Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Обзор литературы 11
1.1 Проблема диагностической значимости cпециальных методов иcследования в дифференциальной диагноcтике узловых образований щитовидной железы 11
1.2 Использование белка Ki-67 как маркера опухолевого процесса .14
1.3 Роль белков семейства bcl в злокачественном потенциале узловых образований щитовидной железы 16
1.4 Белок р53 как регулятор апоптоза. Изменения при опухолевой трансформации 19
1.5 Нуклеофосмин – малоизученный белок опухолевой прогрессии 21
1.6 Роль изучения экспрессии цитокератинов в диагностике рака щитовидной железы .22
1.7 Галектин-3. Изучение белка и гена в дифференциальной диагностике узловой патологии щитовидной железы .24
1.8 Перспективы изучения убиквитина как опухолевого маркера 28
1.9 HMGA как важный опухолевый маркер в диагностике злокачественных образований 29
Глава 2 Материалы и методы исследования .32
2.1 Характеристика исследуемых пациентов 32
2.2 Специальные методы исследования 36
Глава 3 Результаты исследования 48
3.1 Основные клинические и лабораторные характеристики группы .48
3.2 Возможности иммуноцитохимической детекции молекулярных маркеров Ki-67, NFM, галектина-3 в дооперационной диагностике высокодифференцированного рака щитовидной железы .62
3.3 Возможности метода Realime PCR в дооперационной диагностике узловой патологии щитовидной железы 69
Глава 4 Обсуждение результатов исследования .79
Заключение 91
Выводы 92
Список сокращений 95
Список литературы 96
- Галектин-3. Изучение белка и гена в дифференциальной диагностике узловой патологии щитовидной железы
- Основные клинические и лабораторные характеристики группы
- Возможности иммуноцитохимической детекции молекулярных маркеров Ki-67, NFM, галектина-3 в дооперационной диагностике высокодифференцированного рака щитовидной железы
- Возможности метода Realime PCR в дооперационной диагностике узловой патологии щитовидной железы
Галектин-3. Изучение белка и гена в дифференциальной диагностике узловой патологии щитовидной железы
Хорошо изученным, хотя с большим количеством противоречий, является галектин-3. Это полифункциональный белок семейства лектинов, принимающий участие в опухолевой прогрессии, апоптозе, ангио- и васкулогенезе, метастатическом потенциале, играет роль в межклеточных, клеточно-матриксных взаимоотношениях. Считается, что данный белок совместно с ВАХ приводит к антиапоптозу раковых клеток ЩЖ [113]. Впервые в 1995 году, Xu и др. анализировали ассоциацию галектина-3 с РЩЖ. Исследовали иммуногистохимическую экспрессию в дифференцированном РЩЖ и предположили, что повышение данного белка может быть связано со злокачественной трансформацией эпителия ЩЖ, и галектин-3 может быть использован в качестве маркера для отличия доброкачественных аденом щитовидной железы и высокодифференцированных карцином ЩЖ [206]. Значимо более выраженную экспрессию галектина-3 при злокачественной патологии в отличие от доброкачественных узлов при иммуногистохимической детекции так же показывают и другие авторы [76,87,172,183,190]. Причем различия сохраняются и при сравнении фолликулярной аденомы и фолликулярной карциномы [60,91,183]. Было выявлено, что галектин-3 имеет более высокую экспрессию в папиллярном раке (в том числе и фолликулярном варианте) по сравнению с фолликулярной аденомой [60,77,136,191 199]. Ученые из Хорватии показали, что определение внутриядерной экспрессии галектина-3 при РЩЖ обладало равной чувствительностью метода, но большей точностью и специфичностью, чем определение экспрессии данного маркера в цитоплазме злокачественных клеток [138].
Особенно актуальным является исследoвание экспрессии даннoгo oнкoмаркера для улучшения дooперациoннoй дифференциальнoй диагностики узловых образований ЩЖ и уменьшения количества диагностических операций [61,92,107,188].
Одни исследователи считают, что галектин-3 является высокочувствительным и высокоспецифичным маркером высокодифференцированного РЩЖ, и данный белок необходимо включать в дооперационную диагностику узловых образований ЩЖ в случаях «неопределенных» результатов цитологического исследования [52,66,188].
Наиболее значимой среди пoдoбных исследoваний мoжнo считать рабoту А. Bartolazzi и др. [66]. В это многоцентровое исследование были включены 1099 пациентов, оперированных по поводу узловых образований ЩЖ. Ретроспективное иммуноцитологическое исследование показало экспрессию галектина-3 в 97% случаев папиллярного рака, в 100% случаев фолликулярного рака с инвазией, в 92% случаев минимально инвазивном фолликулярном раке и только в 3% при аденомах щитовидной железы. В группе больных с «неопределенными изменениями» по данным цитологии положительная экспрессия галектина-3 была при всех случаях злокачественного поражения (верифицированного в дальнейшем) и только 5% фолликулярных аденом экспрессировали галектин-3. По данным авторов, анализировавших литературу 2007-2014 года [83] ценность исследования галектина-3 как маркера РЩЖ различна и колеблется от 8 до 100% чувствительности и от 40% до 100% специфичности. Американские ученые показывают чувствительность для положительной экспрессии галектина-3 для доброкачественных образований 22,7%, а для злокачественных – 92,6% [92]. Итальянскими учеными показано, что иммуноцитохимическое определение галектина-3 повышает точность диагностической морфологии с 54,2% до 78,3% [107]. Другие ученые обнаружили, что специфичность экспрессии галектина-3 при иммуноцитохомическом исследовании для фолликулярного рака 100%, чувствительность - 55%, и сделали вывод, что все пациенты с фолликулярной аденомой, при цитологическом исследовании которой была обнаружена экспрессия данного маркера, должны отправляться на оперативное лечение без повторного цитологического исследования [184]. Saggiorato Е. и др. [110] сообщили, что повышение в цитоплазме галектина-3 является надежным предоперационным молекулярным маркером в диагностике минимально инвазивной карциномы ЩЖ.
В 2015 году был опубликован патент на изобретение, позволяющее проводить диагностику высокодифференцированного РЩЖ. Было предложено методом ИФА исследовать уровень галектина-3 в смыве аспирата из узлов ЩЖ, полученного при тонкоигольной аспирационной биопсии [47]. Значение галектина-3 ниже отрезной точки, 1,0 нг/мл, считался критерием отсутствия высокодифференцированного рака, при получении результата выше 1,6 нг/мл – с чувствительностью 59,7%, специфичностью 90,7% установить высокодифференцированный РЩЖ. Этими же авторами было предложено там же способом интерпретировать уровень тиреоглобулина, и его показатель менее 272,5 нг/мл считался отсутствием высокодифференцированного РЩЖ, в интервале 272,5-355,5 нг/мл предполагался риск высокодифференцированного РЩЖ, значение же выше 355,5 нг/мл позволяло диагностировать данную патологию с чувствительностью 64,9%, специфичностью - 95,3%.
Но, несмотря на большие возлагаемые надежды на галектин-3, как маркер, позволяющий дифференцировать карциному ЩЖ от доброкачественного узла, многие ученые считают, что галектин-3 не следует считать универсальным маркером в диагностике РЩЖ и можно использовать его лишь как дополнительное средство в комплексной диагностике РЩЖ или обязательно в сочетании с другими онкомаркерами [16,33,62,65,142]. Основной проблемой является то, что данный белок экспрессируют и некоторые нетиреоидные ткани, такие как клетки плоского эпителия, фибробласты, гистиоциты, встречающиеся при дегенеративных изменениях узловой гиперплазии. Исследование, проведенное итальянскими учеными, показало связь экспрессии галектина-3 с гипертрофией и / или клеточной гиперпролиферацией, т.е. ситуацией общей, как для аденом, так и для карциномы ЩЖ. Поэтому авторы считают, что галектин-3 не может использоваться в качестве единственного маркера в предоперационной диагностике, а имеет лишь вспомогательное значение [111].
Некоторыми исследованиями было показано, что галектин-3 содержится и в доброкачественной фолликулярной аденоме, имеет выраженную экспрессию в воспалительных клетках и реактивном нормальном эпителии [199]. Некоторые авторы показали, что при фолликулярной карциноме наблюдается слабая экспрессия галектина-3 [91,133,147].
Другой дооперационным метод, Realime PCR, который позволяет определять экспрессию мРНК галектина-3, так же не показал себя надежным в диагностике РЩЖ [99,108,109,114,112]. Возможно, такая ситуация связана с деградацией мРНК [99]. А, возможно, и с тем, что макрофаги и активированные эндотелиальные клетки экспрессируют данный маркер [66].
Н.Ю. Двинских (2010) предлагала использовать галектин-3 совместно с НВМЕ-1 (НВМЕ-1 - антиген мезотелиальных клеток (Hector Battifora Mеsotelial (cell), относится к группе полисахаридов и гликопротеинов, связанных с группами крови) и СК19, так как коэкспрессия этих маркеров позволяет увеличить специфичность метода до 98% [16].
Что касается агрессивности поведения, то ученые из Кореи показали, что отрицательная экспрессия галектина-3 при иммуноцитологическом определении папиллярного РЩЖ связана с лучшими прогностическими параметрами, в отличие от положительной экспрессии (окрашивание считалось положительным, если процент опухолевых клеток, с цитоплазматической экспрессией данного маркера превысил 5%) [61]. Другие исследователи, наоборот, считают, что низкий уровень экспрессии галектина-3 наблюдался при признаках инвазии опухоли и более крупные опухоли имеют так же низкий уровень экспрессии данного маркера. Кроме того, выраженность данного маркера была выше на ранних стадиях папиллярного рака, и интенсивность экспрессии уменьшалась в процессе опухолевой прогрессии [112]. Есть работы, в которых показано отсутствие взаимосвязи агрессивности поведения опухоли и уровня галектина-3 [82].
В США было проведено интересное исследование особенности окрашивания цитокератина-19, галектина-3 HBME1 и фибронектина в участках ЩЖ при тиреоидите Хашимото, в которых были ядерные изменения, характерные для папиллярного РЩЖ. Фокусное окрашивание для галектина-3 наблюдалось в 87%, диффузное - в 100%, позднее при гистологическом исследовании в данных участках были обнаружены очаги рака. Авторы пришли к выводу, что наличие ядерных изменений и иммуноспецифического окрашивания данных маркеров при тиреоидите Хашимото может быть ранним признаком преобразований в папиллярный РЩЖ [120].
Перспективным направлением явилось исследование галектина-3 методом проточной флюороцитометрии и наличия мутации гена BRAF, выявленной методом ПЦР в пунктате из узла ЩЖ, полученном при ТАБ. Специфичность и диагностическая точность указанного метода высока - каждый показатель составляет 95%. Поэтому авторы предлагают использовать данный метод в дооперационной диагностике высокодифференцированного РЩЖ [26]. Однако более широкое внедрение данного исследования пока ограничено его стоимостью и сложностью выполнения. Появились новые методы определения данного маркера, в частности, серологическое определение методом ИФА как более простой и менее дорогостоящий способ [31]. Другие исследования так же показали высокий уровень данного белка в сыворотке крови больных злокачественной патологией ЩЖ [175].
Основные клинические и лабораторные характеристики группы
Когорта пациентов с клиническим диагнозом узловой зоб, у которых проведены: традиционное и жидкостное цитологическое исследование, верификация диагноза по постоперационному гистологическому заключению, представлена 113 пациентами, 101(89%) женщиной и 12(11%) мужчинами. Возрастной диапазон пациентов варьировал от 23 до 82 лет, средний возраст - 52,4 ±13 лет. Основной причиной обращения к врачу явилось случайное выявление узла/узлов ЩЖ при УЗИ (62,3%) (таблица 3).
Чаще пациенты обращались к врачу с жалобами на дискомфорт в области ЩЖ или жалоб не предъявляли (особенно мужчины) см. рисунок 3.
При осмотре было отмечено, что у мужчин чаще, чем у женщин регистрировалась II степень увеличения ЩЖ (66,7% против 31,6%), а у женщин чаще I степень увеличения (64,3% против 25,0%) по классификации ВОЗ 1994г. (Х2 = 5,8, р=0,05; рисунок 4).
По данным УЗ-волюмометрии общий объем органа варьировался от 7 до 345 мл, причем тенденция сохранялась прежняя - у женщин медиана объема ЩЖ была значимо меньше: 20 (14,5-32,9) мл, чем у мужчин - 37,6(17,9-61,5) мл (U=339; р=0,021).
При анализе результатов УЗИ ЩЖ мы отметили следующие дефекты описания УЗ-семиотики ЩЖ: отсутствие данных о контурах железы встречалось в 3 % случаев, не было описания эхогенности в 2% случаев, васкуляризация не была описана в 18% случаев. Что касается описания самого узла, то в 2% случаев не было данных об эхогенности, данных о структуре – в 7 %, не описаны контуры узлового образования в 8% случаев, было указано наличие кальцината, но не указан размер в 8% случаев, не указан тип кровотока в узле - в 37% случаев. Кроме того, нами было отмечено, что врачи УЗ-диагностики только в 47% случаев описывают все 3 размера узла, в 38% указывалось только 2 параметра размера узла ЩЖ, в 18% - только 1 параметр (вероятно, максимальный размер). Также нами было отмечено, что врачи не придерживаются определенной последовательности в указании размеров узла (как, например, при описании размера самой ЩЖ - высота/ширина/длина).
Всем пациентам при наличии показаний проводилось оперативное лечение. Хирургические вмешательства больные проходили на базе 3 медицинских учреждений г. Томска – в отделении опухолей головы и шеи НИИ онкологии; отделении общей хирургии ОГАУЗ ТОКБ, отделении общей хирургии клиник СибГМУ.
Показания для оперативного лечения следующие: 63,2% - подозрение на рак по данным цитологического исследования, признаки компрессии в 12,5% случаев, токсическая аденома - в 5,3%. У 19% пациентов показанием к операции являлась «отрицательная динамика» – рост узла ЩЖ по УЗИ. Преимущественно пациентам выполнялась операция в объеме тотальной или субтотальной тиреоидэктомии (73,9%), реже – гемитиреоидэктомия (14,4%), тотальная тиреоидэктомия с футлярно-фасциальным иссечением клетчатки (ФФИК) или паратрахеальной клетчатки - в 11,7% случаев. Структура гистологических диагнозов представлена на рисунке 5 и таблице 5.
Так на 1-м месте у прооперированных пациентов регистрировался узловой зоб, вторым по частоте диагнозом регистрировался папиллярный РЩЖ. в 22% случаев – фолликулярная аденома, Выявлен 1 случай низкодифференцированного рака и 1 случай медуллярного рака, которые не принимали участие в анализе. Объем операции у пациентов со злокачественной патологией был представлен в основном тотальной тиреоидектомией (51,5%), или тотальной тиреоидэктомией с футлярно-фасциальным иссечением клетчатки (39,4%), гемитиреоидектомия выполнялась в 9,1% случаев.
Гистологическое заключение «узловой зоб» выставлялся по наличию фолликулов, заполненных коллоидом (коллоидный зоб) или солидных структур с формированием мелких фолликулоподобных образований без коллоида или с очень небольшим ее количеством (паренхиматозный зоб). Заключение АИТ ставилось при наличии диффузно-очаговой лимфо плазмоцитарной инфильтрации стромы с образованием лимфоидных фолликулов, и наблюдался в 37 случаях: из них у 13 пациентов как самостоятельный процесс, в 13 - в сочетании с узловым зобом, в 6 случаях сочетался с фолликулярной аденомой, 5 случаях являлся фоном папиллярного рака см. таблицу 4. Заключение фолликулярной аденомы выставлялось при наличии высокодифференцированных фолликулов крупного, среднего калибра, микрофолликулов, наличия четкой капсулы, однотипности строения ткани опухоли, важным признаком являлось отсутствие инвазии опухоли в капсулу и сосуды. Морфологами выделялось 5 типов фолликулярных аденом: микрофолликулярная - 8 случаев, макро-микрофолликулярная в 2 случаях, простая - 8 случаев, трабекулярная - 4, В-клеточная (онкоцитарная) - 3. Случаев фолликулярного рака по данными гистологии не было. Заключение папиллярный рак ставилось в следующей ситуации: при наличии разрастания сосочковых структур, выполненных атипичными тиреоцитами. Клетки, как правило, имели ядерные перемычки, внутриядерные цитоплазматические включения, светлые ядрышки.
Таким образом, папиллярный рак регистрировался по данным гистологического исследования в 32 (28,3%) случаях. В 6 случаях (18,8%) встречался фолликулярный вариант папиллярного рака, в 26 случаях (81,2%) классическая форма. Распределение по полу показало, что злокачественным узловое образование ЩЖ как у женщин (27,7%), так и у мужчин (33,3%) было выявлено статистически одинаково часто (2= 0,166, р=0,683).
Папиллярный рак был классифицирован по стадиям, согласно классификация UICC/AJCC 2002 года (таблица 1) и стадирование рака щитовидной железы по системе символов ТNM (7-е издание, 2010г., таблица 2).
По нашим данным, большинство пациентов с РЩЖ (56,2) (оперировались на I стадии, 18,8% пациентов на II и 26% пациентов на III и IV стадиях (таблица 6).
Пациенты по данным гистологических заключений были разделены на 2 группы – больные с доброкачественным узловым образованием (n=81) и пациенты со злокачественным узловым образованием (n=32). Анализировались особенности клинической картины и лабораторных показателей в каждой из групп (таблица 7).
Возможности иммуноцитохимической детекции молекулярных маркеров Ki-67, NFM, галектина-3 в дооперационной диагностике высокодифференцированного рака щитовидной железы
ИЦХ была проведена 56(49,5% из 113 пациентов) пациентам на материале, взятом при проведении ТАБ-УЗИ, после анализа методом ЖЦ, в случае, если материал был информативным.
На этапе гистологического исследования этим пациентам были выставлены следующие заключения: коллоидный зоб в 24 случаях, АИТ 14 случаев (из них 8 являлось фоном узлового коллоидного зоба), 4 случая фолликулярной аденомы, папиллярный рак - 22 случаев, 16(73%) классический вариант папиллярного рака, и 6(27%) случаев фолликулярный вариант папиллярного рака (Таблица 17).
Распределение по полу в группе пациентов показало, что папиллярный рак как у женщин (40%), так и у мужчин (33%) встречался одинаково часто (2= 0,05, р=0,823).
Папиллярный рак по стадиям, согласно классификации UICC/AJCC 2002 года, был распределен следующим образом: I стадия – 10(45,5%), II стадия – 6(27,3%) случаев, III стадия – 6(27,3 %) случаев.
Путем подсчета процента иммуннопозитивных клеток для Ki-67, NFM, галектина-3 нами было установлено значимое увеличение положительно окрашенных клеток в карциноме ЩЖ только для одного маркера - Ki-67 (таблица 18).
Методом ROC-анализа (площадь под кривой 0,93) был установлен диагностический уровень относительно вероятности обнаружения злокачественного образования ЩЖ - 11% позитивно окрашенных клеток (чувствительность 81,8%, специфичность 80%, точность 81%), а диагностический уровень в 21% иммуннопозитивных клеток для Ki-67 – чувствительностью 72,7%, но более высокой специфичностью 100% и точностью – 85,7%.
Мы определяли корреляцию экспрессии маркеров Ki-67, NFM, галектина-3, выраженной в Histochemical Score (HS) с наличием РЩЖ, так как данный коэффициент отражает не только процент иммуннопозитивных клеток, но и интенсивность окрашивания. HS маркеров NFM и галектина-3 не продемонстрировал значимой корреляции с наличием папиллярного РЩЖ (р=0,2 и р=0,15, соответственно). HS Ki-67 напрямую зависел от присутствия раковых клеток в узле, корреляция была сильная положительная (р 0,05, R=0,8). Данные представлены в таблице 19.
Результаты сравнения медиан HS Ki-67, NFM, галектина-3 представлены ниже. Как видно из таблицы 20, уровень HS Ki-67 в группе пациентов с карциномой ЩЖ был значимо выше, чем в доброкачественных новообразованиях ЩЖ, оценка HS NFM и галектина-3 оказалась незначима для диагностики папиллярного РЩЖ.
При помощи метода бинарной логистической регрессии были проанализированы потенциальные предикторы РЩЖ на основании определения HS Ki-67, галектина-3 и NFM. В результате пошагового отбора в модель не вошли такие показатели, как HS галектина-3 и NFM, так как данные признаки имели низкий уровень значимости (p 0,05), и в полученной формуле не принимали участие. Так как HS Ki-67 коррелировал с риском выявления РЩЖ, то на основании включения только данного маркера и была построена модель, которая позволяет предположить злокачественный процесс (формула):
При p 0,5 –образование, наиболее вероятно, является злокачественным.
Представленная модель продемонстрировала достаточный уровень статистической значимости (X=22,78, р 0,001). Качество построенной модели характеризуют: коэффициент множественной детерминации (R2 Найджелкерка=0,769), критерий согласия Хосмера-Лемешова (X=3,34, р=0,647), коэффициент конкордации – 88,9%, чувствительность – 81,8%, специфичность – 93,8% точность 88,8%, Предсказательная ценность положительного результата 90%, предсказательная ценность отрицательного результата - 88,2%.
Однако с учетом того, что в формулу вошел только один маркер, значимость расчета данного показателя была определна и ROC-анализом. Площадь под кривой составляла 0,96. Отрезной диагностической точкой определен уровень HS Ki-67 35,0, при котором чувствительность анализа белка с помощью ИЦХ аспирата составила 81,8%, специфичность 100%, диагностическая точность - 92,5%.
При учете результатов двух методик – ТЦ и определение HS Ki-67 методом ИЦХ характеристики метода улучшались до 93,3% чувствительности и 100% специфичности, а с использованием метода ЖЦ + определения HS Ki-67 (ИЦХ) - до 100% чувствительности и специфичности.
Мы так же предприняли пoпытку устанoвить вoзмoжнoе наличие связи экспрессии маркерoв Ki-67, NFM, галектина-3 с сoпутствующим аутoиммунным прoцессoм в ЩЖ, нo не oбнаружили статистически значимых различий изучаемых oнкoмаркерoв на фoне АИТ и без негo (таблица 21).
Был прoведен анализ зависимoсти HS маркерoв oт стадии РЩЖ, данные представлены в таблице 22. Значимая пoлoжительная кoрреляция была выявлена между значением HS Ki-67 и стадией РЩЖ, чтo oбъяснимo с тoчки зрения вoзрастания активнoсти прoлиферативнoгo прoцесса при увеличении стадии.
Мы так же сравнили медианы HS маркеров в различных гистологических категориях: в пунктатах из коллоидного зоба, АИТ и папиллярного рака. Медианы показателей представлены на рисунке 6, значимость в таблице 23. При папиллярном раке экспрессия Ki-67 оказалась значимо выше 122,5(32-149,5), чем при коллоидном зобе, при котором экспрессия либо не определялась, либо HS достигал 11(75 перцентиль, р 0,001). Подобная ситуация наблюдалась и в экспрессии галектина-3: при папиллярном раке показатель HS составил 135(29-207,5), при коллоидном зобе значимо ниже - 43(15-72), р=0,039. Однако и при фолликулярной аденоме экспрессия галектина-3 оставалась достаточно высокой (значительно при сравнении с коллоидным зобом). При АИТ уровень HS Ki-67 не определялся вовсе - в отличие от папиллярного рака (U=2, р=0,024), показатели экспрессии других маркеров так же были выше при злокачественном процессе, однако значимость была недостоверна. Не было выявлено значимых различий в уровнях HS маркеров при коллоидном зобе и АИТ. Анализ экспрессии NFM так же показал отсутствие достоверных различий между патологическими процессами.
При анализе выраженности экспрессии белков в узловых образованиях с возрастом пациента, длительностью заболевания, количеством образований, максимальным размером и объемом узла ЩЖ ни одной значимой зависимости выявлено не было (таблица 24).
Значимых корреляций между уровнем HS белков и лабораторными показателями (показателями тиреостата, ОАК, БАК) не получено.
Так же мы проанализировали зависимость экспрессии маркеров между собой и выявили прямую слабую корреляцию между HS Ki-67 и HS галектина-3 (R=0,407, р=0,039), см. таблицу 25. Мы так же предположили, что корреляционные связи между маркерами могут изменяться в зависимости от типа патологического процесса (злокачественного или доброкачественного, или имеющегося сопутствующего аутоиммунного процесса). Действительно, корреляционная взаимосвязь между показателями экспрессии данных белков сохранилась только в тех случаях, где не было сопутствующего АИТ, причем корреляция усилилась – из слабой стала средней силы (R=0,550, р=0,012).
После проведения иммуноцитохимического анализа маркеров-кандидатов опухолевого процесса в пунктатах из узловых образований ЩЖ мы сделали следующие выводы:
1. Значимым для диагностики папиллярного рака щитовидной железы оказалось определение экспрессии белка Ki-67: Показатель HS Ki-67 обладает точностью 92,5% (чувствительность 81,8%, специфичность 100%) и улучшает метод жидкостной цитологии до 100% в диагностике карциномы железы на дооперационном этапе;
2. Определение экспрессии галектина3, NFM методом иммуноцитохимии оказалось не значимым в дооперационной диагностике папиллярного рака щитовидной железы;
3. Коэффициент пролиферации, выраженный в HS Ki-67, коррелировал со стадией опухолевого процесса в щитовидной железе
Возможности метода Realime PCR в дооперационной диагностике узловой патологии щитовидной железы
На данном этапе в исследование включено 55 пациентов с клиническим диагнозом узловой/многоузловой зоб. Материалом служил пунктат, взятый при проведении ТАБ-УЗИ, который был помещен в эпиндорф c раствором Preservative Solution Novaprep, в последующем разделенный для проведения ЖЦ с ИЦХ и ПЦР. На пункционном материале проводился количественный анализ мРНК галектина-3, Ki-67, UbcH10, HMGA-2 при помощи обратной транскрипции и ПЦР в режиме реального времени. Результаты ПЦР анализировали с помощью метода максимума второй производной (Second Derivative Maximum method), т.е. определения значения некоторой характеристической точки Cp (Crossing point) на графике накопления ДНК по форме кривой. Расчеты уровней относительной экспрессии исследуемых генов производили с помощью формулы: 2-Cp ( Cp = Cp интересующего гена - Cp гена «внутреннего контроля»). Полученное число для удобства работы было умножено на 1000.
Распределение пациентов по полу выглядело следующим образом: 47(85,5%) женщин, 8 (14,5%) мужчин. Средний возраст пациентов составил 52,1 года (от 23 до 82 лет). Результаты окончательного диагноза выставлялись согласно гистологическому заключению (таблица 26). Морфологами выделялось 5 типов фолликулярных аденом: микрофолликулярная - 3 случая, макро-микрофолликулярная в 2 случаях, простая - 5 случаев, трабекулярная - 3, В-клеточная (онкоцитарная) - 2. Случаев выявления фолликулярного рака по данным гистологического исследования не было. В 4(20%) из 20 случаев встретился фолликулярный вариант папиллярного рака. Наиболее частой патологией был папиллярный рак (36,4%) и узловой зоб (30,9%), треть патологии - фолликулярная аденома, АИТ встречался как самостоятельное заболевание в 5,5% случаев (таблица 27).
Папиллярный рак по стадиям, согласно классификации UICC/AJCC 2002г., был распределен следующим образом: I стадия – 11(57%), II стадия – 4(21,1%) случая, III стадия – 4(21,1%) случая.
Метод Realime PCR продемонстрировал, что злокачественные и доброкачественные узловые образования значимо различались друг от друга по уровню накопления мРНК гена UbcH10, содержание же мРНК остальных генов не позволяло отличить одну патологию от другой (таблица 28).
Методом ROC-анализа установлено, что количество мРНК UbcH10 выше 8,24 позволяет выявить папиллярный рак в ЩЖ. Чувствительность метода составила 68,4%, специфичность 68,6%, площадь под кривой - 0,7.
Обнаружено, что мРНК ни одного из маркеров значимо не коррелировал со стадией РЩЖ (таблица 29).
Был проведен анализ мРНК генов в зависимости от гистологической группы: при коллоидном зобе, аутоиммунном тиреоидите, фолликулярной аденоме и папиллярном раке. Результаты анализа представлены на рисунке 7 и таблицах 31-36
Уровень мРНК Ki-67 оказался наиболее высоким при коллоидном зобе, особенно в сравнении с папиллярным раком, р=0,042.
Содержание мРНК UbcH10 было выше при папиллярном раке, чем при аденоме (U= 75, р=0,019; таблица 30). Методом ROC- анализа было установлено, что отрезная точка уровня мРНК UbcH10 8,24 позволяет дифференцировать папиллярный рак от фолликулярной аденомы, с чувствительностью метода 68,4%, специфичностью 86,7%, площадь под кривой 0,74.
Нами так же былo сделанo предпoлoжение o вoзмoжных значимых различиях урoвня маркерoв в пунктатах щитoвиднoй железы при фoлликулярнoй аденoме и фoлликулярнoм варианте папиллярнoгo рака, дифференциальная диагнoстика кoтoрых затруднительна при прoведении традициoннoгo цитoлoгическoгo исследoвания, oднакo в дальнейшем эту теoрию мы не пoдтвердили (таблица 37).
Было замечено, что в образцах с классической формой папиллярного рака уровень мРНК галектина-3 был значимо выше 54,9(48,8-125,7), чем при фолликулярном варианте 43,1(1,7-48,4), U=8, р=0,028 (таблица 38).
Была проверена гипотеза о прогрессивном увеличении уровня мРНК генов по мере роста тяжести патологического процесса – от доброкачественного образования до аденомы и рака. Ниже (таблица 39) представлены показатели медианы мРНК исследуемых маркеров при доброкачественном процессе (коллоидном зобе и АИТ), фолликулярной аденоме и папиллярном раке.
Прoгрессивнoе увеличение мРНК oт дoбрoкачественнoгo прoцесса дo карцинoмы былo oбнаруженo тoлькo для убиквитина, oднакo эта кoрреляция не являлась значимoй. Пoдoбнoгo увеличения мРНК oстальных генoв пo мере вoзрастания тяжести патoлoгическoгo прoцесса выявленo не былo.
Анализ экспрессии генов не показал достоверных различий в узловых образованиях, протекающих с АИТ и без фонового воспалительного процесса (таблица 40).
Корреляционный анализ позволил обнаружить, что мРНК маркеров не зависело ни от возраста пациента, ни от длительности заболевания, ни от размера узлового образования. В таблице 41 представлен коэффициент корреляции Спирмена для непараметрических величин и уровень р.
При проведении теста на корреляцию мРНК маркеров с лабораторными показателями крови (уровнем тиреоидного профиля, показателями ОАК, БАК) была обнаружена отрицательная слабая корреляция между мРНК Ki-67 и уровнем гемоглобина (R=-0,395, р= 0,009), средняя отрицательная корреляция между тем же мРНК того же маркера и уровнем эритроцитов в крови пациента (R= -0,742, р=0,004) слабая отрицательная корреляция между мРНК HMGA и уровнем тромбоцитов (R= -0,307, р=0,034), отрицательная средняя корреляция между мРНК убиквитина и св.Т4 (R= -0,5, р=0,049; таблицы 42-44).
Корреляционный анализ в парах маркеров выявил значимую слабую положительную зависимость между мРНК UbcH10 и Ki-67, HMGA-2 и Ki-67, галектином-3 и HMGA-2, прямую корреляционную зависимость средней силы между мРНК HMGA-2 и UbcH10 (таблица 45).
В подгруппе пациентов с РЩЖ сохраняется прямая корреляция между мРНК HMGA-2 и галектина-3, но из корреляции слабой силы по сравнению с общей группой пациентов, становится средней силы, прямая взаимосвязь также сохраняется на прежнем уровне между уровнем HMGA-2 и UbcH10. Теряется зависимость между убиквитином и Ki-67, HMGA-2 и Ki-67 (таблица 45).
При анализе подгруппы пациентов с доброкачественной патологией в щитовидной железе в сравнении с общей группой - значимая слабая корреляционная связь сохранилась между UbcH10 и Ki-67, HMGA-2 и Ki-67, средней силы - между UbcH10 и HMGA-2, значимой корреляции между мРНК галектина-3 и другими маркерами выявлено не было.
Нами выдвинуто предположение, что корреляции между маркерами могут отличаться и в зависимости от имеющегося сопутствующего аутоиммунного процесса. Действительно, при сопутствующем АИТ была найдена только одна значимая прямая корреляционная зависимость средней силы: между мРНК Ki-67 и HMGA-2. В то время как без аутоиммунного процесса корреляционная зависимость полностью сохраняется, как и в общей группе пациентов.
В результате проведения Realime PCR в пунктатах из узлов щитовидной железы мы пришли к следующим результатам:
1. Диагностическая точность анализа мРНК UbcH10 методом Realime PCR в дифференциальной диагностике доброкачественных и злокачественных узловых
образований щитовидной железы не превышает 69% (чувствительность 68,4%, специфичность 68,6%);
2. Злокачественные узловые образования щитовидной железы не отличаются от доброкачественных по количеству мРНК галектина-3, Ki-67, HMGA-2;
3. Прогрессивное увеличение мРНК от доброкачественного процесса до карциномы было обнаружено только для убиквитина, однако эта корреляция не являлась значимой. Подобного увеличения мРНК остальных генов по мере возрастания тяжести узлового патологического процесса в щитовидной железе выявлено не было;
4. Корреляционный анализ не продемонстрировал зависимости мРНК маркеров ни от возраста пациента, ни от длительности заболевания, ни от размера узлового образования.