пор отмечается рост осложнений СД.
Учитывая несвоевременное выявление отдаленных осложнений СД, Экспертами эндокринологической службы 11 мая 2017 г. в системе Здравоохранения РФ запущен пятилетний пилотный проект для проведения анкетирования, диспансеризации по раннему выявлению и профилактике СД–2. В проект были включены ресурсы специализированного обучения участковых терапевтов, в соответствии с национальным алгоритмом ведения пациентов СД [Шестакова М.В. и соавт.,2017].
К многочисленным осложнениям СД относятся повреждения периферической нервной системы. По данным клинических наблюдений, наиболее частая причина возникновения неблагоприятных воздействий на работу нервной системы – длительный дисбаланс метаболических нарушений [Левин О.С., 2016].
В формировании СД принимают участие молекулярные процессы, которые осуществляют регуляцию, транспорт пептидов, направленность и интенсивность иммунной атаки [Вайнтрауб Б. Д., 2003]. Диабетические невропатии и ангиопатии вызывают дисфункции клеток, нарушение гомеостаза тканей и органов в целом [Lotfy M. et al., 2017]. В большинстве случаев у пациентов с впервые выявленным СД на момент установления диагноза выявляются глубокие поражения периферической нервной системы, при этом у 88,2% диабетическая полинейропатия (ДП) носит безболевой характер [Хуторная О.Е., 2014]. По продолжительности заболевания также зафиксирована безболевая форма ДП [Шулутко Б.И, и соавт., 2007]. Своевременная диагностика и адекватный прогноз напрямую зависят от клинической симптоматики ДП, речь идет о бессимптомных формах ДП. Ранним признаком служит снижение вибрационной чувствительности [Галстян Г.Р., и соавт.,2015].
Результатом гипергликемии является накопление свободных радикалов в большом количестве и, как следствие, повреждение нервной ткани по причине апоптоза нейронов, леммоцитов и глиальных клеток [Яхно Н.Н., 2007]. Гипергликемия является причиной микро– и макроангиопатии, поражения периферической нервной системы у пациентов СД [Гурьева И.В.,2013]. Потребность нервной ткани в глюкозе в условиях гипергликемии приводит к инициированию полиолового пути, развитию окислительного стресса, что связано с избыточной продукцией свободных радикалов [Удовиченко О.В., и соавт., 2010]. Дефицит оксида азота, гипоксия в нервной ткани и снижение образования нейротрофных факторов роста в нерве – причина диабетической ангиопатии. Установлено, что пероксинитрит образуется при взаимодействии оксида азота с кислородом, вместе они провоцируют образование продуктов свободнорадикального окисления. Непрерывному окислению наиболее подвержены липидные субстраты клеточных мембран в условиях длительной гипергликемии [Недосугова Л.В., 2013].
В 1912 г. Луи–Камиль Майяр описал химическую реакцию нагревания аминокислот и сахаров [Maillard L.– C, 1912]. Долгое время подобную реакцию исследовали в биофармацевтических и пищевых отраслях. Позже, в 70–х годах описаны комплексные реакции между аминокислотами и восстанавливающими сахарами, которые формируют более стабильные гликопродукты – Амадори.
В патогенезе формирования диабетической ангиопатии также участвуют конечные продукты неферментативного гликирования белков (КПНГ) и липидов, с образованием шиффовых оснований [Zhang Q. et al., 2009]. Аналогичная реакция (Майяра) начинается с гликирования белка и образования КПНГ при СД. В организме активированные аналоги глюкозы способствуют необратимости КПНГ, накапливаясь на белках сосудистой стенки в условиях гликоподдержки, оказывая, тем самым содействие на создание АФК [Меньщикова Е.Б. и соавт. 2008, Tuttolomondo A., et al. 2015]. Интрацеллюлярно трансформированные КПНГ нарушают каскадность системы комплемента. Исходом взаимодействия КПНГ с рецепторами плазматической мембраны становится развитие оксидативного стресса, как в эндотелиальных, так и гладкомышечных клетках. Тем самым, происходит экспрессия генов и транскрипционного фактора Nf–kB [Недосугова Л. В., 2014]. Пусковым моментом активации Nf–kB являются вирусные и бактериальные атаки, ультрафиолетовые лучи, наличие свободных радикалов в организме человека, канцерогенов, сигаретного дыма, также дисбаланс цитокинов. NF–kB отвечает за экспрессию 500 различных генов, ферментов, про– и противовоспалительных цитокинов. Наиболее выражена экспрессия NF–kB у пациентов с хроническими заболеваниями, среди которых СД. Выброс NF–kB могут подавить некоторые гормоны, кортикостероиды, иммунодепрессанты, интерфероны и т.д. Важно отметить, что баланс NF–kB влияет на течение хронической болезни, и на ее исход. Активируемый цитокинами и медиаторами воспаления NF–kB в клетках нейрона и нейроглии, способствует пролиферации нерва [Shih R–H. et al., 2015]. На фоне снижения секреции факторов роста нерва, теряется способность шванновских клеток формировать миелиновые оболочки, что приводит к демиленизации нервных волокон. В состоянии постоянной гипергликемии окислительный стресс вызывает гипоксию в нейронах.
Установлено, что выработка КПНФ и экспрессия провоспалительных цитокинов, формируют диабетические ангиопатии [ Недосугова Л. В., 2014]. В свою очередь, длительное токсическое действие гликемии может препятствовать ремиелинизации [Бреговский В.Б. и соавт., 2015].
Выявлено, что в условиях хронической гипергликемии на фоне диабетической микро– и макроангиопатии, нейропатии, остеоартропатии со временем развивается СДС. Первопричиной формирования СДС является диабетическая сенсомоторная нейропатия. Установлено, что повреждения немиелинизированных ноцицептивных С–волокон, имевшие место до проявлений симптомов нейропатии, способствует ослаблению защитных механизмов стопы, что приводит к осложнениям [Walmsley D. et al., 1991]. В свою очередь моторная нейропатия приводит к атрофии межкостных мышц, а артериальная недостаточность к ЗПА [Баккер К. и соавт., 2015]. Фактически, СДС это сложный комплекс анатомо–функциональных изменений, приводящий к развитию язвенно–некротических и инфекционных процессов в тканях, а в дальнейшем – к гангрене стопы. СДС встречается в различных формах у 30–80% пациентов СД. Глобальными проблемами являются реампутации и постампутационная летальность пациентов [Анциферов М.Б. и соавт., 2013].
Общая летальность от гнойной хирургической инфекции при СД колеблется от 6% до 22%. При этом более 60% пациентов с СД – лица пожилого и старческого возраста. Гнойно–некротические осложнения СДС неизбежно приводят к появлению раневых дефектов мягких тканей стопы различной локализации, глубины и распространённости, что приводит к необходимости хирургических вмешательств. На сегодняшний день длительное заживление язвенных дефектов, высокая степень инвалидизации и послеоперационной летальности ставят СДС в рамки важнейших медико–социальных проблем [Галстян Г.Р.,2015].
С учетом мультфакторности проблемы СДС, пути решения тоже должны быть всеобъемлющими. Кроме реконструктивных вмешательств, закрытие язвенного дефекта зависит от патофизиологических аспектов. Изменения на фоне диабетической нейропатии и ангиопатии, а также ослабление клеточного и гуморального иммунитета требуют дальнейшего изучения.
Цитокинотерапия в клинической практике
Рекомбинантные цитокины с осторожностью стали внедрятся в клиническую практику в начале 1980–х годов. Применение цитокинотерапии (IL– 1,2,3,4,6,12,TNf–) в качестве естественных иммуностимуляторов с последующим прекращением привели к системным воспалениям. Самыми известными среди них являются IL–1,2, INF–, TNF–. В терапевтических целях при различных аутоимунных заболеваниях применяется, например, рекомбинатный IL–10, ингибирующий продукцию IL–1, 6, Inf, TNf–. Рекомбинатный IL–2 одобрен в онкологии, однако его негативным аспектом является провоспалительный эффект, протекающий в тяжелой форме. В качестве противовирусной терапии пациентам гепатитами В и С применяется INF–; для лечения рассеянного склероза – Inf–. До настоящего времени продолжается эффективное применение эритропоэтина для лечения патологических состояний различного генеза, в том числе и для коррекции диабетической нефрогенной анемии [Charles A.D., 2007]. В целях подавления миграции макрофагов используется направленность иммуномодулирующей терапии на клетки–эффекторы врожденного иммунитета в стимуляции иммунной системы [Хаитов Р.М.,2016].
Larsen C.M. и соавт. установили, что гипергликемия способствует экспрессии IL–1 в –клетках поджелудочной железы человека, что в свою очередь снижает секрецию инсулина, клеточную пролиферацию и ведет к апоптозу. Введение рекомбинантного антагониста рецептора IL–1 блокирует системное воспаление и останавливает гибель –клеток [Larsen C.M. et al.,2007]. Течение воспалительного процесса зависит от уровней провоспалительных цитокинов: при местном применении рекомбинантного IL–1 у пациентов с хроническими незаживающими ранами нижних конечностей усиливается активность мононуклеарных клеток [Варюшина Е.А., 2013]. Барбиной Т. Н. выявлена прямая связь между осложнениями СД и уровнем провоспалительных цитокинов, в частности, TNF– в развитии СДС. Также получен положительный результат применения препарата с высоким содержанием провоспалительных цитокинов. Получено значимое повышение уровня лейкоцитов, незначительное повышение палочкоядерных форм нейтрофилов у пациентов с различными формами СДС, однако при ишемической форме СДС выявлено снижение лимфоцитов, что объясняется иммунодефицитным состоянием на фоне СД. Механизм иммуномодуляторов должен активировать фагоцитарную активность, воздействовать на антителообразования Т–клеток. В свою очередь, получено снижение циркулирующего TNF– в сыворотке крови, что объясняется тяжелым клиническим течением СД–2. По итогам проведённой работы, даны рекомендации, о целесообразности исследования уровня TNF–, как основного предиктора цитокинов, у пациентов с СДС [Барбина Т.Н., 2010].
У пациентов с различными формами СДС, определение цитокинов на локальном уровне является наиболее значимым. С помощью иммунотропных препаратов возможно устранить цитокиновый дисбаланс. Иммунокоррекция регулирует продукцию цитокинов, приводя к угнетению цитотоксического действия, тем самым активируется фагоцитоз и усиливаются репаративные процессы [Бакотина А.Е, 2010].
На сегодняшний день ряд препаратов, рекомбинантных цитокинов, находятся в разработке на этапах клинических исследований. Для заживления ран прошли клинические испытания и допущены к терапии препараты на основе эпидермального фактора роста и фактора роста фибробластов [Симбирцев А.С, 2017].
Исследователи Kogan S. et al. при применении амниотических мембран для заживления ран, указывают на перспективу определения уровней цитокинов и факторов роста в ране, в течение курса лечения, поскольку раневое ложе хронического язвенного дефекта способно деградировать белки аллотрансплантатов [Kogan S. , 2018]. Гипергликемия совместно с медиаторами воспаления, стойко поддерживает воспалительный процесс, при этом нарушаются физиологические фазы репарации. Образование конечных продуктов гликирования и их влияние на клетки врожденного иммунитета осуществляется путем активации ядерного фактора каппа– и свидетельствует о ведущей роли гипергликемии в инициации окислительного стресса. Активация провоспалительных цитокинов, в частности, TNF– индуцирует прогрессирование сосудистой патологии, способствует бурному прогрессированию атеросклероза при СД, регрессируя репаративные процессы [Graves D.T. et al.,2008]. Однако, основные механизмы, способствующие чрезмерному воспалению, а также идентификация гена, отвечающего за восстановление тканевого гомеостаза остаются плохо изученными. И роль конкретных путей активации моноцитов по М1 и М2 фенотипам в реализации про– либо противоспалительного иммунного ответа, как в атерогенезе, так и при развитии СДС при СД–2 остается на сегодняшний день не до конца понятной.
Таким образом, результаты экспериментальных и клинических работ показывают неблагоприятное влияние воспалительных процессов, которые препятствуют закрытию раневого дефекта у пациентов с СД. Определенно, высокий уровень провоспалительных цитокинов приводит к дегидратации и гиперплазии грануляционной ткани.
На сегодняшний день, отсутствуют принятые рекомендации по выявлению иммунных нарушений, играющих определенную роль в нарушении трофики тканей за счет цитотоксического действия у данной категории пациентов, что позволило бы дифференцированно применять цитокинотерапию с целью иммунокоррекции при СДС с использованием, в том числе, имеющихся естественных комплексных препаратов.
Безусловно, дальнейшее исследование медиаторов воспаления, наряду с другими метаболическими нарушениями, дает возможность прогнозировать развитие и дальнейшее течение воспалительного процесса у пациентов с СД.
Показатели про– и противовоспалительной активности моноцитов при хронической ишемии нижних конечностей (ХИНК) у пациентов длительно страдающих СД–2
Оценку ЛПИ у пациентов проводили допплер–анализатором. При сопоставлении значений ЛПИ у пациентов с длительным течением СД–2 с СДС и без, получено повышение уровня базального и стимулированного TNF– и ССL18 у всех пациентов с хронической ишемией нижних конечностей (ЛПИ 0,8) по сравнению с пациентами без ХИНК (ЛПИ 0,9–1,2), однако без значимых различий между группами, кроме базального уровня ССL18 у пациентов с язвенными дефектами, р 0,027 (таблица 3.2.4.1.).
У пациентов без язвенных дефектов нижних конечностей и с нормальным значением ЛПИ в диапазоне 0,9–1,2 не получено стимуляционной активности маркеров воспаления (рисунки 3.2.4.1.-3.2.4.3). И напротив, у пациентов с язвенными дефектами получено двукратное повышение TNF– и снижение ССL18 ниже базального, (рисунки 3.2.4.2– 3.2.4.4.).
В свою очередь, на фоне ХИНК у пациентов без язвенных дефектов нижних конечностей получена активность моноцитов по про– и противовоспалительным путям, противоположно, пациентам с дефектами, у которых выявлена инактивация стимуляционного ответа. Такая закономерность, возможно, связана с длительностью выброса маркера воспаления (TNF–) и свершившимся фактом образования дефекта, а также хроническим раневым процессом в условиях гипоксии тканей.
У пациентов с длительным течением СД-2, в том числе проанализированы величины маркеров воспаления, на фоне получаемой сахароснижающей терапии, в первую очередь, вне зависимости от компенсации углеводного обмена. Пациентов принимавших Метформин не включали в исследование, так как ряд исследований указали на противовоспалительные свойства Метоформина. При терапии ПССП у пациентов в обеих группах не выявлена способность моноцитов к активации по про- и противовоспалительному пути, однако получена значимость различий по уровню базального CCL18,(p 0,05). Активация моноцитов выражается на фоне терапии инсулином (инсулин + ПССП и монотерапии инсулин): у пациентов без СДС базальный TNF–a составил 957,2[372,7;1607] - стимулированный 1492,4[579,7;2910] пг/мл,(р 6a3.vs стим.0,001), базальный CCL18 7,2[1,6;9,0] - стимулированный 11,3 [1,5;27] пг/мл, (р 6a3.vs стим.0,031); базальный уровень TNF-a у пациентов с СДС составил - 592,1[168,6;1254] - стимулированный 1084[465,4;3103,7] пг/мл, (р 6a3.vs стим.0,05) и базальный CCL18 составил13,2[3,8;26,1] - стимулированный 30,9[7,5;80,3] пг/мл, (р 6a3.vs стим.=0,101), при этом сохраняется значимые различия в группах по уровню базального CCL18,(pO,05). У пациентов без СДС на инсулинотерапии базальный уровень TNF-a составил 930[170,4;1934] пг/мла стимулированный 1216[258,3;2275,4] пг/мл, (р 6a3.vs стим.0,05). При этом отмечался низкий уровень как базального, так и стимулированного CCL18 – 3,6[0;20,9] 6,7[1;36,3] пг/мл соответственно, (р баз.vs стим.=0,098). У пациентов с СДС, получавших инсулинотерапию, базальный уровень TNF- составил 857,2[295,9;1322,9], а стимулированный 1448,7[867;3112,7]пг/мл. Уровень базального и стимулированнного CCL18 у этих пациентов был несколько выше и составил 6,5[2,7;40,1] 18,2 [5,2;55,6] пг/мл, (р баз.vs стим.=0,102) соответственно, без значимых различий в группах, (таблица 3.2.5.1).
Влияние метаболической терапии на показатели про– и противовоспалительной активности моноцитов у пациентов с длительным язвенным дефектом – более 6 месяцев
Выявлено, что при пролонгации воспалительного процесса отмечается усиление провоспалительного и ослабление противовоспалительного ответа. Возможно, такое состояние фенотипов является одной из причин одновременного течения трех фаз раневого процесса в хронической, стагнирующей ране у пациентов с СД. С этой целью воздействовали на патогенетическое звено с помощью метаболической терапии, поскольку результаты исследования показали неблагоприятную картину состояния фенотипов именно у пациентов с нейропатической формой СДС. Принимая во внимание индуцибельный и кратковременный выброс цитокинов/хемокинов, фармакокинетический анализ был исследован в 0 точке, через 2 и 4 часа после внутримышечного введения витаминного комплекса, состоящего из никотинамида, кокарбоксилазы, цианокобаламина, динатрия аденозинтрифосфата тригидрата. Цитокиновый статус исследовался в первый и в девятый день лечения. В результате лечения на 9 день отмечено снижение базальной секреции TNF– на 25% (р 0,05), и ССL 18 –20% (р 0,05) по сравнению с исходными значениями, (рисунки 3.4.1; 3.4.2.)
При стимуляции моноцитов на 9–й день лечения отмечено снижение на 17% стимулированной секрецииTNF– (р 0,05) по нисходящему принципу. Противовоспалительный маркер в ответ на стимуляцию IL–4 показал высокий потенциал к стимулированию, а именно 2,5 кратное повышение по сравнению с исходными значениями(р 0,05), (рисунки 3.4.3; 3.4.3).
Метаболическая терапия оказывает противовоспалительное действие на макрофагальное звено, за счет подавления провоспалительного фенотипа и активации противовоспалительного ответа. Безусловно, для регулирования пропорционального механизма своевременного переключения с фенотипа М1 на М2 необходимо не только устранение дисбаланса в системе «оксиданты– антиоксиданты», но и применение иммунокорригирующей терапии, особенно пациентам с длительным язвенным дефектом – более 6 месяцев
Кроме того, полученные данные, подтверждают гипотезу – неблагоприятной картины фенотипов у пациента с длительным язвенным дефектом голени минимальных размеров, (рисунок 3.4.5). А именно, тот самый обширный дефект уменьшаясь в размерах теряет способность к поляризации по противовоспалительному фенотипу за счет длительности воспалительного процесса, становясь немодифицированным. В ходе исследовательской работы выявлен вялотекущий характер данных дефектов.