Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Современное представление об иммунопатогенезе аутоиммунных заболеваний щитовидной железы (обзор литературы) 13
1.1. Эволюция взглядов на патогенез аутоиммунных заболеваний щитовидной железы 13
1.2. Роль клеток врожденного и адаптивного иммунитета в патогенезе болезни Грейвса и аутоиммунного тиреоидита .23
1.3. Современные представления о роли клеток и факторов гуморального иммунитета в патогенезе АИЗЩЖ 33
1.4. Система цитокинов и цитокинопосредованные механизмы в иммунопатогенезе АИЗЩЖ 36
1.5. Клиническая, морфофункциональная характеристика АИЗЩЖ. Роль мастоцитов в изиологии и патологии щитовидной железы 46
Глава 2. Направления, материалы и методы исследования 54
2.1. Характеристика контингента больных и клинических групп 54
2.2. Экспериментальные исследования 68
2.3. Методы исследований 71
Глава 3. Система цитокинов и факторов гуморального иммунитета при болезни Грейвса .76
3.1. Динамика изменений провоспалительных цитокинов и тиреоидных аутоантител при болезни Грейвса .78
3.2. Динамика изменений противовоспалительных цитокинов и тиреоидных аутоантител при болезни Грейвса 104
3.3. Сравнительная оценка содержания тиреоидных аутоантител и оппозитных цитокинов в сыворотке крови при болезни Грейвса .118
Глава 4. Система цитокинов и факторов гуморального иммунитета при аутоиммунном тиреоидите .122
4.1. Динамика изменений провоспалительных цитокинов и тиреоидных аутоантител при аутоиммунном тиреоидите 125
4.2. Динамика изменений противовоспалительных цитокинов и тиреоидных аутоантител при аутоиммунном тиреоидите 149
4.3. Динамика факторов гуморального иммунитета при аутоиммунном тиреоидите 161
Глава 5. Матриксные металлопротеиназы 8 и 9 типов, их тканевой ингибитор I типа при аутоиммунных заболеваниях щитовидной железы 166
5.1. Изменения сывороточных уровней матриксных металлопротеиназ, их тканевого ингибитора 1 типа и комплекса MMP-9 / TIMP-1 при болезни Грейвса и аутоиммунном тиреоидите 168
5.2. Взаимосвязь сывороточных маркеров системы протеолиз/антипротеолиз, тиреоидных гормонов и оппозитных цитокинов при АИЗЩЖ 176
Глава 6. Морфофункциональные изменения в железах внутренней секреции при экспериментальном тиреотоксикозе и гипотиреозе, их взаимосвязь с показателями системы иммунитета .179
6.1. Оценка системного уровня тиреоидных гормонов, аутоантител к рецептору тиреотропного гормона и оппозитных цитокинов при экспериментальном тиреотоксикозе и гипотиреозе .180
6.2. Исследование локального цитокинового профиля при экспериментальном тиреотоксикозе и гипотиреозе у животных 186
6.3. Морфофункциональные особенности эндокринных желез в норме и при экспериментальном гипотиреозе и тиреотоксикозе 189
6.4. Морфофункциональная характеристика мастоцитов при экспериментальном тиреотоксикозе и гипотиреозе .193
Заключение 198
Выводы .213
Практические рекомендации 215
Список использованных сокращений и условных обозначений 217
Список литературы 219
Приложение А 258
- Роль клеток врожденного и адаптивного иммунитета в патогенезе болезни Грейвса и аутоиммунного тиреоидита
- Динамика изменений провоспалительных цитокинов и тиреоидных аутоантител при болезни Грейвса
- Динамика изменений противовоспалительных цитокинов и тиреоидных аутоантител при аутоиммунном тиреоидите
- Морфофункциональная характеристика мастоцитов при экспериментальном тиреотоксикозе и гипотиреозе
Роль клеток врожденного и адаптивного иммунитета в патогенезе болезни Грейвса и аутоиммунного тиреоидита
Роль Т-клеточного иммунитета в иммунопатогенезе БГ и АИТ впервые была подробно освещена при описании рестрикции экспрессии генов Va, кодирующих вариабельные регионы a-цепей Т-клеточного рецептора на Т-клетках в ткани ЩЖ [216, 323]. У пациентов с АИЗЩЖ при исследовании интратиреоидных Т-лимфоцитов выявлялось достоверное снижение экспрессии ими генов Va Т-клеточного рецептора (TCR) (5 из 18 Va-генов), по сравнению с экспрессией Va-генов клетками периферической крови этих пациентов [480]. Более того, в ЩЖ здоровых лиц подобная рестрикция отсутствовала. При АИТ в ЩЖ обнаружены аналогичные, но менее выраженные изменения Va-генов Т-клеток [118]. Авторы также обсуждают принципиальное значение дефектов функциональной активности Тregs и повышенной активации интратиреоидных Тh-клеток в инициировании АИЗЩЖ [469]. Инфильтрирующие ЩЖ лимфоциты могут проявлять цитотоксические свойства по отношению к фолликулярным клеткам ЩЖ или влиять на функцию тиреоцитов посредством продукции цитокинов, что изменяет целостность тиреоидного эпителия и модулирует его метаболические и иммунные свойства [48, 118].
Как было указано ранее, впервые на центральную роль Т-лимфоцитов в патогенезе БГ указал Р. Вольпе в конце 70-х годов прошлого века, который предположил, что имеющийся у пациентов с БГ дефект в системе «иммунологического выживания» приводит к выживанию и пролиферации Т-лимфоцитов, образовавшихся в результате спонтанной мутации и обладающих способностью реагировать с органоспецифическими аутоантигенами [459]. Согласно его гипотезе, в основе АИЗЩЖ лежит генетически обусловленный дефицит Т-лимфоцитов определенной антигенной специфичности, который проявляется нарушениями функции цитотоксических Т-клеток и обуславливает разные клинико-иммунологические варианты тиреопатий. Согласно более поздним гипотезам, генетически обусловленный дефицит цитотоксических Т-клеток и степень исходного нарушения их функции может определять клинические варианты АИЗЩЖ [456]. Различие взглядов на состав и функции Т-клеток, участвующих в иммунопатогенезе АИЗЩЖ и других аутоиммунных эндокринопатий сохраняется до сих пор [79, 214, 253]. Более того, некоторые авторы предполагали, что снижение числа Т-цитотоксических лимфоцитов при БГ не является первичным специфическим сдвигом, а отражает повышенную концентрацию ТГ в сыворотке крови пациентов. В исследовании были приведены данные о снижении числа CD8+ Т-клеток при многоузловом токсическом зобе, что может являться подтверждением влияния ТГ на CD8+ Т-клетки [266]. Кроме того, о прямой связи уровня ТГ с количеством и функциональной активностью Т-клеток говорилось еще в конце 90-х [386]. Доказательством непосредственной связи специфических цитотоксических Т-лимфоцитов с ТГ, по мнению авторов, служила нормализация показателей этих клеток и продуцируемых ими цитокинов после купирования тиреотоксикоза.
Определенно, если рассматривать изменение уровня ТГ как триггерный механизм развития АИЗЩЖ, то контраргументом может являться факт отсутствия прямой корреляции между рядом форм транзиторного тиреотоксикоза (деструктивный тиреотоксикоз при подостром тиреоидите) и последующим развитием аутоиммунных тиреопатий, что нашло подтверждение в экспериментальных моделях [16]. Однако резонно, что изменение соотношения Thl / Тп2-маркёрных цитокинов как в сыворотке крови, так и в супернатантах ЩЖ животных в результате достаточно непродолжительного экзогенного не аутоиммунного тиреотоксикоза может свидетельствовать о важной роли иммунных (иммунорегуляторных) нарушений в патогенезе АИЗЩЖ на фоне изменения тиреоидного статуса [25].
Рецепторы тиреоидных гормонов (Тр) принадлежат к суперсемейству рецепторов стероидных гормонов. Существенно, что они способны взаимодействовать с другими белками из-за присутствия в их структуре не менее девяти гидрофобных гептадных повторов [185, 332], а шарнирная область Тр содержит сигнальную последовательность аминокислот, которая впервые была обнаружена в ядерных белках вирусного происхождения [105]. Более того, в настоящее время данные о специфических изменениях тиреоидных аутоантигенов при АИЗЩЖ неоднозначны [146, 435]. Известные на сегодняшний день элементы, чувствительные к ТГ, подразделяются по молекулярным механизмам воздействия на них ТГ - позитивные и негативные эффекты [146]. Например, при экспериментальном тиреотоксикозе подтверждено модифицирующее действие адреналина на функции фагоцитирующих клеток, что указывает на вовлеченность адренергических механизмов в иммунотропное действие ТГ [16, 94]. Наоборот, при дефиците ТГ отмечается ослабление активности адренергических ответов за счет снижения нормального синтеза цАМФ при активации клеток, что дополнительно подтверждает взаимосвязь катехоламинов и ТГ [252]. Опубликованные данные о нарушении развития клеток иммунной системы у мышей с дефектами генов, кодирующих разные изоформы тиреоидного рецептора, подтверждают участие ТГ в иммунном ответе [210].
Фактически предполагается, что иммуноциты способны производить и депонировать in situ основные виды гормонов, ТТГ и трийодтиронин в том числе, но реализуют это по мере необходимости, имеют рецепторы к ряду гормонов, что делает их филогенетически способными сформировать новые эндокринные железы [179]. Считается, что концентрация трийодтиронина (Т3) в иммуноцитах регулируется ТТГ, так же как в ЩЖ, а в общем тиреоидные гормоны Т3 и Т4 рассматриваются как «суперантигены» при АИЗЩЖ [9]. Принимая во внимание наличие большого количества иммуноцитов в организме, у регуляторной роли ТТГ в производстве T3 в иммуноцитах может быть как важная физиологическая, так и патогенетическая роль [181, 210]. Потенциально также интересны данные, что введение препаратов Т3 экспериментальным животным повышало экспорт Т-лимфоцитов из тимуса в лимфатические узлы и их перераспределение между лимфатическими узлами и селезенкой [444].
Параллельно высказывались убедительные мнения относительно состава и фенотипических особенностей Т-лимфоцитов, о степени нарушений в процессинге и презентации антигена, о продукции и соотношении оппозитных цитокинов [9, 264]. Именно поэтому патогенез АИЗЩЖ в общем рассматривался как «нарушение иммунорегуляции, при котором дисфункция органа обусловливается агрессией недостаточно супрессированных ТЫ- и Тп2-клеток против специфических антигенов клеток-мишеней» [100].
Существенно, что в ряде исследований при осложненном тиреотоксикозе отмечалось значительно более выраженное снижение цитотоксических Т-лимфоцитов (CD8+) и CD 16+, CD56+ NK-клеток по сравнению с группой субклинического течения БГ, что указывает на связь изменений в Т-клеточном звене иммунитета с уровнем ТГ [52, 386]. Однако ряд авторов убедительно утверждает, что при АИЗЩЖ отмечается функциональные изменения, а не уменьшение субпопуляции NK-клеток [188]. В 1997 г. М. Watanabe с соавторами указывали на увеличение растворимых молекул CD8+ в сыворотке крови при БГ и их корреляцию с тяжестью тиреотоксикоза, ими был зафиксирован факт увеличения уровня растворимых молекул CD8 с возрастанием уровня ТГ и с содержанием антител к рТТГ [353]. Весьма интересно, что в более ранних исследованиях повышенный уровень HLA-DR+ и CD4+ лимфоцитов при БГ на фоне лечения снижался, но пониженный уровень CD8+ Т-клеток оставался неизменным [123, 472], что сложно объяснить корреляцией с уровнем ТГ. При БГ ранее было выявлено увеличение относительного количества CD 19+ клеток, обнаружены сильные отрицательные связи между количеством цитотоксических СД8+ лимфоцитов и уровнем антител к ТПО и Tg [52, 449]. Это может косвенно свидетельствовать, что синтез аутоантител всё-таки зависит от уровня ТГ, которые в свою очередь влияют на CD8+ Т-клетки. Еще в работах R. Volpe в 1993 - 1995 гг. было доказано, что тиреоидные аутоантигены активируют CD8+ клетки (или CD8+CDllb+ лимфоциты) гораздо слабее у пациентов с БГ, чем у здоровых доноров, а реакция CD8+ клеток (или CD8+CD11b+) слабее на Tg, ТПО и рТТГ по сравнению с их реакцией на не тиреоидные детерминанты [460, 461]. Это, вероятно, может свидетельствовать о наличие дефекта активации антигенспецифических цитотоксических Т-лимфоцитов, что по мнению автора, обусловлено дефектом генов, кодирующих антигенпрезентирующие молекулы (АПМ), и/или нарушением презентации антигена [461]. Было сделано предположение, что Т-лимфоциты при БГ сенсибилизированы даже к нормальным тиреоцитам, а их ингибирование или удаление нивелирует патологические изменения [205].
Однако, мнение об отсутствии связи между фенотипическими особенностями лимфоцитов и тиреоидным статусом, уровнем аутоантител разделяли далеко не все ученые. В частности, Т. В. Глазанова и соавт. (2000), при исследовании субпопуляций лимфоцитов периферической крови обнаружили снижение относительного содержания CD3+, CD4+, CD8+, HLA-DR+ [85]. С. И. Крайнова с соавт. (2001), исследуя изолированные из ткани ЩЖ лимфоциты, установили, что они потенцируют пролиферацию «нормальных» тиреоцитов и повышают экспрессию поверхностных антигенов на них, снижают способность тиреоцитов реагировать на увеличение концентрации ростовых факторов (эмбриональную сыворотку теленка - FCS) в среде культивирования [77]. Данные подтверждают важность интратиреоидных лимфоцитов в иммунопатогенезе АИЗЩЖ и необходимость изучать их специфические свойства отдельно от популяций лимфоцитов в периферической крови.
Динамика изменений провоспалительных цитокинов и тиреоидных аутоантител при болезни Грейвса
Имеющиеся на сегодняшний день данные о роли основных представителей группы провоспалительных цитокинов (IL-1 и , TNF-, IL-6, IL-8, IL-17) при БГ весьма многочисленны, но неоднозначны. В этой связи, была изучена динамика содержания в сыворотке крови уровня IL-la, IL-1, IL-6 и sIL-6 R, IL-8, TNF- и TNF- sRI, TNF- sRII, IL-17 при БГ разной степени тяжести - I, II, III группы (Таблица 12). Учитывались пол пациентов, уровень ТГ и тиреоидных аутоантител, объем ЩЖ и динамика данных показателей на фоне разных видов лечения заболевания.
При БГ уровень сывороточного IL-la был увеличен более чем в 13 раз (Таблица 11, 12), по сравнению с показателями здоровых лиц (21,18 ± 4,26 пг/мл против 1,61 ± 0,05 пг/мл р 0,01). Эти данные подтверждают основополагающий принцип действия цитокиновой сети: цитокины в норме вырабатываются клетками системы иммунитета лишь в зоне «конфликта» [100]. Анализ исходных данных показал (Таблица 12, 13), что сывороточный уровень IL-la у пациентов с БГ до начала терапии имел существенные гендерные отличия, наиболее выраженные при манифестном и осложненном течении аутоиммунного тиреотоксикоза. Так, у мужчин до начала терапии заболевания уровень цитокина был более, чем в 4,5 раза больше, чем у женщин (45,74 ± 3,81 пг/мл и 9,76 ± 2,87 пг/мл, соответственно; р 0,05). Гендерные различия были зафиксированы во всех клинических группах до начала терапии БГ - уровень цитокина у мужчин значительно превышал аналогичные показатели у женщин (Таблица 13).
В динамике, через 3 месяца терапии тионамидами, сравнения величин сывороточного IL-la в гендерных группах вновь показали преобладание его у мужчин по сравнению с аналогичными значениями у женщин, но достоверными оставались различия лишь в группе осложненного течения БГ - средний показатель значений IL-1 у мужчин был в 4,5 раза выше, чем у женщин, что доказывает более низкую эффективность стандартных доз тионамидов у мужчин при тяжелом аутоиммунном тиреотоксикозе. Анализ динамики содержания IL-1 на фоне терапии БГ через 6 месяцев выявил достоверные гендерные отличия, но в группах с более легким течением заболевания. При этом, в I и во П-й клинических группах показатели сывороточного уровня IL-1 были выше у женщин ( 0,05; Таблица 13).
Анализируя сывороточный уровень IL-la в клинических группах, обнаружено, что при манифестации аутоиммунного тиреотоксикоза наиболее высокий уровень IL-la отмечался во II и III группах больных (Таблица 12, 13). Уровень IL-la в группе субклинического течения БГ (I группа) был в пределах нормы и значительно отличался от пациентов с более высоким уровнем ТГ - II и III группы (р 0,001; Таблица 13). В динамике, на фоне терапии тиамазолом в течение 3 месяцев, уровень IL-la снижался во всех клинических группах, но не достигал нормальных величин во П-й и Ш-ей группах пациентов с БГ. Через шесть месяцев терапии уровень IL-la оставался высоким только в III группе, что отличало его как от здоровых людей (р 0,001), так и от больных I и II групп (р 0,01; Таблица 13). Динамика уровней IL-la на фоне терапии антитиреоидными средствами свидетельствует об иммуносупрессивных свойствах тионамидов, вероятно, за счёт снижения синтеза IL-1 в тиреоцитах [9].
Незначительная эффективность тионамидов в случае осложненного тиреотоксикоза указывает на наличие повышенного иммуностимулирующего воздействия исходно высоких уровней ТГ и возрастающего в динамике ТТГ на фоне антитиреоидного действия тиамазола, что способно вызывать дополнительную выработку Т3 в иммуноцитах [181]. Можно предположить важную роль этого феномена в патогенезе БГ. Также необходимо учитывать дозозависимый стимулирующий эффект св. Т4 на антителообразование [16].
При сравнении величины сывороточного IL-la у пациентов из II и III групп перед тиреоидэктомией было установлено, что при исходно высоком среднем уровне IL-la до операции, в этих группах не наблюдалось существенных различий в его концентрации (Таблица 14). Так, во II и III группах предоперационный уровень IL-la превышал аналогичный показатель группы контроля в 30 - 50 раз. Более того, в обеих группах IL-la после тотальной тиреоидэктомии существенно снижался, но по-прежнему между группами в содержании цитокина достоверных отличий выявлено не было (Таблица 14). По сравнению с исходными величинами, уровень IL-la снижался через 2 месяца после операции во II группе в 17 раз, а в III группе - в 22 раза, однако, оставался при этом в 1,6 раза выше нормы (р 0,05). При анализе динамики уровня сывороточного IL-la в гендерных группах, обнаружено, что как исходно, так и перед операцией его средняя концентрация у мужчин был существенно выше, чем у женщин (Таблица 15).
В показателях цитокина после тиреоидэктомии существенный различий не зафиксировано: у мужчин уровень IL-la составил 2,64 + 0,91 пг/мл, у женщин IL-la -2,71 +0,89 пг/мл ( 0,05), что косвенно подтверждает преимущественно интратиреоидный синтез цитокина. Кроме того, результаты нашего исследования свидетельствуют об отсутствии достоверных отличий в объеме ЩЖ в группах манифестного и осложненного тиреотоксикоза (Таблица 6) перед тиреоидэктомией. При анализе вероятных связей IL-la, IL-1 и объема ЩЖ (по данным УЗИ) обнаружено, что большинство из них исходно характеризовались как прямые средней силы (г= 0,50, 0,05). В динамике, непосредственно перед операцией, связь между IL-la и объемом ЩЖ была также средней прямой (г = 0,61; 0,05), что подтверждает способность тиреоцитов при БГ синтезировать IL-1. Между сывороточными уровнями IL-la и св. Т4 у больных при субклиническом аутоиммунном тиреотоксикозе в динамике терапии тионамидами через 3 месяца установлена средней силы прямая связь (п = 0,54; 0,01). Исследуя взаимосвязь IL-la и ТТГ, установлено, что до начала терапии БГ между данными показателями в группах имели место статистически значимые обратные связи (п = -0,64; щ = -0,61; гш= -0,53; 0,05), при этом в I группе через 6 месяцев терапии связь усиливалась до сильной обратной (п = -0,89; 0,05).
При использовании ROC-анализа нами установлено, что одним из иммунологических критериев для прогнозирования эффективности терапевтического лечения БГ, а также необходимости выбора тиреоидэктомии или радиойодтерапии может являться сывороточный уровень IL-la ( 8,75 пг/мл). Этот показатель продемонстрировал высокую специфичность (1) и чувствительность (0,976) маркера. При этом его точность составила 0,987; AUC=0,99; частота ложных обнаружений 0; прогностическая ценность 1. Полученные данные позволяют отнести этот показатель к наиболее точным иммунологическим критериям тяжести аутоиммунного воспаления при БГ и предикторам рецидива заболевания после окончания курса консервативного лечения.
IL-lp представляет собой секреторный цитокин, осуществляющий своё действие как местно, так и на системном уровне [359]. Концентрация ИЛ-1 до начала терапии БГ составила 5,12 ± 1,50 пг/мл (против 1,37 ± 0,18 пг/мл у группы контроля, 0,01), что превышало показатели здоровых лиц в 5 раз (Таблица 11, 12). Достоверно повышен был уровень цитокина у пациентов с ЭО, который составил 4,72 ± 0,79 пг/мл ( 0,01).
Анализируя концентрацию IL-1 при разных клинических группах (Таблица 13), установлена прямая связь его уровня с концентрацией ТГ (I группа - 1,03 ± 0,06 пг/мл, II группа - 4,59 ± 0,65 пг/мл, III группа - 6,83 ± 1,21 пг/мл; щ П-ш 0,01). Достоверное снижение уровня цитокина в динамике через 2 месяца после тотальной тиреоидэктомии подтверждают эти данные, которые приведены в таблице 16. Существенно, что через 2 месяца после операции показатели цитокина не нормализовались (Таблица 16), что свидетельствует о существенной активации провоспалительных механизмов клеточного реагирования у этой категории пациентов.
Динамика изменений противовоспалительных цитокинов и тиреоидных аутоантител при аутоиммунном тиреоидите
Ряд авторов связывают повышенный уровень IL-10, TGF-, IL-4 с прогрессированием АИТ [65, 275]. Известно также, что ТГ способны индуцировать секрецию IL-10 В-клетками и CD4+ Т- клетками [305], но при АИТ, как правило, ТГ снижены в дебюте. Кроме того, IL-10 является ингибитором активности ТЫ -клеток, в его семейство входит ряда цитокинов - IL-19, IL-20, IL-22, IL-24 и IL-26 [100], протективное действие которых, а также и TGF-, IL-4, IL-13 полностью не доказано, а некоторые авторы, наоборот, указывают на непосредственное их участие в развитии и поддержании аутоиммунного воспаления [32, 383]. Кроме того, полиморфизм генов IL-10 гаплотипов -1082 G / A (rsl800896), -819 С / Т (rs1800871) и -592 С / A (rsl800872) ассоциирован со склонностью к заболеванию АИТ [133]. Считается, что Тп17-клетки играют важную провоспалительную роль в аутоиммунной патологии человека, а IL-10-продуцирующие ThlO-клетки выполняют защитную роль и баланс между этими двумя субпопуляциями Т-хелперов регулируется внутриорганными цитокинами и относительным соотношением FoxP3 по сравнению с FoxP32 [121] Эти противоречивые данные послужили основанием для исследование динамики содержания противовоспалительных цитокинов у больных АИТ в зависимости от степени тяжести заболевания.
Была изучена динамика содержания в сыворотке крови IL-10, TGF-1 и TGF-3, IL-4, IL-13, IL-22 у больных I, II, III групп с АИТ. Анализ данных проводился с учетом гендерных различий, дополнительно исследовались корреляции с ТГ и аутоантителами, объемом ЩЖ и их динамика на фоне лечения ТГ (Таблица 55).
Сывороточный уровень IL-10 исходно при АИТ был повышен в 3 раза по сравнению с показателями группы контроля (Таблица 42). Исходное увеличение содержания цитокина в системном кровотоке было сопряжено с нарастанием тяжести течения аутоиммунного процесса в ЩЖ и гипотиреоза (Таблица 55). Существенные гендерные отличия в показателях цитокина не были зафиксированы (46,77 ± 1,94 пг/мл у мужчин против 33,17 ± 1,73 пг/мл у женщин, 0,05) и заметны они были лишь во II группе. У мужчин этой группы исходно при АИТ уровень цитокина был практически в 1,5 раза выше, чем у женщин (Таблица 56). При этом в III и 1-й группах IL-10 был также выше у мужчин, но его отличия были статистически не достоверны (Таблица 56).
Через 3 месяца терапии ТГ уровень IL-10 оставался незначительно выше у мужчин по сравнению с женщинами (р = 0,052). Гендерные различия маркера вновь оказались статистически значимыми только во II группе АИТ (р 0,05). Через 6 месяцев консервативного лечения содержание цитокина умеренно снизилось во всех клинических группах, а в I группе наблюдался умеренный дефицит интерлейкина (Таблица 55). При этом в динамике также не было обнаружено существенных гендерных различий. Кроме того, IL-10 сохранялся значительно повышенным только в группе осложненного течения, где были зафиксированы его наиболее высокие показатели (Таблица 55, 56).
ROC-анализ системного уровня IL-10 у пациентов при АИТ в сравнении с аналогичными показателями контрольной группы выявил критически значимое содержание маркера, равное 22,55 пг/мл, которое было прогностически значимым (1,0), значение AUC было равным 0,971. Более того, чувствительность маркера составила 0,87; специфичность 1,0; частота ложноотрицательных результатов отсутствовала; прогностическая ценность положительного результата составила 1,0, а ложноотрицательные результаты - 0,13 (Рисунок А 26, 27).
Корреляционный анализ показателей IL-10 и объема ЩЖ, в отличии от аналогичных связей при БГ, показал присутствие сильной прямой связи между данными маркерами (г = 0,94; 0,05). Корреляционный анализ сывороточного уровня IL-10 и св.Т3 показал, как в дебюте АИТ, так и в динамике через 3 месяца терапии ТГ, наличие средней силы прямой связи (г = 0,54; 0,01 и г = 0,58; 0,05, соответственно). Установлено наличие сильных прямых связей между показателями ТТГ и IL-10 в дебюте АИТ (r=0,76; 0,01). Была выявлена средняя прямая связь показателей IL-10 и ТGF3 (r= 0,50; 0,01). Результаты корреляционного анализа маркеров эндокринной системы и факторов иммунитета предполагают наличие опосредованной регуляторной [165] и, вероятно, негативной роли IL-10 при АИТ. Кроме того, регуляторные В-клетки (Breg, В10), которые в норме активно продуцируют ИЛ-10, при патологии могут быть малочувствительны к стимулирующим эффектам со стороны Т-клеток [39]. Тесная сопряженность высокого уровня IL-10 с тяжестью клинического течения АИТ и содержанием ТТГ, полученная в нашем исследовании и совпадающая с результатами исследований других авторов [275], может свидетельствовать о непосредственном вовлечении данного цитокина в процессы прогрессирования АИТ.
TGF- оказывает супрессорный эффект, защищает организм от избыточного синтеза клетками воспаления цитотоксических соединений, участвует в индукции адаптивных Тreg [305]. Как было показано, TGF- демонстрирует свои регуляторные функции [91]. Более того, TGF-1 проявляет себя как цитокин, тесно ассоциированный с АИТ, находящийся при этом аутоиммунном заболевании в абсолютном дефиците независимо от адекватности заместительной терапии [240]. При экспериментальном тиреоидите TGF-1, синтезируемый тучными клетками в ЩЖ, демонстрировал свою роль в фолликулогенезе и ангиогенезе при репарации ЩЖ [233]. Однако, до сих пор его точная роль в развитии и поддержании патологического процесса при АИТ не ясна, что служит мотивацией для дальнейших исследований.
При исследовании сывороточного уровня TGF-1 при АИТ, были выявлены достоверные изменения его показателей (16,56 ± 1,90 пг/мл против 23,78 ± 1,89 пг/мл у здоровых, 0,05), ассоциированные со степенью тяжести АИТ (Таблица 55). Зафиксирован 2-х кратный дефицит цитокина при осложненном течении АИТ (III группа), умеренное его снижение во II группе (18,55 ± 0,99 пг/мл против 23,78 ± 1,89 пг/мл у здоровых лиц, 0,05) и нормальные значения в I группе (Таблица 55, 57).
Показатели TGF-1 через 3 месяца терапии ТГ оставались близким к показателям здоровых лиц в I группе, были умеренно снижены во П группе ( 0,05) и достоверно более низкие в группе осложненного течения АИТ (таблица 55, 57). Через 6 месяцев консервативного лечения концентрация TGF-1 практически нормализовалась во П группе, но в Ш группе сохранялся умеренный дефицит цитокина (Таблица 55, 57). Гендерных различий в уровне TGF-1 при АИТ установлено не было. При корреляционном анализе показателей цитокинов, между TGF-1 и IL-22 у мужчин исходно при АИТ обнаружена сильная прямая связь (r = 0,74; 0,01). При корреляционном анализе показателей TGF-1 и объема ЩЖ при АИТ, связи между маркерами оказались, как при БГ, обратными средней силы (r= - 0,50; 0,01), что согласуется с исследованиями, посвященными влиянию TGF-1 на процессы фиброзирования щитовидной железы [281].
При ROC-анализе системного уровня TGF-1 при АИТ до терапии ТГ было зафиксировано его критически низкое значение, которое было равным 18 пг/мл. Содержание цитокина ниже данного значения прогностически значимо (1,0), значение AUC составило 0,89. Чувствительность маркера 1,0; специфичность 0,78; прогностическая ценность отрицательного результаты 1,0 и точность маркера составила 0,89 (Рисунок А 28, 29). Учитывая, что TGF-1 принимает участие в процессах инфильтрации ЩЖ лимфоцитами, в синтезе аутоантител и в процессах иммунной деструкции тиреоцитов при АИТ [130], обнаруженные в нашем исследовании закономерности в изменении уровня цитокина, коррелирующие с клиническими проявлениями болезни и другими иммунными маркерами, подтверждают важную патогенетическую роль TGF-1 в общем дисбалансе оппозитных цитокинов и нарушении иммунного гомеостаза при АИТ, что позволит использовать маркер в ранней диагностике заболевания.
Нами было зафиксировано двукратное увеличение TGF-3 (108,83 ± 6,76 пг/мл; 0,05) у больных АИТ до начала терапии по сравнению с контролем (52,73 ± 2,75 пг/мл) (Таблица 42). Наиболее высокие показатели определялись в группе субклинического течения, но при этом, внутри этой клинической группы имелись и достоверные гендерные отличия (Таблица 55, 58). Наиболее высокое его значение зафиксировано в I группе у женщин, а наименьшее - было в этой же группе у мужчин (197,75 ± 1,04 пг/мл против 77,91 пг/мл соответственно, 0,01). У пациентов из II группы, независимо от пола пациентов ( 0,05), определялись умеренно повышенные значения цитокина ( 0,05; Таблица 42, 55). В группе осложненного течения гипотиреоза концентрация TGF-3 в сыворотке крови достоверно отличалась от контроля ( 0,01; Таблица 52). В этой группе у лиц обоих полов показатели цитокина в 2 – 2,5 раза превышали значения группы контроля, но имели, при этом, достоверные гендерные отличия ( 0,05; Таблица 55). Важно отметить, что в целом в гендерных группах при АИТ достоверной разницы между значениями TGF-3 не выявлено (114,39 ± 8,59 пг/мл у женщин против 101,24 ± 9,58 пг/мл у мужчин, 0,05). В динамике через 3 месяца терапии ТГ наблюдалась тенденция к постепенному снижению TGF-3 во всех группах (Таблица 55). Зафиксирована нормализация показателя во II группе через 3 месяца терапии, в III группе - через 6 месяцев терапии ТГ у женщин (Таблица 58) Повышенный уровень TGF-3 сохранялся после 6 месяцев лечения ТГ в I группе у женщин и в III группе у мужчин (Таблица 58).
Морфофункциональная характеристика мастоцитов при экспериментальном тиреотоксикозе и гипотиреозе
Роль МС в развитии воспаления в органах-мишенях при аутоиммунных эндокринопатиях подтверждена в недавних исследованиях у пациентов с диабетической нефропатией [357]. Однако, до настоящего времени точно неизвестен механизм активации МС и их роль при АИЗЩЖ ЭО [231, 369]. Целью данного фрагмента работы явилось изучение особенностей реагирования МС на введение здоровым животным ТГ и на блокирование синтеза ТГ с помощью тиамазола с последующим изучением гуморальных факторов (IL-1, IL-10, IFN-, TNF-) врождённого иммунитета в периферической крови животных и in situ в ткани ЩЖ. Предполагают, что идентификация уровня ТГ мастоцитами может происходить как опосредованно - с помощью лимфоцитов и других иммуноцитов [212], так и самостоятельно - с помощью рецепторов к ТГ [476]. Это может подтвердить динамика соотношения оппозитных цитокинов в системном кровотоке и супернатантах ЩЖ, а также гистологических изменений, в том числе на фоне дополнительной стимуляции рекомбинантным IL-2, который в отличие от ТГ поступал не через кишечник, а вводился животным парентерально [394].
При гистологическом исследовании ЩЖ с окраской препаратов 0,1 % толуидиновым синим (при рН 4,9), установлена очаговая мастоцитарная инфильтрация стромы ЩЖ и окружающей жировой клетчатки с признаками парциальной дегрануляции МС в I-й группе. Дегрануляция МС достоверно изменялась после стимуляции IL-2 во II-й группе и была также зафиксирована в III-й экспериментальной группе (Таблица 75; рисунок А 57, 58).
Индекс дегрануляции (ИД) был наиболее высоким в группе III (экспериментального гипотиреоза) и в I группе (экспериментального тиреотоксикоза), он рассчитывался по формуле: ИД равен количеству дегранулирующих МС, разделенному на сумму слагаемых: неизмененные МС плюс дегранулирующие МС [49]. ИД является наиболее важным критерием, отражающий функциональную активность МС. Однако в последние годы активно обсуждается молекулярный способ выделения секреторного материала МС [98], который протекает без нарушения целостности плазма-леммы и выброса гранул секрета. Триггерным механизмом этой «постепенной дегрануляции» может быть попадание бактериальных антигенов и ЛПС, которые через TLR активируют МС [98, 478]. Для подсчета ИД (Таблица 75) использовали случайные меридианные срезы ЩЖ животных, подсчитывали их площадь путем обведения периметров срезов на цифровых фотографиях (не менее 10 с каждой ЩЖ) и, затем, на программе ImageJ рассчитывали площадь объекта. Затем регистрировали с помощью этой программы все найденные МС, выделяли дегранулирующие МС и рассчитывали ИД.
Если в I-й группе МС зафиксированы в строме и перифолликулярном пространстве, то при применении IL-2 (II-я группа) достоверно увеличилось количество активно дегранулирующих MC в пери- и межфолликулярном пространстве ЩЖ с образованием десмосомальных мостиков между МС и тиреоцитами (Таблица 75; рисунок А 50, 51). Об активности тканевых МС во II-й группе свидетельствуют различные типы дегрануляции – частичный (парциальный) и стандартный типы, а также диссеминация гранул за пределы цитоплазмы клеток (Рисунок А 50, 51). В III-й группе количество МС (Таблица 75) было выше, чем в группе контроля и во II-й группе, но ниже, чем в I-й группе. В группе гипотиреоза фокусы инфильтрации ЩЖ МС преобладали в капсулярной зоне, периваскулярно и интерфолликулярно. В капсулярной и периваскулярной зонах изменялась форма МС на полигональную и овальную, а интерфолликулярные МС были в основном лентовидные и веретеновидные. Количество дегранулирующих МС в паренхиме ЩЖ в III группы было выше, чем в субкапсулярной и периваскулярной зонах. Единичные интерфолликулярные МС тесно прилежали к клеткам фолликулярного эпителия и дегранулировали среди пролиферирующих тиреоцитов (Рисунок А 57). Во всех экспериментальных группах было зафиксировано тесное прилежание МС к тиреоидному эпителию ЩЖ животных (Рисунок А 50, 51, 57, 58, 59).
В качестве кофакторов, определяющих дифференцировку, пролиферацию и формирование гранул в MC, могут выступать IL-3, IL-10, IL-4, IL-33 и другие факторы [100]. В исследовании обнаружено практически трехкратное возрастание сывороточного уровня IL-10 на введение в организм здорового животного ТГ (левотироксина натрия), с дальнейшим увеличением сывороточной концентрации цитокина еще в 2 раза после дополнительной стимуляции рекомбинантным IL-2 (Таблица 73), что согласуется с полученными данными гистохимического и ИГХ исследований ЩЖ – качественному изменению дегрануляции МС, но это не исключает молекулярный путь выделения цитокина мастоцитами (Рисунок А 50, 51, 60).
В этой связи важно отметить, что ИД во II группе был выше, чем в группе контроля ( 0,05), но ниже (Таблица 75), чем в группах с тиреотоксикозом без дополнительного введения IL-2 ( I-II 0,05) и гипотиреоза ( II-III 0,05), в которой был зафиксирован наиболее высокий ИД.
Эти данные подтверждают важную регуляторную роль IL-2 при тиреотоксикозе и его тесную взаимосвязь с функциональной активностью МС. Интересны в этой связи исследования, доказавшие IL-2-подобное действие ТТГ, но с более выраженным иммунорегуляторным и иммуномодулирующим действием [97]. Возможно, именно поэтому в группе с гипотиреозом показатели ИД превышали аналогичные показатели в контроле и в группах с тиреотоксикозом ( 0,05). Более того, существуют исследования [434], в которых обсуждается позитивная роль МС в восстановлении функции ЩЖ с гипотиреозом в эутиреоидное состояние после бактериального NTI («не тиреоидной болезни»). Кроме того, клетки системы иммунитета, в том числе МС [181], содержат Т3 (трийодтиронин), синтез которого регулируется у них ТТГ, как и в ЩЖ, что предполагает участие иммуноцитов в непосредственном регулировании тиреоидного статуса. Кроме того, вклад МС в интратиреоидную продукции TNF- (повышенную в 10 раз при гипотиреозе) вполне согласуется со спектром производимых ими цитокинов [32, 53, 63].
Наше предположение о важной иммунорегуляторной роли МС при тиреотоксикозе и гипотиреозе основано на том, что их реакция имела прямую связь с изменением концентрации ТГ у животных с последующим нарастанием у крыс уровней оппозитных цитокинов. Тем более известно, что при попадании клеток-предшественников МС в ткань, они там дифференцируются, а микроокружение определяет их окончательный фенотип. При этом МС, дегранулируя или взаимодействуя молекулярным способом, становится источником полифункциональных цитокинов и, тем самым может влиять на иммуноциты и тиреоциты [88, 410]. Дегрануляция мастоцитов может вызывать нарушение периферической иммунологической толерантности [280]. Следовательно, имеет право на существование гипотеза, что участвующие в развитии и прогрессировании «nonthyroidal syndrome» МС могут через TLR влиять на секреторную деятельность тиреоцитов и тем самым запускать синтез оппозитных цитокинов с потерей толерантности к аутоантигенам ЩЖ.
Эти данные получили подтверждение в нашем исследовании: у здоровых животных с непродолжительным экзогенным тиреотоксикозом и гипотиреозом достоверно изменился не только сывороточный и/или локальный уровень оппозитных цитокинов (IL-1, IFN-, TNF- и IL-10), но изменилось соотношение Th1 / Th 2 - маркерных цитокинов как в сыворотке крови, так и в супернатантах ЩЖ (Таблица 73, 74). Более того, в процессе изучения морфо-функциональных свойств МС при экзогенном тиреотоксикозе (I-я и II-я группы) при помощи ИЦХ и ИГХ исследований с использованием моноклональных антител к CD86 и к триптазе (маркировка антител разными флуорохромами на одном замороженном срезе при конфокальной микроскопии) в ЩЖ крыс были обнаружены иммунопозитивные мастоциты с экспрессией CD86 (Рисунок А 50, 51, 60). Известно, что на поверхности МС, помимо идентифицированных костимулирующих молекул CD86, присутствуют молекулы МНС II класса [100], что в свою очередь позволяет утверждать о способности МС выполнять функции АПК в ЩЖ при системном изменении уровня ТГ и рассматривать их как объект для патогенетической терапии при АИЗЩЖ.
Существенно, что при тиреотоксикозе значительный дисбаланс содержания IFN- / IL-10 в ЩЖ выравнивался на фоне введения рекомбинантного IL-2, но при этом изменялся характер дегрануляции МС, что может свидетельствовать о поддержании МС воспалительной реакции в ЩЖ. Возможно, что МС выполняли в данном случае и защитную функцию, так как известно, что они противодействуют Treg в их дифференцировке в Th17 типа и тем самым способствуют супрессии аутоиммунного воспаления [328]. Помимо этого, существуют доказательства участия МС в адаптивном иммунном ответе путем рекрутировании лимфоцитов из регионарных лимфатических узлов [151]. Один из механизмов, с помощью которых МС влияют на функцию Т-клеток, опосредован секрецией оппозитных цитокинов, что может с большой долей вероятности объяснять увеличившийся в 5-6 раз и более уровень IFN- в супернатантах ЩЖ животных с гипотиреозом и тиреотоксикозом (Таблица 73, 74) на фоне мастоцитарной инфильтрации ЩЖ и активной дегрануляции МС. Изучение роли МС при АИЗЩЖ и динамики их функциональной активности в зависимости от тиреоидного статуса и состояния фолликулярного тиреоидного эпителия, особенности их реакций в ЩЖ, позволяет по-новому рассмотреть патогенез АИЗЩЖ и создать основу для специфичной морфофункциональной диагностики и более совершенных методов лечения тиреоидной патологии.