Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Обзор литературы 14
1.1 Биосинтез и метаболизм стероидных гормонов 14
1.2 Регуляция секреции стероидных гормонов в надпочечниках 18
1.3 Регуляция секреции половых стероидных гормонов в яичниках 20
1.4 Этиопатогенез надпочечниковой гиперандрогении 20
1.5 Этиопатогенез овариальной гиперандрогении 25
1.6 Метаболизм половых стероидных гормонов в жировой ткани 27
1.7 Идиопатический гирсутизм 29
1.8 Клинические проявления синдрома гиперандрогении 32
1.9 Диагностика синдрома гиперандрогении 34
1.9.1 Хроматографические методы 37
1.10 Лечение 41
1.10.1 Лечение бесплодия при синдроме поликистозных яичников 46
1.10.2 Лечение неклассической формы врожденной дисфункции коры надпочечников 47
Глава 2 Материалы и методы исследования 48
2.1 Общая характеристика обследованных пациентов 48
2.2 Клинико-анамнестическое обследование 49
2.3 Пероральный глюкозотолерантный тест 51
2.4 Исследование функционального состояния систем гипофиз – кора надпочечников и гипофиз – яичники 52
2.4.1 Методы иммуноанализа 52
2.4.2 Исследование стероидных гормонов методом газовой хромато-масс-спектромерии . 54
2.4.3 Функциональные пробы 59
2.5 Ультразвуковое исседование 60
2.6 Методы статистического анализа данных 60
Глава 3 Результаты собственных исследовании 62
3.1 Классический СПКЯ у женщин с ожирением 62
3.1.1 Диагностика классического СПКЯ 64
3.1.2 Определение стероидных гормонов у больных классическим СПКЯ методом газовой хромато-масс-спектрометрии 66
3.2 Неклассический СПКЯ у женщин с ожирением 71
3.2.1 Диагностика неклассического СПКЯ 72
3.2.2 Определение стероидных гормонов у больных неклассическим СПКЯ методом газовой хромато-масс-спектрометрии 75
3.3 Сравнительный анализ стероидных профилей мочи больных классическим и неклассическим СПКЯ 79
3.4 Больные неклассической формой врожденной дисфункции коры надпочечников вследствие дефекта 21-гидроксилазы 81
3.4.1 Диагностика неклассической формы врожденной дисфункции коры надпочечников вследствие дефекта 21-гидроксилазы 82
3.4.2 Определение стероидных гормонов у больных неклассической формой врожденной дисфункции коры надпочечников вследствие дефекта 21-гидроксилазы методом газовой хромато-масс-спектрометрии 85
3.5 Сравнительный анализ стероидных профилей мочи больных НФ ВДКН вследствие дефекта 21-гидроксилазы и СПКЯ 92
3.6 Больные идиопатическим гирсутизмом 95
3.6.1 Диагностика идиопатического гирсутизма 96
3.6.2 Определение стероидных гормонов у больных идиопатическим гирсутизмом методом газовой хромато-масс-спектрометрии 97
Глава 4 Обсуждение результатов 102
Выводы 110
Практические рекомендации 112
Перспективы дальнеишеи разработки темы 113
Список сокращении 114
Список литературы 117
- Этиопатогенез надпочечниковой гиперандрогении
- Исследование стероидных гормонов методом газовой хромато-масс-спектромерии
- Определение стероидных гормонов у больных неклассическим СПКЯ методом газовой хромато-масс-спектрометрии
- Определение стероидных гормонов у больных идиопатическим гирсутизмом методом газовой хромато-масс-спектрометрии
Этиопатогенез надпочечниковой гиперандрогении
Врожденная дисфункция коры надпочечников (ВДКН) занимает основное место в причинах надпочечниковой гиперандрогении. Заболевание носит генетическую этиологию и имеет аутосомно-рецессивный тип наследования [49, 92, 187]. Патология обусловлена ферментативным дефектом в синтезе стероидов, ответственного за образование кортизола [16].
В настоящее время выделяют семь видов ферментативных нарушений, приводящих к ВДКН. Липоидная гиперплазия надпочечников (синдром Прадера), дефицит 20, 22-десмолазые, дефицит 3-гидроксистероиддегидрогеназые, дефицит 17-гидроксилазы/17,20-лиазые, дефицит 21-гидроксилазые, дефицит 11-гидроксилазые, дефицит оксидоредуктазые [25].
Дефицит ферментов стероидогенеза, приводит к снижению выработки кортизола. Недостаток кортизола по механизму отрицательной обратной связи приводит к повышенной секреции кортикотропин-рилизин гормона и АКТГ. Избыточная стимуляция коры надпочечников адренокортикотропным гормоном приводит к ее гипертрофии, а затем и к гиперплазии коркового вещества надпочечников. В результате повышенной стимуляции стероидогенеза со стороны АКТГ происходит накопление стероидов, образующихся выше ферментативного дефекта и накоплению стероидов, в синтезе которых поврежденный фермент не участвует [8]. Ферментативные дефекты во всех формах ВДКН могут быть частичными или полными, что отражается более широким спектром клинических проявлений. Наиболее тяжелыми формами являются так называемые классические, которые легче диагностируются. И наоборот, более легкие формы или неклассические, часто трудно диагностировать, или могут быть не выявлены [180]. Наиболее распространенной формой ВДКН является дефект 21-гидроксилазы, на долю которого приходится более 90% всех случаев. ВДКН вследствие дефекта 21-гидроксилазы делится на неклассическую и классическую, которая может быть вирильной, с сохранением минералокортикоидной функции и сольтеряющей [16]. ВДКН вследствие дефекта 21-гидроксилазы – это расстройство обусловлено мутациями в гене CYP21A2, который расположен на хромосоме 6p21 [187]. Делеции и/или конверсии всего гена CYP21A2 и/или точечные мутации составляют около 95% всех мутации, вызывающие дефицит 21-гидроксилазы [92]. Неклассическая форма врожденной дисфункции коры надпочечеников (НФ ВДКН) впервые была описана в 1957 году Декур и соавт. [88]. В результате дефекта 21-гидроксилазы на этапе выше ферментативного блока накапливаются стероиды предшественники, которые используются для синтеза андрогенов. 17-гидроксипрогестерон (17-ОНП) является основным субстратом для фермента 21-гидроксилазы, повышенная концентрация 17-ОНП традиционно используется для диагностики и мониторинга заболевания. Кроме того, блок на уровне 21-гидроксилазы способствует накоплению других С21 стероидов. Избыток 17-ОНП в результате дефицита 21-гидроксилазы используется для синтеза андрогенов, таких как тестостерон и дигидротестостерон. 21-гидроксилаза опосредствует превращение 17-гидроксипрегненолона в дегидроэпиандростерон (5 путь) и 17-ОНП в андростендион (путь 4). Каталитическая активность 17, 20-лиазы, примерно в 100 раз больше, для реакций по 5 пути, по сравнению с реакциями по 4 пути, что объясняет накопление 17-гидроксипрогестерона при дефиците 21-гидроксилазы. При повышенной концентрации 17-ОНП подвергается 11-гидроксилированию, в результате которого образуется 21-дезоксикортизол, он является дополнительным диагностическим маркером заболевания. При нормальных концентрациях 17-ОНП образование 21-дезоксикортизола минимально (рисунок 1) [21, 46, 146]. Совсем недавно выявлен третий «дополнительный» путь синтеза андрогенов из 17-гидроксипрогестерона у пациентов с дефицитом 21-гидроксилазы. Данный путь был описан около десять лет назад у кенгуру таммар-валлаби, в яичниках которых синтезируется 5-андростан-3, 17-диол, а не тестостерон, минуя обычные андрогены, в качестве промежуточных продуктов. Этот путь может способствовать вирилизации женских плодов с ВДКН [179]. Kamrath и его коллеги были первыми, кто продемонстрировали этот дополнительный путь синтеза андрогенов у 142 больных с ВДКН в возрасте от 1 до 25 лет, по сравнению с группой контроля, которую составили 138 здоровых человек такого же возраста [120]. Основным метаболитом 17-ОНП является прегнантриол, образование которого осуществляется через 17-гидроксипрегнанолон [21, 46, 146].
Клинически избыток андрогенов проявляется у новорожденных девочек в виде вирилизации гениталий. Для пациентов с НФ ВДКН не характерна надпочечниковая недостаточность, избыток андрогенов проявляется, как правило, в виде преждевременного пубархе, гирсутизма, акне, нерегулярных менструациях, в различных возрастных группах [180].
Второй формой ВДКН по частоте встречаемости является дефицит 11-гидроксилазы (CYP11B1), который составляет до 5-8% всех случаев ВДКН в некоторых популяциях, хотя распространенность этого заболевания среди населения в целом до сих пор доподлинно неизвестна. Ее показатель оценивается 1:100 000 новорожденных в общей популяции, в 20 раз чаще встречается в популяции Марокканских евреев. 11-гидроксилаза катализирует превращение 11-дезоксикортикостерона и 11-дезоксикортизола в кортикостерон и кортизол, соответственно. Как и при дефиците 21-гидроксилазы, у пациентов выявляется снижение синтеза кортизола и повышена продукция надпочечниковых андрогенов. В отличие от дефицита 21-гидроксилазы характерной чертой классических форм дефицита 11-гидроксилазы являются артериальная гипертензия и реже гипокалиемия в связи с минералокортикоидным действием 11-дезоксикортикостерона, которая проявляется у двух третей пациентов часто с детского возраста. Пациенты с дефицитом 11-гидроксилазы менее склонны к надпочечниковым кризам, чем пациенты с дефицитом 21-гидроксилазы. Неклассические формы дефицита 11-гидроксилазы трудно отличить клинически от неклассической формы дефицита 21-гидроксилазы.
Третья форма ВДКН дефицит 3-гидроксистероиддегидрогеназы/тип изомеразы 2 (3HSD2) характеризуется как минерало – так и глюкокортикоидной недостаточностью. Выделяют 2 типа гомологичных ферментов 3HSD: Тип 1, обнаруживается в плаценте и периферических тканях (коже, предстательной железы и молочных железах), и тип 2, выявляется в надпочечниках и гонадах. Снижение активности 3HSD2 приводит к минералокортикоидной и глюкокортикоидной недостаточности и блокирует стероидогенез до дегидроэпиандростерона. В периферических тканях, содержащих 3HSD1 фермент, ДЭА метаболизируется в андрогены, которые вызывают легкую вирилизацию у новорожденных девочек, например, незначительное увеличение клитора без слияния лабиоскротальных складок. Неклассическую форму дефицита 3HSD сложно отличить клинически от неклассических форм дефицита 21-гидроксилазы и 11-гидроксилазы или синдрома поликистозных яичников, так же имеющих гирсутизм и олигоменорею.
Дефицит 17OHD/17, 20-лиазы (CYP17A1) встречается редко, причем большинство случаев описывают в Бразилии и Азии. CYP17A1 требуется для синтеза кортизола и андрогенов. Для синтеза достаточного количества кортикостерона, чтобы заменить кортизол, значительно повышается 11-дезоксикортикостерон, и у пациентов развивается артериальная гипертензия, гипокалиемия и гипогонадизм. Пациенты с кариотипом 46, XY и 46, XX имеют женские гениталии. Частичные дефекты CYP17A1 были обнаружены у женщин с неразвитыми молочными железами и/или нарушением менструального цикла, и у мужчин с неразвитыми наружными половыми органами, отсутствием вторичных половых признаков, а также гинекомастией в период полового созревания. Неклассическая форма не была описана. Предположительно, у пациентов с очень легким дефектом или неклассической формой 17OHD может быть низкорениновая артериальная гипертензия и первичный гипогонадизм [180].
Исследование стероидных гормонов методом газовой хромато-масс-спектромерии
Всем женщинам, включенным в исследование, проводилась оценка стероидных профилей мочи (СПМ) методом ГХ-МС. Сбор мочи осуществлялся в течение 24 часов, в фолликулярную фазу менструального цикла, в сухие чистые контейнеры с крышкой, контейнеры хранились в прохладном месте, защищенном от прямых солнечных лучей. После окончания сбора, полученная моча тщательно перемешивалась, порция мочи помещалась в пластиковые микропробирки, сразу замораживалась. Микропробирки с мочой хранились при температуре менее – 20 С до проведения исследования. Относительные времена удерживания определяемых стероидов и референсные значения для здоровых женщин представлены в таблице 4.
Пробоподготовка состояла из гидролиза коньюгатов, жидкостной экстракции аналитов и дериватизация. Гидролиз осуществлялся в течение 48 часов при температуре 37 С. Для реакции гидролиза использовался фермент cульфатаза выделенная из Helix pomatia, которая воздействует, и на глюкoронидные формы кортикостероидов, и на сульфатные формы андрогенов. Стероиды извлекались из мочи с помощью жидкостной экстракции, благодаря чему за короткое время были получены достаточно чистые образцы. К aликвoте 5 мл мочи с рН 4,6, которая подвергалась анализу, добавляли 2,5 мл фермeнтного рaствора, изготовленного заранее из натриевой сoли аскорбинoвой кислoты и порoшка сульфaтaзы (фирма «Sigmа-Аldrich», СШA), после чего рaстворяли в растворе aцетатного буфера (фирма «НевaРеaктив», PФ) и в течение 1 чaса настаивaли. Затем данную смесь инкубировали при температуре 37 С в течение 64 часов. Экстрацию стероидов проводили 25 мл хлороформа. Верхний водный слой, который образовался был удален, а экстракт дважды промыт 8 мл воды и 0,1 М раствора NaOH. Экстракт, который был получен высушивали, а затем растворяли его в 1 мл этанола (фирма «Poссбио», РФ). После чего 500 мкл экстрaкта в этaноле отбирaли и добавляли к нему стандартный раствор cтигмaстерола и 5-андростaндиола 25 мкл, с концентрацией 100 мкл/мл, который является внутренним стaндартом. Полученная смесь упaривалась досуха, ее раствоpяли в 1 мл этилaцетата (фирма «Экoс-1», PФ) и добaвляли 200 мкл 8% вoдного раствора NаHCO3 (фирма «Нева Pеактив», PФ). Перемешав, вoдную фрaкцию удаляли, а смесь промывали в 200 мкл воды двaжды. Смесь отставивалась, далее верхний органический слой помещали в сухую чистую пробирку с притертой пробкой и выпаривали досуха. Сухой остаток смешивала с 160 мкл 2% раствора метоксиaмина (фирма «Sigmа-Aldrich», США) в пиридине (фирма «Нева Реактив», РФ), закрывали пробирку и помещали в ультразвуковую ванну, после чего в водяную ванну при 60 C на 1,5 часа. К полученной смеси добавляли 500 мкл тримeтилcилилимидазола (фирма «Sigmа-Aldrich», США), смешивали и выдерживали при 100С в течение 12 часов. Далее полученную смесь выпаривали, чтобы удалить пиридин, после чего сразу добавляли 1 мл циклогексана (фирма «Экос-1», РФ). Триметилcилилимидазол не подвергшийся реакции удаляли из смеси двукратным промыванием водой. Верхний органический слой переносили в микрофлакон для ввода пробы и дальнейшего хромато-масс-спектрометрического анализа. Стероидные профили мочи определяли в НИЛ хроматографии СЗГМУ им. И.И.Мечникова с использованием газового хромато-масс-спектрометра SHIMADZU GCMS – QP2010 ULTRA ресурсного центра СПб ГУ «Методы анализа состава веществ». Данным методом идентифицировано 68 стероидов.
Определение стероидных гормонов у больных неклассическим СПКЯ методом газовой хромато-масс-спектрометрии
Анализируя результаты СПМ, полученных методом ГХ-МС, у больных неклассическим СПКЯ выявлена повышенная экскреция с мочой метаболитов андростендиона: An и этиохоланолона (Et), DHEA и его метаболитов: dA2-17, 16-DHEA, андростентриола (dA3) и 16-oxo-dA2 в сравнении с пациентами с ожирением, что указывает на повышение андрогенной активности, а также получено увеличение 5-еnе-прегненов (dP3 и 16-OH-dP2) (таблица 14).
У больных неклассическим СПКЯ, кроме этих стероидов, были определены 16-ОН-прегнандиол (16Р2) – 81 (63-149) мкг/24 ч и неклассические 5-еnе-прегнены: 16-ОН-прегненолон (16dP) – 55 (33-119) мкг/24 ч, 21dP 24 (17-124) мкг/24 ч и 3,16,20-прегнентриол – 135 (105-228) мкг/24 ч, не обнаруженные у здоровых женщин, пациентов с ИГ, с ожирением и классическим СПКЯ. Полученные данные указывают на повышение андрогенной активности коры надпочечников и нарушения метаболизма прегнанолона и прегненолона, связанные с усилением 16-гидроксилирования у больных неклассическим СПКЯ.
Экскреция с мочой ТНS, тетрагидрометаболитов кортизона (THE, аlloHE), кортизола (THF, аlloHF) и кортикостерона (THB, аlloHB), - и -кортолонов была увеличена в сравнении со здоровыми лицами, что является лабораторным признаком повышенной глюкокортикоидной активности коры надпочечников за счет активных и неактивных метаболитов глюкокортикоидов у женщин с неклассическим СПКЯ (таблица 15).
Повышение соотношений An/Et, 11-ОН-An/11-ОН-Et, alloHB/THB и alloHF/THF у больных неклассическим СПКЯ в сравнении со здоровыми лицами свидетельствует об увеличении активности фермента 5-редуктазы (таблица 16).
Соотношения THF/THE, (THF+alloHF)/THE и (THF+alloHF+-cortol+-cortol)/(THE+alloHE+ -cortolon+- cortolon) не отличались от здоровых лиц и больных ожирением (таблица 16).
У больных неклассическим СПКЯ по данным, полученным методом ГХ-МС, выявлено увеличение андрогенной активности, повышение экскреции с мочой метаболитов активных и неактивных глюкокортикоидов, нарушения метаболизма прегненов, а также получены 4 лабораторных признака увеличения активности фермента 5-редуктазы.
Определение стероидных гормонов у больных идиопатическим гирсутизмом методом газовой хромато-масс-спектрометрии
Анализируя метаболизм андрогенов, полученных методом ГХ-МС, у женщин с ИГ в сравнении со здоровыми лицами выявлена повышенная экскреция с мочой метаболитов DHEA (16-ОН-DHEA и dA2-17) и метаболита андростендиона (11-ОН-An), которые обладают низкой андрогенной активностью (таблица 30).
Кроме андрогенов у женщин с ИГ была увеличена экскреция с мочой Р3 и соотношение (ТНF+alloHF+THE) / Р3, которые являются признаками недостаточности 21-гидроксилазы (таблицы 31 и 32). Однако соотношение (ТНF+alloHF+THE)/ Р3 у больных ИГ было больше 2,2, а экскреция 11-охо-Р3 с мочой и соотношение (ТНF+alloHF+THE)/11-охо-Р3, которые являются основными диагностическими маркерами НФ ВДКН вследствие 21-гидроксилазы, у женщин с ИГ не отличались от здоровых лиц. Данные показатели, а также соотношения (ТНF+alloHF+THE)/17Р и (ТНF+alloHF+THE)/Р3 были больше, чем у больных НФ ВДКН вследствие дефекта 21-гидроксилазы (таблица 32).
Таким образом, увеличение только экскреции с мочой Р3 при нормальных показателях других маркеров дефекта 21-гидроксилазы не является диагностическим критерием и может приводить к гипердиагностике НФ ВДКН вследствие дефекта данного фермента.
Повышение соотношений alloTHB/THB и alloTHF/THF свидетельствует об увеличении активности фермента 5-редуктазы у больных ИГ (таблица 31).
На основании данных которые были получены путем сбора анамнеза, физикального осмотра, инструментальных методов исследования и результатов лабораторного обследования у женщин с ИГ выявлено повышение андрогенной активности за счет увеличения уровня андрогенов с низкой биологической активностью и искючены основные признаки дефекта 21-гидроксилазы. Получены 2 биохимических признака увеличения активности фермента 5-редуктазы, что играет основную роль в развитии андрогенной дермопатии у пациенток с ИГ.