Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1 Современное состояние проблемы семейных случаев аутоиммунных заболеваний щитовидной железы 11
1.1 Распространенность АИЗ ЩЖ 11
1.2 Роль семейной кластеризации АИЗ ЩЖ 14
1.3 Проявления АИЗ ЩЖ в семьях 18
1.4 Патогенез АИЗ ЩЖ 20
1.5 Роль факторов среды в развитии АИЗ ЩЖ 22
1.6 Роль генетических факторов в развитии АИЗ ЩЖ 28
ГЛАВА 2 Материалы и методы исследования 37
2.1 Характеристика исследуемой группы пациентов 37
2.2 Методы обследования 40
ГЛАВА 3 Результаты исследования 46
3.1 Клинические проявления АИЗ ЩЖ в группе семейных случаев 46
3.2 Характеристика семейных случаев АИТ 51
3.3 Характеристика семейных случаев ДТЗ 55
3.4 Результаты генотипирования
3.4.1 Анализ распределения генотипов полиморфизма С(-1)Т гена CD40 60
3.4.2 Анализ распределения генотипов полиморфизма A49G гена CTLA4 69
3.4.3 Анализ распределения генотипов полиморфизма С1858Т гена PTPN22 74
ГЛАВА 4 обсуждение результатов исследования 83
Заключение 94
Выводы 95
Практические рекомендации 96
Список условных сокращений 97
Список литературы 98
- Роль семейной кластеризации АИЗ ЩЖ
- Роль генетических факторов в развитии АИЗ ЩЖ
- Характеристика семейных случаев ДТЗ
- Анализ распределения генотипов полиморфизма С1858Т гена PTPN22
Роль семейной кластеризации АИЗ ЩЖ
В ряде исследований было показано, что отягощенный семейный анамнез АИЗ ЩЖ встречается примерно в 33-50% случаев АИТ или ДТЗ [25, 114]. В частности, в 1960 году R. Hall и J. Stanbury показали, что у 33% братьев и сестер пациентов с ДТЗ или АИТ происходит развитие АИЗ ЩЖ. Кроме того, было обнаружено, что 56% братьев и сестер пациентов с АИЗ ЩЖ являются носителями тиреоидных АТ. Практически во всех случаях, по крайней мере у одного из родителей лица с манифестным АИЗ ЩЖ, определяются тиреоидные АТ [98, 104].
Выявление семейной кластеризации при ДТЗ и АИТ в различных популяциях позволило установить, что лица с отягощенным семейным анамнезом АИЗ ЩЖ имеют больший риск возникновения АИТ и ДТЗ [113]. W. Wiersinga и соавт. уже в 2005 году определил риск развития манифестной тиреоидной дисфункции у членов семьи первой степени родства пациентов с АИЗ ЩЖ, в случае если у первых определялись антитела к тиреопероксидазе (АТ-ТПО), риск оказался пропорционален титру антител. Таким образом, на основании пятилетнего проспективного исследования было установлено отношение рисков развития гипо или гипертиреоза при уровне АТ-ТПО 100-1000 ЕД/мл, 1000-10000 ЕД/мл, и более 10000 ЕД/мл составили 4,4; 14,4 и 25,7 безотносительно первоначального уровня ТТГ [100].
Современный взгляд на проблему семейных случаев АИЗ ЩЖ был изложен в исследовании M. Dittmar и соавт., где было определено 16-кратное увеличение риска развития манифестного АИЗ ЩЖ для детей пациентов с уже имеющейся тиреоидной дисфункцией аутоиммунного генеза и 15-кратное увеличение риска для братьев и сестер. В структуре заболевания было показано 32-кратное увеличение риска развития АИТ для детей и 21-кратное увеличение для братьев и сестер. Риск развития ДТЗ был повышен в 7 раз как для детей, так и для братьев и сестер [113]. Ряд авторов сделали важный вывод на основании высокой частоты АИЗ ЩЖ среди кровных родственников первой степени родства, который лег в основу всех современных рекомендаций по наблюдению пациентов с АИЗ ЩЖ. Авторы пишут, что факт заболеваемости АИТ и ДТЗ родственников пациентов с АИЗ ЩЖ говорит о необходимости регулярного скрининга членов семьи первой степени родства на наличие данного заболевания. Исследователи рекомендуют определение уровня ТТГ всем близким родственникам больного с АИЗ ЩЖ [113, 72, 95].
Несмотря на очевидность семейной кластеризации АИЗ ЩЖ, следует понимать, что сам по себе этот факт не обязательно означает, что заболевание генетически обусловлено. Семейная кластеризация может быть результатом случайности, воздействия внешних факторов (факторов окружающей среды), внутренних (генетических) факторов или их комбинации. Случайная семейная кластеризация может встречаться тогда, когда заболевание широко распространено, и в таком случае исследуемая патология может проявляться у многих членов одной семьи только на основании случайности. Воздействие внешних факторов необходимо отличать от генетических причин семейной кластеризации. Существуют различные методы, позволяющие определить в каком случае семейная кластеризация заболевания результат генетической предрасположенности или действия негенетических факторов. Один из методов основан на определении показателя s, который указывает на отношение распространенности заболевания у кровных братьев и сестер заболевшего лица в сравнении с распространенностью заболевания в генеральной популяции. s выражает увеличение риска развития заболевания у индивида, при условии наличия кровного брата или сестры с заболеванием, и количественно измеряет генетический вклад в развитие изучаемой патологии. Значение s более чем 5 обычно показывает значимый генетический вклад в патогенез заболевания [121]. Данные, полученные в исследовании NHANES III, позволили определить показатель s для АИЗ ЩЖ, который составляет по разным данным от 5,9 до 16,9 [140, 119, 141], что свидетельствует о существенном генетическом влиянии на развитие АИЗ ЩЖ [137].
Семейные случаи АИЗ ЩЖ являются моделью для изучения вклада генетических факторов. В частности в работе Hou и соавт. по результатам 8-летнего наблюдательного исследования, в котором на момент его окончания насчитывалось 45 генеалогических ветвей c анамнезом ДТЗ (263 человека), были получены данные, указывающие на определяющую роль генетических факторов в развитии АИЗ ЩЖ и исходах при проведении лечения [86]. Также к анализу семейных случаев обращаются для изучения групп сцепления (выявления генетической связи). В основе данного метода лежит предположение, что если два гена или полиморфизма расположены близко друг к другу на хромосоме, то они будут косегрегировать (в локусе главного комплекса гистосовместимости) в семьях. Вероятность, что рекомбинация между данными генами будет иметь место во время мейоза, обратно пропорциональна расстоянию между ними. Более того, если полиморфный маркер расположен близко к гену, отвечающему за восприимчивость, его аллель будет косегрегировать с заболеванием в семьях. Измерение вероятности сцепления между заболеванием и генетическим маркером выражается в показателе LOD (десятичный логарифм отношения шансов) [156]. В частности, например, для генов СTLA-4 и такого факта, как продукция антител к компонентом ткани щитовидной железы, с помощью изучения семейных случаев носительства антител был определен LOD, который составил 4,2, что говорит о значительной связи [148].
Роль генетических факторов в развитии АИЗ ЩЖ
Определение объема ЩЖ и ее эхоструктуры с помощью ультразвукового исследования (УЗИ). УЗИ проводилось на аппарате ALOKA-SSD-1100, датчиком 9мГц. При использовании УЗИ диффузное увеличение определяют, если объем ЩЖ у женщин превышает 18 см3 , у мужчин – 25 см3 (Gutekunst et al., 1991, 1993). По данным УЗИ, в понятие «очаговая патология» включены фокальные изменения структуры ЩЖ (диаметр образования менее 1 см) и узловая патология (диаметр образования более 1 см) [8]. Определение гормонов тиреоидной группы, антител к тиреоидной пероксидазе (АТ-ТПО) проведено в лаборатории клинических биохимических и гормональных исследований терапевтических заболеваний руководитель - д-р мед. наук, профессор РАН Рагино Ю.И. Определение показателей ТТГ, св./общ. Т4, АТ-ТПО проведено иммуноферментным методом с использованием коммерческих тест-систем. Границы условно-нормальных лабораторных показателей были взяты из инструкций использованных наборов. Для базального уровня ТТГ - 0,167-4,05 мЕд/л, для св. Т4-10,0-26,0 нмоль/л, для антител к ТПО тиреоцитов человека - 30 Ед/мл. Диагностические критерии для оценки субклинического гипертиреоза: уровень ТТГ 0,100 мЕд/л и нормальный уровень св./общ. Т4; для субклинического гипотиреоза: уровень ТТГ выше 4,06 мЕд/л и нормальный уровень св./общ. Т4. Диагностические критерии для оценки манифестной формы гипертиреоза: уровень ТТГ 0,100 мЕд/л и повышенный уровень св./общ. Т4; для манифестной формы гипотиреоза: уровень ТТГ более 10,0 мЕд/л и пониженный уровень св./общ. Т4 [8].
Диагноз АИТ с исходом в гипотиреоз устанавливали на основании характерных жалоб, данных анамнеза, повышения уровня ТТГ и снижения уровня Т4св в случае сочетания классической ультразвуковой картины АИТ (снижение эхогенности или изменение структуры за счёт гипоэхогенных очагов различной формы и размеров на фоне нормальной эхогенности) с повышенным уровнем антител к тиреоидной пероксидазе (АТ-ТПО).
Диагноз ДТЗ устанавливался на основании характерных жалоб, данных анамнеза, клинических симптомов тиреотоксикоза, диффузного увеличения ЩЖ, повышенного уровня тиреоидных гормонов (св. Т4 и Т3) наряду со снижением уровня ТТГ ниже 0,1 мЕд/л, повышение уровня антител к рецептору ТТГ. По данным УЗИ учитывалось увеличение объёма ЩЖ, низкая эхогенность, неоднородность эхоструктуры ткани ЩЖ. Кроме того, фиксировалось сочетание ДТЗ с эндокринной офтальмопатией (ЭО). При необходимости выполнялась радиоизотопная сцинтиграфия с 99mТс-пертехнетатом.
Анализ клинических проявлений АИТ. В клинической картине АИТ у пациентов выделялось наличие следующих синдромов и симптомов гипотиреоза – обменно-гипотермический (прибавка веса, гипотермия, ощущение зябкости), эпидермальный (сухость кожи, усиленное выпадение волос), отечный (общая и периорбитальная отёчность, снижение тембра голоса, отечность языка), синдром нарушения органов чувствительности (снижение слуха), синдром нарушений со стороны центральной и периферической нервной системы (снижение памяти, сонливость, депрессия, апатия, заторможенность, дизартрия, туннельные синдромы), синдром нарушений со стороны сердечнососудистой системы (брадикардия, диастолическая артериальная гипертензия, выпот в полости перикарда, дислипидемия), синдром нарушений со стороны желудочно-кишечного тракта (запоры, дискинезия желчевыводящих путей, гепатомегалия, снижение аппетита), анемический синдром (гипохромная анемия), синдром нарушения репродуктивной функции (нарушение менструального цикла, снижение либидо, бесплодие, привычное невынашивание, гиперпролактинемия).
Анализ клинических проявлений ДТЗ. При ДТЗ у пациентов определялось наличие следующих синдромов и симптомов: синдром нарушений со стороны центральной и периферической нервной системы (психическая лабильность, агрессивность, периодическое возбуждение, плаксивость, астения, мелкий тремор), синдром нарушений со стороны сердечнососудистой системы (ощущение сердцебиения, тахикардия, фибрилляция предсердий, повышение пульсового АД), обменный синдром (прогрессирующее похудение на фоне повышенного аппетита, чувство жара, субфебрилитет), синдром эктодермальных нарушений, миопатия (уменьшение объема мускулатуры, мышечная слабость, повышение КФК), синдром нарушений со стороны желудочно-кишечного тракта (диарея, дистрофические изменения печени), синдром нарушений со стороны мочеполовой системы (эректильная дисфункция, нарушение менструального цикла), синдром остеопении. Все пациенты были обследованы клинически на предмет наличия эндокринной офтальмопатии - заболевания ретробульбарных тканей и мышц глазного яблока аутоиммунной природы, возникающее на фоне патологии щитовидной железы и приводящее к развитию экзофтальма и комплекса глазных симптомов. ЭО классифицировалась по шкале NOSPECS.
Молекулярно-генетические исследования выполнены на базе лаборатории молекулярно-генетических исследований терапевтических заболеваний «НИИТПМ» (руководитель - д-р мед. наук, доцент Максимов В.Н.). Выделение ДНК из крови проводилось методом фенол-хлороформной экстракции по модифицированной методике [28]. Пробу крови (в объеме 5-10 мл) и небольшое количество буфера «А» (0,01 М Tris-HCl, pH=7,5; 10 мM NaCl; 3 мM MgCl2) переносили в гомогенизатор и растирали сгусток до однородной массы. После этого добавляли 1 объём буфера «А» и центрифугировали в течение 20 мин при 4000 об./мин. После слива надосадочной жидкости, осадки промывали 2 раза 10 мл буфера «А». Для разрушения плазматических мембран и белок-нуклеиновых комплексов к осадку добавляли буфер «В» в объеме 400мкл (0,05 M Tris-HCl, pH=8,0; 100 мM NaCl; 10 мM EDTA), 20% раствор детергента-SDS - 15 мкл и протеиназу - 160 мкг. Смесь оставляли на ночь при 37оС (для лизиса). Затем к лизату добавляли 100 мкл 5 М NaCl, и проводили депротеинизацию, последовательно добавляя по 750 мкл фенола, затем центрифугируя в течение 20 мин при 4000 об./мин и перенося водную фазу в отдельную пробирку; по 750 мкл смеси фенола и хлороформа (1:1), также центрифугируя и перенося водную фазу в отдельную пробирку; и по 750 мкл хлороформа с последующим центрифугированием. Осаждение ДНК проводили добавлением к водной фазе изопропилового спирта (1:1). Осадок, полученный центрифугированием на 12000g в течение 15 минут, промывали трехкратно 75% этанолом с последующим центрифугированием в течение 5мин при 12000g и после высушивали при 560С. Сухой остаток растворяли в деинонизованной воде до концентрации ДНК 1,0 мкг/мкл.
Характеристика семейных случаев ДТЗ
Среди мужчин была установлена тенденция накопления гетерозиготного генотипа АG в группе контроля (63% и 50%, соответственно). Полученные отличия были достоверными (р=0,026), однако стоит обратить внимание на малый объем выборки лиц мужчин с ДТЗ. В данной подгруппе лиц носителей гомозиготного генотипа GG выявлено не было. Наблюдалась тенденция накопления аллеля A по сравнению с контролем (75% и 56%, соответственно, р=0,494).
В подгруппе лиц женского пола с ДТЗ наблюдалась тенденция накопления гетерозиготного генотипа СТ по сравнению с группой контроля (68% и 47%, соответственно, р=0,088). Количество гомозигот АА в группе пациенток с семейными случаями ДТЗ не отличалось от группы контроля: 14% против 25% соответственно (р=0,268). Схожая тенденция отмечена в отношения гомозиготного генотипа GG, частота его носительства в группе пациентов составила 18% против 28% в группе контроля (р=0,364).В изучаемой подгруппе пациенток с ДТЗ отличий в отношении носительства аллеля G по сравнению с контролем получено не было (р=0,926).
У лиц с АИТ генотип АА полиморфизма A49G гена СTLA-4 определялся чаще, чем в группе контроля (35% и 25% соответственно). Но полученные отличия были не достоверны (р=0,249) (таблица 10). Также наблюдалась тенденция в накоплении гетерозигот в группе контроля по сравнению с группой пациентов с АИТ (49% против 45%), разница была статистически не значимой (р=0,746). Носительство аллеля А определялось чаще в группе с семейными случаями АИТ по сравнению с группой контроля 58% против 49%, соответственно. Данные отличия были статистически не значимыми (р=0,210).
Среди мужчин с семейными случаями АИТ, вошедших в исследование, наблюдалась тенденция накопления гомозиготного генотипа АА по сравнению с группой контроля (60% и 25%, соответственно, р=0,233). Абсолютное количество гомозигот GG в изучаемой подгруппе пациентов с АИТ не отличалось от такового в группе контроля (20% и 12%, соответственно, р=0,722). Кроме того, была установлена тенденция накопления гетерозиготного генотипа AG в группе контроля мужчин без АИЗ ЩЖ 63% против 20% в группе пациентов с семейными случаями АИТ (р=0,162). В изучаемой подгруппе лиц с АИТ частота носительства аллеля А была больше по сравнению с контролем: 70% и 56% соответственно, однако данные отличия были не значимыми (р=0,483).
В подгруппе женщин с АИТ определялись те же тенденции, что и в общей группе лиц с АИТ обоих полов. Гомозиготный генотип АА определялся более часто, чем в группе контроля (32% и 25%, соответственно), однако полученные отличия были не значимыми (р=0,449). Гомозиготный генотип GG превалировал в группе женщин не имеющих АИЗ ЩЖ по сравнению с группой пациентов (28% и 19%, соответственно, р=0,327). В группе пациенток с АИТ не достоверно чаще встречалось носительство аллеля А по сравнению с контролем (56% и 48%, соответственно, р=0,279).
В подгруппе сибсов с АИЗ ЩЖ было установлено преобладание носительства гетерозиготного генотипа СТ по сравнению с группой контроля (70% и 49%, соответственно, р=0,092). Более подробная информация приведена в таблице 11.
В подгруппе родителей и потомков наблюдалась тенденция к накоплению гомозигот АА среди пациентов с АИЗ ЩЖ по сравнению с группой контроля (28%, 36% против 25%, соответственно). Но отличия были статистически не значимыми (р=0,767 и р=0,289 соответственно). Частота носительства гомозиготного генотипа GG напротив была не достоверно выше в группе контроля по сравнению с подгруппами родителей и потомков с АИЗ ЩЖ: 26% против 20%, 24% соответственно (р=0, 527 и р=0,818). При изучении частот генотипов и аллелей в зависимости от степени родства среди женщин были выявлены аналогичные результаты, как и для объединенной группы обоих полов. В частности, в группе сибсов частота носительства гетерозиготного генотипа AG была больше, чем в группе контроля 73% против 47%, однако полученные результаты были не достоверными (р=0,062). Частоты гомозиготного генотипа АА в подгруппе потомков и родителей женского пола с АИЗ ЩЖ не отличались от группы контроля (33%, 26% и 25% соответственно, р=0,453 и р=0,917). Не было отличий в подгруппах сибсов, потомков и родителей женского пола по носительству аллеля А по сравнению с контролем: 53%, 55%, 54% против 48%, p=0,655, p=0,480, p=0,669, соответственно.
Анализ распределения генотипов полиморфизма С1858Т гена PTPN22
Выявленное различия в частоте носительства аллеля С между группами сибсов и контролем, а также между группой матерей и контролем позволяют сделать вывод о возможности применения исследования полиморфизма С(-1)Т гена CD40 в качестве диагностического маркера. Так при наличии брата или сестры с АИЗ ЩЖ или при наличии потомка с АИЗ ЩЖ носительство у сибса или у матери аллеля С ассоциировано с возникновением семейных случаев данного заболевания. Данный вывод особенно важен с учетом характерного для АИЗ ЩЖ генетического ожидания, т.е. данный диагноз среди родителей устанавливается в достоверно более позднем возрасте, чем у их потомков [18]. Однако стоит отметить, что данный вывод нуждается в дальнейшем анализе на большей популяции.
На основании установления ассоциация носительства аллеля С с возникновением семейных форм ДТЗ можно сделать вывод о необходимости дальнейшего изучения ОНП С(-1)Т гена СD40 при спорадических случаях данного заболевания. Кроме того, выявленные ассоциации полиморфизма С(-1)Т гена CD40 среди сибсов и матерей с семейными формами АИЗ ЩЖ свидетельствуют о перспективности дальнейшего анализа генетических факторов среди пациентов и их кровных родственников с данными заболеваниями. Обнаружение в сыворотке крови антител к компонентам ткани щитовидной железы может происходить задолго до появления клинических проявлений и последующей диагностики АИЗ ЩЖ. В дополнение к сывороточным антителам, генетические факторы могут позволить прогнозировать дальнейшее развитие заболевания [42].
Ген CTLA4 кодирует трансмембранный регуляторный белок, который экспрессируется на активированных Т-клетках и негативно регулирует их функцию. CTLA4 конкурирует с CD28 за связывания с его лигандом В7 на АПК, повышает порог активации Т-клеток, и тем самым является необходимым посредником для стабильного взаимодействия Т-клеток и АПК. В ряде исследований на европеоидной и азиатской популяции была показана связь ОНП A49G гена CTLA4 с выработкой антител к компонентам ткани щитовидной железы, восприимчивостью к ДТЗ и АИТ [50, 75, 49, 45]. По данным проведённых ранее исследований в г. Новосибирске у мужчин носительство аллеля G и генотипа GG полиморфизма A49G гена CTLA4 ассоциировано с повышенным риском развития ДТЗ, у женщин такой связи не было обнаружено [17]. В настоящем исследовании также только cреди мужчин была установлена тенденция накопления гетерозиготного генотипа АG в группе контроля (63% и 50%, соответственно). Полученные отличия были достоверными (р=0,026), однако стоит обратить внимание на малый объем выборки лиц мужчин с ДТЗ. В данной подгруппе лиц носителей гомозиготного генотипа GG выявлено не было. Приведенные результаты подчеркивают важность этнической изменчивости при изучении ассоциации различных полиморфизмов даже в пределах одного гена-кандидата.
Wei-Hsin Ting и соавт. изучили частоту полиморфизма A49G гена CTLA-4 среди более чем 250 взрослых пациентов с ДТЗ и аналогичным количеством детей с данным заболевание. Однако авторы не выявили существенных отличий [50]. Хотя в исследовании в Нидерландах, проведенном среди более чем 200 пациентов, была выявлена связь ОНП A49G гена СTLA-4 с более ранним дебютом заболевания [107]. В настоящей работе разницы в частоте носительства различных генотипов ОНП A49G гена CTLA-4 среди старшего и младшего поколения также выявлено не было. У больных аутоиммунным гипотиреозом, как по данным других исследований на популяции города Новосибирска, так и по результатам настоящего исследования не обнаружено гендерных различий в частоте генотипов и аллелей полиморфизма A49G гена CTLA4 по сравнению с контрольной группой.
В исследовании Yang и соавт. изучалась ассоциация полиморфизма A49G гена CTLA-4 и С(-1)Т гена CD40 c АИЗ ЩЖ в Китайской популяции. Авторами была установлена достоверная ассоциация полиморфизма С(-1)Т с ДТЗ и полиморфизма A49G гена CTLA-4 с ДТЗ и АИТ. Но логистический регрессионный анализ показал отсутствие взаимодействия между генотипами СD40 и CTLA4 [67].
По данным исследования, проведенных на популяции г. Новосибирска у больных ДТЗ, как у мужчин, так и у женщин, не было выявлено разницы в частоте генотипов и аллелей полиморфизма C1858T гена PTPN22 по сравнению с группой контроля. В группе пациентов с АИТ гомозиготный генотип TT и аллель T полиморфизма C1858T гена PTPN22 встречается чаще, чем в группе здоровых. Носительство аллеля T у женщин ассоциировано с повышенным риском развития АИТ [19]. Аналогичные данные о связи данного ОНП с АИТ были получены среди жителей Центральной Европы [161]. В исследовании среди жителей республики Татарстан ассоциации полиморфизма C1858T гена PTPN22 и АИТ выявлено не было [4]. На японской популяции было установлено, что носительство гетерозиготного генотипа АА и аллеля А полиморфизма C1858T ассоциировано с ДТЗ [57].
Однако в настоящем исследовании, значимые отличия по сравнению с группой контроля были получены только в объединённой группе сибсов с АИЗ ЩЖ. Было установлено достоверное преобладание носительства гетерозиготного генотипа СТ полиморфизма С1858Т гена PTPN22 по сравнению с группой контроля (65% и 21%, соответственно), р=0,001. Носительство аллеля Т ассоциировано с риском развития АИЗ ЩЖ в группе сибсов. Также среди родителей и потомков с АИЗ ЩЖ имело место накопление гомозиготного генотипа ТТ полиморфизма С1858Т гена PTPN22 по сравнению с группой контроля. Но отличия были статистически значимыми только для группы потомков с АИЗ ЩЖ (р=0,014). Было установлено, что носительство аллеля Т ассоциировано с риском развития АИЗ ЩЖ в группе потомков женского пола. В схожем по дизайну исследовании на латиноамериканцах было включено 25 пациентов и члены их семьи первой и второй степени родства, в данной группе пациентов оценивалась экспрессия мРНК гена PTPN22 по сравнению со здоровыми лицами, авторами значимых отличий выявлено не было [97]. Таким образом, пациенты с семейными случаями АИЗ ЩЖ являются высокоинформативной моделью для изучения вклада средовых и генетических факторов и их фенотипического проявления, заключающегося в клинической характеристике течения заболевания.