Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Аналитический обзор 8
1.1 Основные направления использования растительного сырья и отходов его переработки в качестве субстратов биотехнологических процессов 8
1.2 Высшие базидиальные грибы – перспективные продуценты в процессах биоконверсии растительной биомассы 17
1.3 Особенности глубинного и твердофазного культивирования базидиальных грибов 28
Выводы к главе 1 39
Глава 2 Методы исследования 41
2.1 Характеристика гриба Pleurotus pulmonarius Fr 41
2.2 Схемы и методы исследований
2.2.1 Выделение и хранение чистой культуры 44
2.2.2 Изучение культурально-морфологических признаков мицелия P. рulmonarius 44
2.2.3 Молекулярно-генетическая идентификация штамма PP-3.2 Pleurotus pulmonarius Fr 45
2.2.4 Поверхностное культивирование P. pulmonarius в монокультуре и совместно с другими базидиомицетами на агаризованном сусле 45
2.2.5 Твердофазное культивирование P. pulmonarius на растительных субстратах 46
2.2.6 Глубинное культивирование P. pulmonarius 47
2.2.7 Изучение влияния условий культивирования на прирост глубин ной биомассы 48
2.2.8 Определение кинетических параметров роста глубинного мицелия
P. pulmonarius 49
2.2.9 Глубинное культивирование с применением способа иммобилизации мицелия 50
2.2.10 Исследование химического состава биомассы P. pulmonarius 51
Глава 3 Экспериментальная часть 55
3.1 Морфологические особенности штамма P. рulmonarius в монокультуре при выращивании в поверхностных и глубинных условиях 55
3.1.1 Морфологические особенности роста штамма Pleurotus pulmonarius при поверхностном культивировании с L. edodes, P. ostreatus и микромице том Trichoderma 61
3.2 Выращивание посевного материала методом глубинного культивирова ния P. pulmonarius 67 3.2.1 Влияние температуры и кислотность питательной среды на рост глубинной культуры P. pulmonarius .70
3.3 Химический состав глубинной биомассы P. pulmonarius 76
3.3.1 Аминокислотный состав белков биомассы P. pulmonarius 77
3.3.2 Жирнокислотный состав липидов биомассы P. рulmonarius 79
3.3.3 Элементный состав биомассы P. pulmonarius 81
3.4 Получение кормового продукта на основе растительного сырья 82
3.4.1 Переработка растительного сырья с применением глубинно твердофазного культивирования P. pulmonarius с последующим твердофазным культивированием с получением кормового продукта 87
3.5 Химический состав белкового кормового продукта 94
Выводы к главе 3 96
Глава 4 Технология получения белковых кормовых продуктов. Основные технико-экономические показатели производства 98
4.1 Технология получения белковых кормовых продуктов 98
4.2 Технико-экономические показатели производства .104
Выводы к главе 4 105
Заключение .106
Список литературы
- Высшие базидиальные грибы – перспективные продуценты в процессах биоконверсии растительной биомассы
- Изучение культурально-морфологических признаков мицелия P. рulmonarius
- Морфологические особенности роста штамма Pleurotus pulmonarius при поверхностном культивировании с L. edodes, P. ostreatus и микромице том Trichoderma
- Переработка растительного сырья с применением глубинно твердофазного культивирования P. pulmonarius с последующим твердофазным культивированием с получением кормового продукта
Высшие базидиальные грибы – перспективные продуценты в процессах биоконверсии растительной биомассы
В последние годы особый интерес исследователей привлекает изучение процессов переработки возобновляемой растительной биомассы в качестве субстрата для биоконверсии в ценные продукты, в том числе белковые. Считается, что для этих целей наиболее перспективными являются растительные отходы деревообрабатывающей промышленности (щепа, опилки и др.).
Красноярский край является одним из ведущих регионов по лесным запасам. В результате деательности деревообрабатывающих предприятий в крае ежегодно образуются и накапливаются древесные отходы (щепа, опилки). Отходы механической переработки имеют средний размер частиц 1 - 5 мм. Количество пентозанов у лиственных пород почти в два раза превышает их содержание у хвойных пород и составляет до 33 %, например у березы. Лиственные породы имеют более высокое содержание и легкогидролизуемых гемицеллюлоз до 40 %, которые сотоят из ксилозы, арабинозы, глюкозы, и уроновых кислот [17], что позволяет рассматривать возможность переработки древесных лиственных отходов в качестве субстрата.
В качестве растительных субстратов могут использоваться и продукты переработки сельскохозяйственного сырья (солома зерновых культур, биомасса топинамбура, кукурузы и др.). Основной зерновой культурой выращиваемой в Красноярском крае является пшеница. В 2007 г. в объеме продажи зерна на пшеницу в крае приходилось 74,5; на рожь – 1,2; на ячмень – 12,9; на овёс – 11,2 %, следовательно, наибольшее количество сельскохозяйственных отходов в крае приходится на пшеничную солому. Оценка состояния производства зерна проведенная А.Т. Стадником и др. [18] показывает, что производство пшеницы в нашем крае успешно развивается в хозяйствах Южно-лесостепной Ачинской и Канской природно экономических зонах. Наиболее эффективно производство пшеницы ведется в Ачинской зоне, валовое производство в которой составляет до 50 % от краевого уровня. Выход соломы учитывается по показателю, равному произведению урожая зерна на коэффициент, который для пшеницы составляет 1,3 – 1,5. Следовательно, при производстве пшеницы в 2014 г. в количестве 1424 тыс. тонн [19], объем растительных отходов (пшеничной соломы) в крае составил до 1994 тыс. тонн в год, а в Ачинской зоне – до 997 тыс. тонн в год.
В большинстве случаев растительные отходы сельского хозяйства используются в животноводстве в качестве добавки для придания рациону необходимого объема, или как добавка к рациону с большим количеством сочных кормов [20,21], или как дополнительный компонент в составе кормов с высоким содержанием белков. Однако такое применение растительных отходов является неэффективным, поскольку они характеризуются низким содержанием белка, несбалансированного по аминокислотному составу [1,21,22].
Исследования по переработке различных сельскохозяйственных отходов в кормовые продукты с улучшенными питательными свойствами проводились многими учеными: Л.А. Беловежец [23]; В.И. Панфилов [21]; В.Н. Дедков [24]; Д.В. Тарабукин [25]; M.Y. Murray [26]; Y. Toride [27], G. Lijuan [28] и др. В настоящее время в ряде стран проводятся исследования процесса биоконверсии растительной биомассы с использованием биологических агентов. Вместе с тем многие научные разработки не доходят до стадии промышленного производства, хотя есть и положительные примеры, так одним из методов, получивших промышленное применение, стал процесс, разработанный в университете Ватерлоо (Канада), основанный на выращивании целлюлозоразрушающих грибов Chaetomium cellulolyticum в поверхностной культуре [26]. В 1979 г. был разработан ферментно-дрожжевой способ получения углеводно-белкового корма из растительной биомассы [29].
Растительная биомасса является доступным и достаточно дешевым источником углеводов для производства белка. По некоторым оценкам, ежегодно на планете в процессах фотосинтеза образуется до 200 млрд. т растительной биомассы. Примерно столько же разлагается в природе, и лишь незначительная часть этой биомассы используется человеком [30].
В России на предприятиях деревоперерабатывающей и сельскохозяйственной промышленностях ежегодный объем отходов растительного сырья исчисляется сотнями миллионов тонн. Так, только соломы зерновых культур в стране ежегодно накапливается 150-200 млн. т. Солома по энергетической ценности приближается к зерну, но она характеризуется незначительным содержанием протеина и высоким содержанием клетчатки. Значительное количество отходов образуется при переработке кукурузы, подсолнечника, топинамбура, лубяных и других культур (кукурузная кочерыжка, подсолнечная лузга, хлопковая шелуха, стебли хлопчатника и многое другое). В таблице 1 приведен химический состав основных видов растительного сырья [17] для рассмотрения возможности использование его в качестве субстратов.
Изучение культурально-морфологических признаков мицелия P. рulmonarius
Аминокислотный состав белков анализировали методом ионообменной хроматографии с использованием автоматического анализатора аминокислот ААА–339 М (Mikrotechna, Чехия). Для проведения измерений предварительно был проведен гидролиз белков исследуемой пробы при температуре (104±1) оС. После окончания гидролиза ампулы охлаждали до комнатной температуры и их содержимое количественно переносили в фарфоровые чашки. Гидролизат упаривали при температуре 50 С на водяной бане в вытяжном шкафу. Сухой остаток чашек растворяли в 2 мл свежеприготовленного 0,2 М цитратного буфера (рН 2,2). Полученный раствор количественно переносили в центрифужные пробирки и центрифугировали в течение 15 мин при 9000 об/мин до полного осаждения нерастворимого остатка (гуминовых веществ). Полученную надосадочную жидкость анализировали в аминокислотном анализаторе. Количественный расчет содержания аминокислот проводили по соотношению площади пиков аминокислот, содержащихся в образцах, к площади пиков стандартных растворов аминокислот [134].
Определение содержания нуклеиновых кислот. Содержание нуклеиновых кислот определяли методом спектрофотометрии в ультрафиолетовой области в модификации, разработанной А.С. Спириным [111]. Для этого из пробы удаляли кислоторастворимые нуклеотиды путем экстракции 0,2 н HClO4 и проводили гидролиз остатка 0,5 н HClO4. Количественное содержания нуклеиновых кислот определяли на спектрофотометре СФ – 26 на длинах волн 270 нм и 290 нм, раствором сравнения служила 0,5 н HClO4.
Содержания полисахаридов в мицелии P. pulmonarius проводили путем определения редуцирующих веществ после гидролиза 2 %-й НCl методом эбулиостатического титрования, который основан на реакции восстановления меди из окисной формы (Сu2+) в закисную (Cu+) (метод Низовкина-Емельяновой) [129].
Содержание водорастворимых полисахаридов определяли по методике, описанной в работе [129]. Определение содержания липидов в мицелии P. pulmonarius. Липиды экстрагировали смесью растворителей хлороформ-метанол в соотношении 1:2 по объему [136]. Метиловые эфиры жирных кислот были получены после кислотного метанолиза липидов. Метиловые эфиры жирных кислот анализировали на хромато-масс-спектрометре GC-MS 7890/5975C (“Agilent Technologies”, U.S.), используя капиллярную колонку HP-FFAP длиной 30 м и внутренним диаметром 0,25 мм. Условия хроматографирования: газ-носитель – гелий, скорость 1 мл/мин; температура ввода проб – 220 оС, начальная температура хроматографирования 120 оС, подъем температуры до 190 оС со скоростью 3о С/мин, 5 мин изотермальный режим и далее до 230 оС со скоростью 10 оС/мин и 20 мин изотермальный режим: температура интерфейса – 240 оС, температура ионного источника – 175 оС; режим электронного удара при 70 eV; режим сканирования фрагментов от 45 до 450 m/z при 0,5 с/с. Положение двойных связей в ненасыщенных жирных кислотах устанавливали по масс-спектрам диметилоксазолиновых производных жирных кислот. Определение элементного состава биомассы P. pulmonarius проводили методом рентгенофлуоресцентной спектроскопии на энергодисперсионном рентгенофлуоресцентном спектрометре Clever С-31. Диапазон определения концентрации элементов от Na до U в пределах 0,0001–100 %. Условия анализа: напряжение на рентгеновской трубке – 15 кV; анодный ток рентгеновской трубки – 500 мА; время анализа – 100 с; среда – вакуум.
Определение содержания витаминов (В1,В2,С,РР) проводили по методикам, описанным в работах [137]. Определение содержания лигнина в растительном субстрате проводили с использованием 72 % H2SO4 по методике в модификации Комарова [138]. Изучение зоопатогенности мицелия штамма P. рulmonarius было проведено в Краевой ветеринарной лаборатории г. Красноярска.
Статистическая обработка экспериментальных данных. Экспериментальные исследования проводили на приборах, прошедших метрологическую поверку. Статистическую обработку результатов экспериментов выполняли в соответствии со стандартными методами, в том числе с использованием программ Table Curve TM и Excel. Статистические характеристики качества аппроксимации экспериментальных данных соответствующими уравнениями были получены с помощью программы Table Curve TM.
Морфологические особенности роста штамма Pleurotus pulmonarius при поверхностном культивировании с L. edodes, P. ostreatus и микромице том Trichoderma
В процессе биоконверсии химический состав растительного субстрата обогащается компонентами грибного мицелия. В связи с этим представляло интерес изучение химического состава глубинной биомассы P. рulmonarius, используемой в качестве посевного материала при получении белкового кормового продукта, а также химический состав плодовых тел P. рulmonarius, которые могут быть получены в процессе переработки растительной биомассы. Полученные результаты представлены в таблице 3.5.
Нуклеиновые кислоты 1,1 ± 0,1 4,0 ± 0,2 Минеральные вещества (зольность) 3,7 ± 0,2 5,3 ± 0,3 Из результатов, представленных в таблице 3.5, видно, что основными компонентами как глубинной биомассы, так и биомассы плодовых тел являются белок, полисахариды и водорастворимые вещества. В процессе биосинтеза в плодовых телах накапливается полисахаридов в 1,3 раза больше, чем в глубинной культуре, при этом содержание легкогидролизуемых полисахаридов от суммы углеводов в обоих случаях примерно близко и составляет 70-80 %. В глубинной биомассе образуется в 1,5 раза больше липидов, чем в биомассе плодовых тел. В то же время биомасса плодовых тел характеризуется более высоким (в 1,4 раза) содержанием минеральных веществ. В процессе изучения химического состава глубинной биомассы P. pulmonarius также было определено содержание некоторых витаминов. Содержание витамина В1 составило 12,6 мг % а.с.м., витамина С около 0,06 мг % а.с.м., витамин РР (ниацин) – 3,27 мг % а.с.м., флавоноидов – 2,35 % а.с.м.
По результатам исследований установлено, что в процессе развития P. рulmonarius накапливает нуклеиновых кислот в глубинной культуре 1,1 %, что в 3,5 раза ниже, чем в плодовых телах (4,0 %). Важным показателем пищевой и кормовой ценности продукта является отношение содержания белков в продукте к содержанию в нем нуклеиновых кислот. Данный показатель для глубинной культуры P. pulmonarius составляет 28,6, для биомассы плодовых тел P. pulmonarius – 9,2. Известно, что для дрожжевой культуры показатель составляет 4,2 [57]. Таким образом, гдубинная биомасса P. pulmonarius имеет значительные преимущества при использовании её в качестве белковых кормовых продуктов в сравнении с кормовыми дрожжами, использование которых ограничивается высоким содержанием нуклеиновых кислот.
Биологическая ценность белков биомассы P. pulmonarius определяется наличием в их составе незаменимых аминокислот. По методике, описанной в п.2.2.11, был определен аминокислотный состав белков биомассы P. pulmonarius. Результаты представлены в таблице 3.6.
Из приведенных в таблице 3.6 данных видно, что в исследуемых образцах были идентифицированы семнадцать аминокислот, в том числе семь незаменимых и две – условно-незаменимых. Количественное содержание в белках глубинной биомассы и белках плодовых тел таких аминокислот, как треонин, валин, лейцин, фенилаланин с тирозином, превосходит содержание данных аминокислот в эталонном белке сравнения. Хроматограммы гидролизата белков глубинной биомассы и белков биомассы плодовых тел представлены в приложении Г.
Известно, что существует взаимосвязь между аминокислотным составом белка и степенью его расщепления пищеварительными ферментами. С увеличением значения соотношения (аргинин+лизин / про-лин) увеличивается перевариваемость продукта, например, для белка риса оно составляет 4, соевой муки – 2,1 [142]. Для глубинной культуры P. pulmonarius это соотношение составило 2,9, а для биомассы плодовых тел P. pulmonarius – 2,5.
Результаты исследования показали, что использование растительного сырья в процессе биоконверсии позволяет получать продукт с высоким содержанием белка за счет его высокого содержания в мицелии гриба (до 32 %), сбалансированного по аминокислотному составу.
При изучении возможности применения глубинной биомассы для получения белковых кормовых продуктов было проведено исследование жирнокислотного состава липидов, выделенных из глубинной биомассы и плодовых тел P. рulmonarius. Исследования жирнокислотного состава липидов проводили по методике, описанной в п. 2.2.11.
В составе липидной фракции глубинной биомассы идентифицированы 28, а в липидной фракции плодовых телах – 29 индивидуальных жирных кислот, рaзличающихся по числу углеродных атомов, числу и положению двойных связей. Полученные результаты представлены в таблице 3.7.
Переработка растительного сырья с применением глубинно твердофазного культивирования P. pulmonarius с последующим твердофазным культивированием с получением кормового продукта
На предферментационной стадии осуществляется подготовка и стерилизация питательной среды и оборудования. В сборник-смеситель (14) из сборников (5-12) подаются растворы питательных солей. Для завершения растворения в смеситель (14) подается острый пар с температурой 70 оС. В результате конденсации которого достигается необходимый объем питательной среды.
Крахмалсодержащий компонент питательной среды готовится в сборнике-смесителе (3), оснащенном рубашкой для подогрева и перемешивающим устройством. После проведения процесса клейстеризации в раствор крахмала из сборника-дозатора (2) подается фермент для поведения частичного ферментативного гидролиза, что позволяет уменьшить вязкость коллоидного раствора крахмала. Приготовленный раствор крахмала насосом подается в сборник-смеситель (14) и смешивается с раствором минеральных солей. Приготовленная питательная среда насосом подается в стерилизатор (15), где стерилизуется при температуре 150-160 оС в течение нескольких секунд. В качестве нагревающего агента используется насыщенный водяной пар (максимальная температура нагрева при 1,0-1,2 МПа составляет 180-190 оС). Далее раствор поступает в выдерживатель питательной среды (16) и далее охлаждается в холодильной установке (17) до 23 оС (охлаждающим агентом в трубчатом теплообменнике является вода). Питательная среда по стерильному трубопроводу подаётся на стадию подготовки посевного материала, на стадию основного производства или в сборник питательной среды (18).
Стадия получения глубинной культуры P. pulmonarius, используемой в качестве посевного материала для глубинно-твердофазного культивирования. Чистая культура базидиомицета хранится на агаризованном сусле в чашках Петри при температуре плюс 5 оС и используется в качестве посевного материала при выращивании инокулята в глубинных условиях в колбах на качалках (19). Выращенная чистая культура подается в биореактор-инокулятор (20) объемом 10 л. Концентрация глубинной биомассы после засева составляет около 2 г/л и выращивается до концентрации биомасссы 13-14 г/л в течение 60 ч при постоянном перемешивании и аэрации воздухом. Культуральная жидкость с выращенной глубинной биомассой по стерильному трубопроводу самотеком поступает в посевной биореактор-инокулятор (21) объемом 100 л (рабочий объем 50 л). Концентрация глубинной биомассы после засева составляет около 5 г/л и биомасса выращивается до концентрации 16 г/л. Далее выращенная культура поступает в посевной биореактор объемом 1 м3 (рабочим объемом 0,5 м3) (22). Выращенная глубинная биомасса совместно с культуральной жидкостью по стерильному трубопроводу подается на стадию получения белкового кормового продукта.
Стадия получения белкового кормового продукта предусматривает глубинно-твердофазное и твердофазное культивирование P. pulmonarius. Глубинно-твердофазное культивирование P. pulmonarius проводится отъемно-доливным способом в производственном биоректоре (27) объемом 3 м3 (рабочий объем 1,4 м3) при непрерывном перемешивании и подаче воздуха, поступающего с очистительных фильтров (26). В биореактор (27) подаётся стерильная питательная среда из смесителя (25) и измельченный до размеров 3 - 5 мм, простерилизованный растительный субстрат (содержание которого составляет 9-10 г/л). Засев проводится глубинной культурой P. pulmonarius объемом 0,5 м3 (содержание биомассы 7 кг), поступающей из посевного биореактора (22). Культивирование проводится течение 30 ч. По окончании процесса культивирования культуральная жидкость с иммобилизованным мицелием на частичках растительного субстрата в объеме 1,0 м3 (содержание биомассы 16 кг) передается в смеситель глубинно-твердофазной культуры и растительного субстрата (28).
В биореактор (27) вновь вносится измельченный растительный субстрат и заливается свежая питательная среда до объема 1,4 м3 (концентрация биомассы мицелия при этом составит 5 г/л), и начинается следующий цикл. Продолжительность одного цикла составляет 36 ч (в том числе: 30 ч – глубинно-твердофазное культивирование; 6 ч – слив культуральной жидкости и заполнение биореактора свежей питательной средой). В аппарате (28) проводится смешение культуральной жидкости, содержащей в своем составе мицелий, иммобилизованный на растительном субстрате, с измельченным (3 - 5 мм) и простерилизованным субстратом в соотношении 1 : 5 (т.е. на 1 м3 растительного субстрата – 0,2 м3 культуральной жидкости. При этом плотность загрузки растительного субстрата составит около 100 кг/м3). Далее растительная биомасса с равномерно распределенным по всему объему грибным мицелием фасуется в полимерные лотки (площадь лотка 1,5 м2, толщина слоя засеянного субстрата в лотке 10-12 см). Заполненные лотки устанавливаются в растильной камере друг на друга в виде вертикальных этажерок высотой около 2 м. Продолжительность твердофазного культивирования составляет 14-18 сут.
Твердофазное культивирование проводится при температуре (23±1) оС и влажности воздуха 80 - 85 % с соблюдением стерильных условий до полного прорастания субстрата грибным мицелием (стадия «белого блока»). Полученный продукт сушится в камерной сушилке периодического действия, работающей при атмосферном давлении [128], упаковывается и отправляется потребителям. Рост грибного мицелия на субстратном блоке можно проводить и до стадии образования плодовых тел. В результате дополнительно можно получать до 12 т в год плодовых тел.