Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Обзор литературы 15
1.1 Этиология и патогенез эндогенного гипекортицизма 15
1.1.1 Биосинтез гормонов в коре надпочечников 15
1.1.2 Этиология эндогенного гиперкортицизма 18
1.1.3 Патогенез эндогенного гиперкортицизма 19
1.2 Классификация гиперкортицизма 22
1.2.1 АКТГ зависимый эндогенный гиперкортицизм 23
1.2.2 АКТГ независимый гиперкортицизм 24
1.3 Клинические проявления эндогенного гиперкортицизма 25
1.4 Показания к диагностике гиперкортицизма 27
1.4.1 Ожирение 27
1.4.2 Артериальная гипертензия 31
1.4.3 Остеопороз 31
1.4.4 Инциденталома надпочечников 33
1.5 Методы диагностики различных форм эндогенного гиперкортицизма 34
1.5.1 Определение уровня свободного кортизола в слюне 37
1.5.2 Определение экскреции свободного кортизола с суточной мочой 38
1.5.3 Функциональные тесты с дексаметазоном 39
1.5.4 Проба дексаметазон/КТРГ 40
1.5.5 Селективный забор крови из нижних каменистых синусов 40
1.5.6 Хроматографические методы диагностики эндогенного гиперкортицизма 41
1.6 Методы лечения различных форм эндогенного гиперкортицизма 44
1.6.1 Лечение синдрома Кушинга надпочечникового генеза 44
1.6.2 Лечение автономной гиперсекреции кортизола 45
1.6.3 Лечение адренокортикальной карциномы 45
1.6.4 Лечение синдрома Кушинга гипофизарного генеза 46
1.6.5 Лечение эктопического синдрома Кушинга 49
Глава 2 Материал и методы исследования 50
2.1 Характеристика групп обследованных пациентов 50
2.2 Лабораторные методы исследования 52
2.2.1 Биохимические методы исследования 52
2.2.2 Определение гормонов в биологических жидкостях 53
2.2.3 Определение уровня свободного кортизола в слюне 54
2.2.4 Функциональные пробы 55
2.3 Хроматографические методы исследования 56
2.3.1 Метод высокоэффективной жидкостной хроматографии 56
2.3.2 Газовая хромато-масс-спектрометрия 58
2.4 Инструментальные методы исследования 62
2.5 Хирургическое лечение 64
2.6 Гистологическое исследование 65
2.7 Наблюдение 66
2.8 Методы статистического анализа данных 66
Глава 3 Результаты собственных исследовании 68
3.1 Характеристика больных алиментарным ожирением 68
3.1.1 Клиническая характеристика больных ожирением 68
3.1.2 Результаты лабораторного обследования больных ожирением 70
3.2 Характеристика больных субклиническим синдромом Кушинга 76
3.2.1 Клиническая характеристика больных субклиническим синдромом Кушинга 76
3.2.2 Результаты лабораторного обследования больных субклиническим синдромом Кушинга 79
3.3 Характеристика больных синдромом Кушинга надпочечникового генеза 85
3.3.1 Клиническая характеристика больных с синдромом Кушинга надпочечникового генеза 85
3.3.2 Результаты лабораторного обследования больных синдромом Кушинга надпочечникового генеза 88
3.4 Характеристика больных синдромом Кушинга гипофизарного генеза 93
3.4.1 Клиническая характеристика больных синдромом Кушинга гипофизарного генеза 93
3.4.2 Результаты лабораторного обследования больных синдромом Кушинга гипофизарного генеза 95
3.5 Дифференциальная диагностика алиментарного ожирения и субклинического синдрома Кушинга с ожирением 101
3.5.1 Сравнительный анализ клинических данных больных алиментарным ожирением и больных субклиническим синдромом Кушинга с ожирением 101
3.5.2 Сравнительный анализ данных лабораторного обследования больных алиментарным ожирением и больных субклиническим синдромом Кушинга с ожирением 103
3.6 Дифференциальная диагностика больных синдромом Кушинга надпочечникового генеза и синдромом Кушинга гипофизарного генеза с больными алиментарным ожирением 109
3.6.1 Сравнительный анализ клинических данных исследуемых групп больных 109
3.6.2 Сравнительный анализ данных лабораторного обследования исследуемых групп больных 111
3.7 Дифференциальная диагностика синдрома Кушинга надпочечникового генеза и синдрома Кушинга гипофизарного генеза 118
3.7.1 Сравнительный анализ клинических данных исследуемых больных 118
3.7.2 Сравнительный анализ данных лабораторного обследования исследуемых больных 120
Глава 4 Обсуждение результатов 129
Выводы 140
Практические рекомендации 142
Перспективы дальнейшей разработки темы 143
Список сокращении 144
Список литературы 146
- Ожирение
- Газовая хромато-масс-спектрометрия
- Результаты лабораторного обследования больных синдромом Кушинга надпочечникового генеза
- Сравнительный анализ данных лабораторного обследования исследуемых групп больных
Введение к работе
Актуальность темы исследования
Эндогенный гиперкортицизм (синдром Кушинга) – эндокринная патология, в основе которой лежит длительное воздействие избытка глюкокортикоидных гормонов. Синдром Кушинга объединяет симптомы и признаки действия высоких концентраций свободных глюкокортикоидных гормонов (Кроненберг Г.М. и соавт., 2010). Распространенность эндогенного гиперкортицизма среди пациентов с артериальной гипертензией, плохо контролируемым сахарным диабетом и остеопорозом варьирует от 2 до 9% (Catagri B. et al., 2003; Omura M. et al., 2004; Trifanescu R., et al. 2014). Диагностика, дифференциальная диагностика, лечение эндогенного гиперкортицизма являются актуальными вопросами современной клинической эндокринологии. Несмотря на большие возможности в верификации заболеваний надпочечников, эндогенный гиперкортицизм остается одним из наиболее сложных для диагностики заболеванием (Arnaldi G. et al., 2004; Varughese A.G. et al., 2014). Эндогенный гиперкортицизм гипофизарного генеза или надпочечникового генеза и ожирение имеют схожие клинические проявления и характеризуются тяжелыми метаболическими изменениями, связанными с нарушением углеводного и липидного обменов. Определение экскреции свободного кортизола с мочой, свободного кортизола в слюне, адренокортикотропного гормона, уровня кортизола в крови в динамике проведения пробы с дексаметазоном являются стандартными тестами, используемыми в диагностике синдрома Кушинга (Mericq M.V., Cutler G.B. Jr., 1998; Roelfsema F. et al., 2014). Принято считать, что повышение экскреции свободного кортизола с мочой определяется при всех формах эндогенного функционального и органического гиперкортицизма (Murphy B.E.P., 1999). Исследователи отмечают нарушение суточного ритма секреции кортизола у 66,1% больных ожирением и у пациентов с депрессией (Nieman L.K. et al., 2008). Дифференциальная диагностика синдрома Кушинга, ассоциированная с определением генеза заболевания, предполагает проведение сложной методики селективного забора крови из нижних каменистых синусов для определения уровня адренокортикотропного гормона (Isidori A.M., Lenzi A., 2007). Недостаточная информативность перечисленных методов исследования затрудняет дифференциальную диагностику различных типов эндогенного гиперкортицизма.
Особую сложность представляет диагностика заболеваний коры надпочечников с субклиническим течением (Nieman L.K. et al., 2008). По данным литературы у 12-16% больных со случайно выявленными образованиями коры надпочечников встречается субклинический синдром
Кушинга (автономная гиперсекреция кортизола). В настоящее время не существует консенсуса по биохимическим диагностическим критериям субклинического синдрома Кушинга. Диагностика заболевания вызывает определенные трудности и требует изучения не только секреции кортизола, но и промежуточных продуктов стероидогенеза (Penning T.M. et al., 2010). В связи с этим представляется актуальной разработка информативных биохимических критериев автономной гиперсекреции кортизола. Функциональные классические тесты, основанные на методах иммуноанализа, могут давать как ложноположительные, так и ложноотрицательные результаты. Существующие в настоящее время клинико-лабораторные технологии определения стероидных профилей не адаптированы к диагностике субклинических форм заболеваний гипофизарно-надпочечниковой системы. Особое значение для диагностики заболеваний надпочечников приобретают хроматографические методы анализа, позволяющие получить стероидные профили крови и мочи, определить предшественники и метаболиты гормонов, а также активность различных ферментов стероидогенеза (Шафигуллина З.Р. и соавт., 2015). Определение количественного и качественного состава стероидов в биологических жидкостях методами хроматографии позволяет установить диагноз гиперкортицизма на ранних этапах заболевания, определить дифференциально-диагностические критерии при различных состояниях, сопровождающихся гиперкортицизмом, и обосновать тактику лечения (Nieman L.K., 2002; Arnaldi G. et al., 2003). Сочетание классических тестов с исследованием стероидных профилей биологических жидкостей методами хроматографии дает возможность осуществлять раннюю дифференциальную диагностику различных заболеваний коры надпочечников (Groote Veldman R.,. Meinders A.E., 1996).
Степень разработанности темы исследования
Несмотря на большие диагностические возможности в выявлении редких
и труднодиагностируемых заболеваний гипоталамо-гипофизарно-
надпочечниковой системы, вопросы своевременной и дифференциальной диагностики синдрома Кушинга остаются открытыми (Varughese A.G. et al., 2014). По данным литературы у 12-16% больных со случайно выявленными образованиями коры надпочечников встречается автономная секреция кортизола. На данном этапе не существует единых биохимических диагностических критериев для выявления субклинического синдрома Кушинга. Автономная секреция кортизола диагностируется у больных со случайно выявленными опухолями надпочечников, без явных клинических признаков гиперкортизолизма при наличии 2-х из следующих 4-х признаков нарушения функции гипофизарно-надпочечниковой системы: автономная
секреция кортизола, увеличение свободного кортизола мочи, нарушение ритма секреции кортизола, подавление секреции АКТГ (<10 пг/мл) (Reincke M., 1992; Rossi R., 2000; Suda T., 2002). Однако, имеющиеся критерии не всегда позволяют провести диагностику субклинического синдрома Кушинга (Шафигуллина З.Р. и соавт., 2015). Повышение экскреции свободного кортизола мочи при всех формах эндогенного функционального и органического гиперкортицизма отмечено во многих работах (Murphy B.E.P., 1999). Ряд авторов рекомендуют определять экскрецию свободного кортизола и кортизона с мочой хроматографическими методами, чтобы снизить аналитические ошибки и повысить чувствительность и специфичность диагностики эндогенного гиперкортицизма (Великанова Л.И. и соавт., 2005; Taylor R.L., 2002). При пограничных значениях гормональных показателей возникает необходимость в дополнительных дифференциально-диагностических критериях различных форм эндогенного гиперкортицизма, в связи с чем необходимо изучение не только секреции кортикостероидных гормонов, но также их производных и метаболитов (Великанова Л.И. и соавт., 2014). Изучение особенностей стероидогенеза становится возможным благодаря использованию хроматографических методов (Великанова Л.И. и соавт., 2005; Tiu S.C., 2009; Krone N. et al., 2010). Ряд исследователей придают большое значение соотношениям продукт-субстрат в дифференциальной диагностике различных форм эндогенного гиперкортицизма по данным высокоэффективной жидкостной хроматографии, что позволяет оценить активность ферментов адреналового стероидогенеза (Великанова Л.И., 2006; Великанова Л.И., 2016). Последние работы указывают на важность изучения стероидного профиля мочи методом газовой хромато-масс-спектрометрии, который дает возможность изучить особенности метаболизма стероидных гормонов (Tiu S.C., 2009; Krone N. et al., 2010; Arlt W. et al., 2011). В связи с этим, представляется актуальным использование в диагностике заболеваний надпочечников сочетание классических тестов с исследованием стероидных профилей биологических жидкостей хроматографическими методами, что позволяет быстро и точно диагностировать различные формы эндогенного гиперкортицизма.
Цель исследования
Изучить функциональное состояние гипофизарно-адреналовой системы у больных с различными формами эндогенного гиперкортицизма с использованием хроматографических методов исследования для улучшения дифференциальной диагностики.
Задачи исследования
1. Установить особенности метаболизма кортикостероидовметодами
высокоэффективной жидкостной хроматографии и газовой хромато-масс-
спектрометрии у больных с различными формами эндогенного гиперкортицизма.
-
Выявить характерные для ожирения и субклинического синдрома Кушинга изменения продукции и метаболизма глюкокортикоидов в результате сопоставления результатов исследования, полученных хроматографическими методами, между группами больных и здоровыми лицами.
-
Определить диагностические критерии синдрома Кушинга и выявить особенности стероидогенеза при надпочечниковом и гипофизарном генезах заболевания по данным хроматографических методов исследования стероидных профилей биологических жидкостей.
-
Изучить значение функциональных проб с дексаметазоном, оцениваемых по результатам определения спектра кортикостероидов в суточной моче методом высокоэффективной жидкостной хроматографии для дифференциальной диагностики ожирения и субклинического синдрома Кушинга (проба с 2 мг дексаметазона), а также различных форм синдрома Кушинга (проба с 8 мг дексаметазона).
Научная новизна
На основании изучения спектра стероидных гормонов коры
надпочечников методами высокоэффективной жидкостной хроматографии и
газовой хромато-масс-спектрометрии установлены биохимические маркеры
дифференциальной диагностики различных форм эндогенного
гиперкортицизма. У больных ожирением по данным хроматографических
методов диагностики выявлено увеличение глюкокортикоидной функции
надпочечников за счет повышения уровней глюкокортикоидов с низкой
биологической активностью, а также определены признаки повышения
андрогенной активности коры надпочечников. У больных субклиническим
синдромом Кушинга по данным хроматографических методов исследования
отмечено увеличение уровней глюкокортикоидов с высокой биологической
активностью и снижение андрогенной функции коры надпочечников. На
основании данных, полученных хроматографическими методами исследования,
детектированы признаки изменения активности ферментов стероидогенеза.
Так, у больных синдромом Кушинга различной этиологии определены
признаки снижения активности 11-гидроксистероиддегидрогеназы 2 типа. У
больных ожирением выявлен частичный дефект 11-
гидроксистероиддегидрогеназы 1 типа. По данным хроматографических методов диагностики на основании изучения соотношений кортикостероидов впервые определены дифференциально-диагностические критерии для синдрома Кушинга различной этиологии. Для дифференциальной диагностики синдрома Кушинга гипофизарного генеза и синдрома Кушинга
надпочечникового генеза установлена информативность определения экскреции свободного кортизола и свободного кортизона с мочой в динамике проведения пробы с 2 мг и 8 мг дексаметазона методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Изучение экскреции с мочой андрогенов и их метаболитов методом газовой хромато-масс-спектрометрии позволило выявить дополнительные критерии дифференциальной диагностики синдрома Кушинга различного генеза. Повышение андрогенной активности коры надпочечников выявлено у больных синдромом Кушинга гипофизарного генеза, в отличие от больных синдромом Кушинга надпочечникового генеза. В результате сопоставления полученных результатов исследования хроматографическими методами впервые выявлены характерные для различных форм эндогенного гипекортицизма изменения продукции и метаболизма глюкокортикоидов и андрогенов.
Практическая и теоретическая значимость исследования
На основании изучения метаболизма андрогенов, прогестинов и глюкокортикоидов впервые сочетанием методов газовой хромато-масс-спектрометрии и высокоэффективной жидкостной хроматографии были выявлены дифференциальные признаки различных форм эндогенного гиперкортицизма. Для проведения дифференциальной диагностики форм эндогенного гиперкортицизма и ожирения рекомендовано исследовать содержания кортикостероидов с различной биологической активностью в крови методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, экскреции их метаболитов с мочой методом газовой хромато-масс-спектрометрии, а также оценить соотношения кортикостероидов в крови и моче хроматографическими методами. Доказано преимущество проведения функциональных подавляющих тестов с 2 мг и 8 мг дексаметазона методом высокоэффективной жидкостной хроматографии над методом иммунохемилюминесцентного анализа. Пациентам с уровнями свободного кортизола слюны более 13 нмоль/л, кортикотропина ниже 8 пг/мл в сыворотке крови, кортизола после подавляющего теста с 1 мг дексаметазона от 50 нмоль/л до 110 нмоль/л рекомендовано проведение пробы с 2 мг дексаметазона с определением глюкокортикоидов мочи методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Для проведения дифференциальной диагностики синдрома Кушинга гипофизарного генеза и синрома Кушинга надпочечникового генеза рекомендовано определение экскреции кортикостероидов с мочой в динамике проведения пробы с 8 мг дексаметазона методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Представляется актуальным сочетание классических тестов с исследованием стероидных профилей методами высокоэффективной жидкостной хроматографии и газовой хромато-масс-
спектрометрии для усовершенствования диагностики и подбора адекватной терапии пациентов c различными формами эндогенного гиперкортицизма.
Методология и методы исследования
Методологическая база диссертационного исследования основывалась на последовательном применении методов научного познания. Работа выполнена в дизайне сравнительного открытого проспективного исследования, включающего в себя аналитический метод – изучение литературных источников по проблеме исследования, эмпирические методы – наблюдение, сравнение, логический анализ. В целях получения требуемой научной информации использовались клинические, лабораторные, инструментальные методы диагностики, а также статистическая обработка полученных данных. Объектом исследования являлись пациенты с эндогенным гиперкортицизмом и ожирением. Предметом исследования являлись анамнестические, клинические и лабораторные особенности обследуемых групп больных. При проведении данного исследования соблюдались требования Национального стандарта Российской Федерации «Надлежащая клиническая практика» по ГОСТу Р 52379-2005, были использованы современные методы обработки информации и статистического анализа.
Основные положения, выносимые на защиту
-
У больных с субклиническим синдромом Кушинга по результатам исследования спектра кортикостероидов в крови и моче методами высокоэффективной жидкостной хроматографии и газовой хромато-масс-спектрометрии глюкокортикоидная активность коры надпочечников была значительно более выражена, чем у больных ожирением, за счет повышения биологически активных промежуточных продуктов биосинтеза и метаболизма глюкокортикоидов.
-
Хроматографическими методами исследования стероидных гормонов коры надпочечников получены характерные изменения метаболитов глюкокортикоидов и андрогенов у больных синдромом Кушинга гипофизарного генеза и синдромом Кушинга надпочечникового генеза, что необходимо для проведения дифференциальной диагностики данных форм заболеваний.
-
Показано значение функциональных подавляющих тестов с дексаметазоном по результатам исследования экскреции глюкокортикоидов с мочой методом высокоэффективной жидкостной хроматографии для дифференциальной диагностики ожирения и субклинического синдрома Кушинга (тест с 2 мг дексаметазона) и для дифференциальной диагностики различных форм синдрома Кушинга (тест с 8 мг дексаметазона).
Достоверность и обоснованность результатов исследования
Достоверность полученных результатовобусловлена
репрезентативностью выборки, включенных в исследование пациентов, использованием новейших методов обследования для диагностики заболеваний коры надпочечников, применением современных способов сбора и обработки первичного материала, методов статистической обработки информации с использованием сравнительной, непараметрической статистики при помощи программного пакета STATISTIСA for WINDOWS (версия 7).
Апробация и внедрение результатов работы в практику
Основные положения диссертации доложены на 3-й научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Трансляционная медицина: от теории к практике» (г. Санкт-Петербург, Россия, 22 апреля 2015 г.); на Юбилейной научной сессии «От трансляционных исследований – к инновациям в медицине» (г. Санкт-Петербург, Россия, 28-30 октября 2015 г.); на VII Всероссийском конгрессе эндокринологов (г. Москва, Россия, 2-5 марта 2016 г.); на Всероссийской конференции с международным участием «Командный подход в современной эндокринологии» (г. Санкт-Петербург, Россия, 26-28 мая 2016 г.); на международной конференции по онкологии и радиологии «Oncology and Radiology ICOR2016» (г. Дубай, ОАЕ, 27-29 октября 2016 г.); на международной конференции по опухолям надпочечников «Ens@t
2016 Birmingham 16» (г. Бирмингем, Великобритания, 26-27 ноября 2016 г.); на
III Всероссийском эндокринологическом конгрессе с международным участием
«Инновационные технологии в эндокринологии» (г. Москва, Россия, 1-4 марта
2017 г.). Получен патент «Способ дифференциальной диагностики
новообразований коры надпочечников», заявитель и патентообладатель
ФГБОУ ВО СЗГМУ им. И.И. Мечникова, № 2015102373 (003645), 2016 г.
Результаты проведенного исследования внедрены в клиническую практику эндокринологического отделения клиники им Э.Э. Эйхвальда, отделения нефрологии с эндокринологическими койками больницы имени Петра Великого, ФГБОУ ВО СЗГМУ имени И.И. Мечникова Минздрава России и СПБ ГБУЗ «Елизаветинская больница». Материалы исследования внедрены в учебный процесс на кафедре эндокринологии им. академика В.Г. Баранова ФГБОУ ВО СЗГМУ им. И.И. Мечникова.
Личное участие автора
Автор самостоятельно участвовал в разработке дизайна и программ исследования, проводил анализ доступной литературы по теме диссертации, сбор первичного материала и выборку пациентов по теме исследования. Диссертантом была проведена оценка результатов исследования, включающая анализ данных хроматографических методов обследования, статистическую обработку результатов.
По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ, в том числе 3 в журналах, рекомендованных в ВАК Минобрнауки России для публикации основных результатов диссертационных исследований.
Структура и объем диссертации
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, двух глав с результатами собственных исследований, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Материалы диссертации изложены на 166 страницах машинописного текста, иллюстрированы 45 таблицами и 4 рисунками. Список литературы включает 41 отечественный и 142 зарубежных источника.
Ожирение
Ожирение является одним из наиболее распространенных заболеваний современного мира. Учитывая высокий рост заболеваемости ожирением, а также риск развития сопутствующих патологий, ВОЗ рассматривает его как «неинфекционную эпидемию настоящего времени» [38, 42].
Для диагностики нарушений массы тела, а также для оценки степени ожирения традиционно применяется индекс массы тела (индексом Кетле), предложенный Quetelet в 1835 году в качестве критерия для оценки недостаточного, избыточного веса и ожирения [160].
Классификация ожирения, предложенная ВОЗ в 1997 году, основана на измерении индекса массы тела (таблица 1).
ИМТ являетcя оcновным критерием диагностики ожирения, позволяющим определить степень ожирения и выявить риск развития сопутствующих заболеваний. Однако он не всегда позволяет адекватно оценить содержание и характер распределения жировой ткани в организме, что является одним из наиболее ярких признаков гормональных нарушений [101, 126]. В 1956 году Vague выделил два основных типа ожирения [124]: «гиноидный», который характеризуется отложением жира преимущественноо в области бедер и ягодиц, и «андроидный» - избыточное накоплением жира в области живота [111].
Висцеральный жир, накапливающийся в области живота при абдоминальном ожирении, обладает чувствительностью к гормональной регуляции и метаболическим профилем [12, 46]. Окружность талии (ОТ) – показатель, применяемый для выявления избыточного отложения жировой ткани в абдоминальной области (ОТ) [12, 38].
Дополнительный антропометрический показатель, применяемый для оценки ожирения и определения его типа, является отношение окружности талии к окружности бедер (ОТ/ОБ). Данный критерий был предложен J. Vague в 1956 году [187].
Клаccификация ожирения по Д.Я. Шурыгину и др. (1980 г.) [44] 1. Формы первичного ожирения.
1.1. Алиментарно-конcтитуциональное.
1.2. Нейроэндокринное.
1.2.1. Гипоталамо-гипофизарное.
1.2.2. Адипозогенитальная диcтрофия (у детей и подроcтков).
2. Формы вторичного (cимптоматичеcкого) ожирения.
2.1. Церебральное.
2.2. Эндокринные.
2.2.1. Гипотиреоидное.
2.2.2. Гипоовариальное.
2.2.3. Климактеричеcкое.
2.2.4. Надпочечниковое.
3. Cтадии ожирения.
3.1. Прогреccирующая.
3.2. Cтабильная.
4. Cтепени ожирения.
I cтепень – фактическая маccа тела превышает «идеальную» не более чем на 29%.
II cтепень – избыток маccы тела cоcтавляет 30-49 %.
III cтепень – фактическая маccа тела превышает "идеальную" на 50-99%.
IV cтепень – фактическая маccа тела превышает "идеальную" на 100% и более.
Учитывая схожесть симптомов ожирения и СК, необходимо обследовать больных ожирением на предмет ЭГ. Приведены данные исследования, в ходе которого 2 группы пациентов с ожирением из 86 и 150 пациентов с ИМТ 30-53 и 30-35,8 кг/м2 соответственно, были обследованы на СК с использованием ПДТ-1 и СКМ, в результате которого у 5,8% и 9,3% соответственно пациентов был установлен СК [181]. При исследовании большего количества пациентов с ожирением (369 человек) и другими признаками ЭГ (73% женщин с ИМТ 38±7 кг/м2 и 41±9 кг/м2 у мужчин), проводились 2-3 диагностических теста, включая определение СКМ, уровня кортизола в слюне. СК у таких пациентов не был обнаружен [55].
В связи с возросшей популярностью бариатрических операций, увеличилось число пациентов, которые проходят тщательное медицинское обследование перед проведением оперативного лечения. Ассоциация эндокринологов разработала специфические рекомендации по обследованию пациентов перед проведением бариатрического лечения. В двух проведенных исследованиях обследовались в общей сложности 1 216 пациента с морбидным ожирением (77% женщин с ИМТ 45,2-47 кг/м2), которым проводился ПДТ-1 для исключения СК перед бариатрической операцией. Распространенность СК составила 0,6-0,8% в обоих исследованиях [91, 116]. Большинству из этих пациентов были диагностированы СК НГ или СК ГГ. В результате этих исследований можно предположить, что для пациентов с избыточной массой тела и ожирением 1 степени рутинные обследования для выявления СК не всегда информативны, в то в время как среди пациентов с тяжелым ожирением и с отдельными клиническими проявлениями гиперкортицизма, обследование для исключения ЭГ может иметь важное значение для подбора адекватной терапии СД 2 типа и метаболического синдрома.
ЭГ часто ассоциирован с нарушением толерантности к глюкозе, декомпенсированным СД, метаболическим синдромом. В ходе исследований была выявлена распространенность СК у пациентов с СД 2 типа, однако результаты оказались спорные. Так Лейбовиц и авторы (1996) выявили 3 случая СК надпочечникового генеза среди 90 (3,3%) пациентов, страдающих СД 2 типа с HbA1c 9% [125]. Другие авторы докладывают о выявлении 9,4% ССК среди 294 госпитализированных пациентов с СД в сравнении с 2,1% из 189 пациентов из группы контроля с таким же возрастом и уровнем ИМТ [81]. Однако при анализе больших когорт пациентов диабетических клиник выявлена частота встречаемости СК 2% [81, 67, 99, 141]. В ходе проспективного исследования в 24 клиниках по всей Италии был обследован 81 пациент с СД 2 типа в анамнезе и без проявлений гиперкортизолизма, им проводилась ПДТ-2 [179]. У 6 пациентов (0,7%) на фоне пробы с 2 мг дексаметазона был выявлен гиперкортизолизм. У 5 из этих пациентов был диагностирован СК НГ. Эти исследования показывают, что вероятность возникновения СК у пациентов с СД 2 типа недостаточно велика для того, чтобы проводить всем пациентам с СД 2 типа скрининг для исключения ЭГ, а вероятность получения ложноположительных результатов велика. Однако среди пациентов с СД 2 типа молодого возраста, с декомпенсированным СД, с АГ, отсутствием наследственной отягощенности по СД 2 типа необходимо проводить скрининговое исследование для исключения ЭГ [40, 180].
Газовая хромато-масс-спектрометрия
Методом ГХ–МС определяли стероидные профили мочи всем пациентам, включенным в исследование. Была использована оптимизация пробоподготовки (гидролиза, экстракции, дериватизации) и хроматографического и количественного определения экскреции стероидов и их метаболитов с мочой, разработанная в НИЛ хроматографии СЗГМУ им. И.И. Мечникова.
Предварительная подготовка материала включала следующие этапы: гидролиз коньюгатов, жидкостную экстракцию аналитов и их последующую дериватизацию. Гидролиз проводился при температуре 37 С в течение 64 часов. В качестве фермента для осуществления гидролиза была выбрана сульфатаза из Helix pomatia, действующая, как на глюкоронидные формы кортикостероидов, так и на сульфатные формы андрогенов. Извлечение стероидов из биологических жидкостей осуществлялось способом жидкостной экстракции, за счет чего удалось получить достаточно чистые образцы за короткий промежуток времени. К аликвоте 5 мл анализируемой мочи с рН 4.6 добавляли 2,5 мл ферментного раствора, который готовили предварительно из порошка сульфатазы и натриевой соли аскорбиновой кислоты (фирма «Sigma-Aldrich», США), затем растворяли в ацетатном буферном растворе (фирма «НеваРеактив», РФ) и настаивали в течение 1 часа. Полученную смесь инкубировали в течение 64 часов при температуре 37 С. Стероиды экстрагировали 25 мл хлороформа. Образовавшийся верхний водный слой удаляли, а экстракт дважды промывали 0,1 М раствора NaOH и 8 мл воды. Полученный экстракт высушивали досуха и растворяли в 1 мл этанола (фирма «Россбио», РФ). Затем отбирали 500 мкл экстракта в этаноле и добавляли к нему 25 мкл стандартного раствора 5-андростендиола и стигмастерола, с концентрацией 100 мкл/мл, являющимся внутренним стандартом. Полученную смесь упаривали досуха, растворяли в 1 мл этилацетата (фирма «Экос-1», РФ) и добавляли 200 мкл 8% водного раствора NaHCO3 (фирма «Нева Реактив», РФ).
После перемешивания водную фракцию удаляли, а оставшуюся смесь дважды промывали в 200 мкл воды. После отстаивания верхний органический слой переносили в сухую чистую пробирку с притертой пробкой и выпаривали досуха.
К сухому остатку добавляли 160 мкл 2% раствора метоксиамина (фирма «Sigma Aldrich», США) в пиридине (фирма «Нева Реактив», РФ), закрывали пробирку и ненадолго помещали в ультразвуковую ванну и затем в водяную ванну при 60 C на 1,5 часа. Далее добавляли 500 мкл триметилсилилимидазола (фирма «Sigma Aldrich», США), перемешивали и выдерживали при 100 С в течение 12 часов.
После инкубации полученную смесь выпаривали для удаления пиридина. Сразу после выпаривания добавляли 1 мл циклогексана (фирма «Экос-1», РФ).
Непрореагировавший триметилсилилимидазол удаляли из смеси путем двукратного промывания 500 мкл воды. Верхний органический слой переносили в микрофлакон для ввода пробы для дальнейшего хромато–масс– спектрометрического анализа.
Определение стероидных профилей мочи проводили в ресурсном центре «Методы анализа состава веществ» Санкт-Петербургского государственного университета на газовом хромато-масс-спектрометре SHIMADZU GCMS-QP2010 ULTRA (Япония). В таблице 3 представлены стероиды, определяемые методом ГХ-МС при различных заболеваниях надпочечников, а также их относительные времена удерживания.
Результаты лабораторного обследования больных синдромом Кушинга надпочечникового генеза
СК НГ пациентам исследуемой группы был диагностирован на основании результатов классических тестов методом ИХЛА. Критериями диагностики являлись: уровень кортикотропина меньше 10 пг/мл, СКС более 25 нмоль/л, отсутствие подавления уровня кортизола после ПДТ-1 (больше 160 нмоль/л).
По данным метода ИХЛА у больных СК НГ, в отличие от здоровых лиц, установлено снижение уровней АКТГ и ДЭА-сульфата в крови и увеличение СКС, уровней Ку, Кв, соотношения Кв/Ку в крови (таблица 20).
Кроме этого, установлено увеличение уровня кортизола в крови после ПТД-1 (больше 166 нмоль/л) и после ПТД-2 (больше 233 нмоль/л) в сравнении со здоровыми лицами. Исследуя содержание кортикостероидов в крови у пациентов с СК НГ по данным ВЭЖХ, выявлено увеличение уровней кортизола, кортикостерона, 11-дезоксикортизола, 18-OHB в крови и соотношений кортизол/кортизон, B/A в сравнении со здоровыми лицами (таблица 21).
Анализируя данные по экскреции с мочой свободных кортикостероидов, полученных методом ВЭЖХ, у больных с СК НГ отмечено увеличение экскреции с мочой UFF, UFE, 6OHF и соотношения UFF/UFE, снижение соотношения 6OHF/UFF в отличие от группы контроля (таблица 22). При проведении ПТД-2 у больных с СК НГ, а экскреция UFF и UFE была увеличена в сравнении с контролем. После проведения ПТД-8 у больных СК получено снижение экскреции UFF(3,8/-16-23%) менее чем на 23% и UFE (31/29-33%) менее чем на 33%.
Анализируя результаты ГХ-МС, у пациентов с СК НГ, в отличие от лиц группы контроля, выявлено увеличение экскреции всех основных метаболитов глюкокортикоидов с мочой: THS, THB, THE их алло-производных (alloHF, allo-ТНВ,) -кортолона, -кортолона и кортолов. Соотношение (THF+alloHF+ТНЕ)/THS было снижено у больных СК в сравнении с контролем. Отмечено увеличение соотношений THF/THE, (THF+alloHF)/THE и ТНВ/ТНА у больных с СК НГ в сравнении со здоровыми лицами, что может указывать на уменьшение активности 11-ГСДГ 2. Данные представлены в таблице 23.
Анализируя данные по экскреции андрогенов с мочой методом ГХМС, у пациентов с СК НГ выявлено снижение экскреции с мочой андростерона, этиохоланолона и DHEA, а также увеличение экскреции 11-ОН-Аn в сравнении с группой контроля. У больных СК надпочечникового генеза, по сравнению с группой контроля, экскреция 17-ОН-прегнанолона, прегнендиола (dP2), 16-ОН-dP2, 11-охо-Р2 и 11-охо-Р3 была увеличена.
Снижение соотношений Аn/Et, alloHF /THF и экскреции с мочой Аn, установленные у больных СК НГ, могут свидетельствовать об увеличении активности фермента 5 -редуктазы.
Увеличение соотношений F/E, В/А, UFF/UFE, ТНF/ТНЕ и (THF+alloHF)/THE у больных СК НГ указывает на снижение активности 11-ГСДГ 2.
Сравнительный анализ данных лабораторного обследования исследуемых групп больных
Нами был проведен анализ данных ИХЛА, ВЭЖХ и ГХ-МС у больных СК НГ и СК ГГ в сравнении с соответствующими показателями больных ожирением. Результаты проведенных исследований представлены в таблицах 37-42.
У пациентов с СК НГ и СК ГГ по данным стандартных тестов, основанных на методе ИХЛА, были увеличены уровни Ку и Кв в сыворотке крови, СКС, уровни кортизола после ПТД-1 и ПТД-2 в сравнении с соответствующими показателями больных ожирением. Уровень АКТГ в плазме крови был повышен у больных СК ГГ, а уровень ДЭА-С был снижен у пациентов СК НГ.
Аналогичные изменения были получены при сравнении показателей больных СК НГ и СК ГГ со здоровыми лицами (таблица 37).
Полученные по данным ВЭЖХ изменения стероидогенеза и метаболизма глюкокортикоидных гормонов у больных СК НГ и СК ГГ в сравнении с пациентами с ожирением не отличались от соответствующих показателей, полученных в сравнении со здоровыми лицами (таблицы 38, 39). Однако у больных СК НГ и СК ГГ уровень 18-ОНВ в сыворотке крови был выше в сравнении с здоровыми лицами, но не отличался от пациентов с ожирением (таблица 38).
Анализируя данные ГХ-МС у больных СК НГ, мы получили снижение экскреции андрогенов (Аn и DHEA) и увеличение экскреции метаболитов глюкокортикоидов с мочой (THS, THE, ТНF, THB, дигидрокортизона и дигидрокортизола, кортолонов и кортолов) в сравнении с больными ожирением Следует отметить, что экскреция с мочой alloHB и alloHF у больных СК НГ не отличалась от пациентов с ожирением, но была увеличена в сравнении со здоровыми лицами (таблица 40).
У больных СК ГГ установлено увеличение экскреции андрогенов (16-DHEA, dA3, 16-oxo-dA2, Et, 11-OH-Et, 11-охо-Et, A3) и метаболитов глюкокортикоидов с мочой (THS, THE, ТНF, allo-ТНF, THB, дигидрокортизона, дигидрокортизола), снижение экскреции ТНА с мочой в сравнении с больными ожирением. Следует отметить, что у больных СК ГГ экскреция с мочой alloHB, кортолонов и кортолов не отличалась от пациентов с ожирением, но была увеличена в сравнении со здоровыми лицами (таблица 40). Признаки увеличения активности 5-редуктазы (снижение соотношений Аn/Et, allo-ТНF/ТНF и alloHB/ THB) и снижения активности 11-НСДГ 2 типа (увеличение соотношений ТНF/THE, ТНВ/ТНА) были получены у больных СК НГ и СК ГГ в сравнении с больными ожирением. У пациентов с СК ГГ снижение соотношения 11-ОН-Аn/11-ОН-Et в сочетании с увеличением экскреции с мочой 11-ОН-Et были дополнительными признаками увеличения активности 5-редуктазы, а повышение соотношения (ТНF+allo-ТНF)/THE было дополнительным признаком снижения активности 11-НСДГ 2 типа (таблица 40).
Таким образом, увеличение уровней F, B, S в крови, экскреции их тетрагидрометаболитов с мочой, UFF и UFE, признаки снижения активности 11-НСДГ 2 типа и увеличения активности 5-редуктазы были получены у больных СК НГ и СК ГГ как в сравнении со здоровыми лицами, так и с больными ожирением. Более убедительные данные увеличения активности 5-редуктазы у больных СК НГ и СК ГГ были получены при сравнении показателей с больными ожирением, у которых установлены признаки повышения активности 5-редуктазы.