Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1 Аналитический обзор 8
1.1 Растительное сырье как объект микробиологической переработки 8
1.2 Предобработка растительного сырья 13
1.3 Дереворазрушающие базидиомицеты – перспективные продуценты для конверсии лигноцеллюлозного растительного сырья... 19
2.1 Характеристика Pleurotus ostreatus PO-4.1 и Pleurotus djamor PD-3.2 30
2.2 Характеристика растительного сырья 32
2.3 Метод гидродинамической активации растительного сырья 32
2.4 Выделение и хранение чистых культур 32
2.5 Изучение культуральных и морфологических признаков Pleurotus ostreatus PO-4.1 и Pleurotus djamor PD-3.2 2.6 Молекулярно-генетическая идентификация Pleurotus ostreatus PO-4.1 и Pleurotus djamor PD-3.2 34
2.7 Глубинное культивирование штаммов Pleurotus 34
2.8 Глубинно-твердофазное культивирование штаммов Pleurotus 35
2.9 Твердофазное культивирование штаммов Pleurotus 2.10 Изучение влияния условий культивирования на рост глубинной биомассы Pleurotus ostreatus PO-4.1 и Pleurotus djamor PD-3.2 36
2.11 Определение кинетических параметров роста мицелия штаммов Pleurotus ostreatus PO-4.1 и Pleurotus djamor PD-3.2 в условиях глубинного культивирования 36
2.12 Исследование химического состава глубинной культуры Pleurotus
ostreatus PO-4.1 и Pleurotus djamor PD-3.2, растительного сырья и
кормового продукта 38
2.13 Статистическая обработка экспериментальных данных 50
ГЛАВА 3 Экспериментальная часть 51
3.1 Растительное сырь е как объ ект для микр оби ологической п ер ераб отки 51
3.2 Pleurotus ostreatus PO-4.1 и Pleurotus djamor PD-3.2: культуральные и морфологические признаки 56
3.3 Исследование процесса глубинного культивирования Pleurotus ostreatus PO-4.1и Pleurotus djamor PD-3.2 64
3.4 Химический состав глубинных культур Pleurotus ostreatus PO-4.1 и6 Pleurotus djamor PD-3.2 7 74
3.5 Микробиологическая переработка растительного сырья культурами Pleurotus ostreatus PO-4.1 и Pleurotus djamor PD-3.2 92
Выводы по главе 3 107
ГЛАВА 4 Технология микробиологической переработки растительного сырья с получением кормовых продуктов 110
4.1 Выбор и обоснование технологических процессов 111
4.2 Основные технико-экономические показатели производства.. 117
Выводы по главе 4 118
Заключение 119
Биб ли ог рафически й спис ок
- Предобработка растительного сырья
- Метод гидродинамической активации растительного сырья
- Определение кинетических параметров роста мицелия штаммов Pleurotus ostreatus PO-4.1 и Pleurotus djamor PD-3.2 в условиях глубинного культивирования
- Химический состав глубинных культур Pleurotus ostreatus PO-4.1 и6 Pleurotus djamor PD-3.2 7
Введение к работе
Актуальность исследования. Переработка растительного сырья неизбежно приводит к накоплению значительного количества отходов, относительно устойчивых к микробному разложению. Только в Красноярском крае объемы отходов лесозаготовки и деревообработки в 2013 году составили 4,9 млн м3, из них перерабатывается - не более 12 %. В настоящее время для решения этой актуальной проблемы используют разные подходы, при этом зачастую основными методами утилизации растительных отходов остаются складирование на полигонах, сжигание и уплотнение, что небезопасно экологически и нецелесообразно экономически. Одним из наиболее перспективных направлений утилизации в данном случае является микробиологическая конверсия растительных отходов, позволяющая не только в значительной мере расширить сырьевую базу промышленной биотехнологии, существенно уменьшить загрязнение окружающей среды, но и ликвидировать дефицит высококачественных богатых белком кормовых продуктов, испытываемый сегодня сельским хозяйством.
Базидиомицеты рода Pleurotus (грибы белой гнили) - перспективные продуценты при переработке растительных отходов, имеющие относительно высокую скорость роста, развитую мультиферментную систему, позволяющую им использовать в своем питании и целлюлозу, и другие полисахариты, и лигнин. Вместе с тем, уровень активности внеклеточных ферментов имеет существенную штаммовую и видовую вариабельность, поэтому необходим поиск и изучение новых штаммов ба-зидиомицетов, перспективных для практического применения. Для целей микробиологической конверсии растительных отходов могут быть использованы вешенка обыкновенная {Pleurotus ostreatus) и вешенка розовая {Pleurotus djamor). Их плодовые тела являются полноценным белковым продуктом питания. Предполагается, что и глубинная биомасса вешенок может рассматриваться как природный источник белка; также большой интерес представляет использование глубинного мицелия в качестве посевного материала для получения богатых белком кормовых продуктов. В технологии микробиологической переработки необходимо предусмотреть эффективную подготовку растительного сырья, повышающую доступность его лигноцел-люлозного комплекса действию ферментов продуцента, увеличивающую степень утилизации сырья, выход продукта и сокращающую продолжительность конверсии.
Цель работы: разработка технологии микробиологической конверсии растительных отходов глубинными культурами Plerotus ostreatus РО-4.1 и Pleurotus djamor PD-3.2 с предварительной гидродинамической активацией сырья и получением обогащенных белком кормовых продуктов.
Задачи, которые должны быть решены:
исследовать растительное сырье (древесные опилки, вегетативная часть топинамбура) до и после гидродинамической активации и установить его пригодность для микробиологической переработки;
изучить морфологические и культуральные характеристики штаммов Pleurotus ostreatus РО-4.1 и Pleurotus djamor PD-3.2, выращенных в поверхностных и глубинных условиях; разработать режимы и условия глубинного культивирования; исследовать химический состав глубинной биомассы;
разработать технологические режимы глубинно-твердофазного культивирования Pleurotus ostreatus РО-4.1 и Pleurotus djamor PD-3.2 с использованием гид-
4 родинамически активированного растительного сырья и твердофазного культивирования с получением кормовых продуктов;
исследовать химический состав продуктов микробиологической конверсии растительного сырья, дать оценку возможности их использования в качестве обогащенных белком кормовых продуктов;
разработать технологию опытного производства микробиологической переработки древесных отходов и вегетативной части топинамбура с получением кормовых продуктов.
Объект исследований: процессы микробиологической переработки растительного сырья в условиях глубинного и глубинно-твердофазного культивирования штаммов Pieurotus ostreatus РО-4.1 и Pieurotus djamor PD-3.2 с предварительной гидродинамической активацией сырья.
Предмет исследования: условия получения биомассы мицелия Pieurotus ostreatus РО-4.1 и Pieurotus djamor PD-3.2 при глубинном, глубинно-твердофазном культивировании; влияние гидродинамической обработки на эффективность микробиологической переработки растительного сырья; технологические режимы и технология опытного производства обогащенного белком кормового продукта.
Научная новизна:
впервые установлено влияние гидродинамической обработки на эффективность микробиологической переработки и степени конверсии растительного сырья (сосновых опилок и вегетативной части топинамбура) штаммами Pieurotus ostreatus РО-4.1 и Pieurotus djamor PD-3.2;
установлены закономерности выращивания биомассы глубинного мицелия Pieurotus ostreatus РО-4.1 и Pieurotus djamor PD-3.2 и определены основные количественные показатели её роста;
изучены культуральные и морфологические характеристики глубинного и поверхностного мицелия Pieurotus ostreatus РО-4.1 и Pieurotus djamor PD-3.2;
исследован химический состав глубинных культур Pieurotus ostreatus РО-4.1 и Pieurotus djamor PD-3.2 и кормовых продуктов, полученных конверсией сосновых опилок и вегетативной части топинамбура. Показано, что продукты обогащены витаминами, полиненасыщенными жирными кислотами, характеризуются более высокой биологической ценностью (белка - 14-17 %, незаменимых аминокислот в белке - до 40-45 %, нуклеиновых кислот - менее 1 %) и перевариваемостью (более 50 %) по сравнению известными кормовыми продуктами растительного происхождения.
Практическая ценность работы: на основании экспериментальных исследований разработан технологический режим глубинно-твердофазного культивирования Pieurotus ostreatus РО-4.1 и Pieurotus djamor PD-3.2 на среде, содержащей не более 1 % крахмала и 3 % гидродинамически активированного растительного сырья, с получением посевного материала, содержащего около 14,5 г/л биомассы глубинной культуры, адаптированной к растительному сырью. Применение такого посевного материала на стадии твердофазной ферментации механически измельченного сырья позволяет втрое сократить продолжительность данной стадии по сравнению с известными технологиями прямой микробиологической конверсии растительного сырья; в зависимости от используемого штамма-продуцента, довести степень конверсии сырья до 65-70 % и получить выход продукта до 55-60 % с содержанием белка - 14-17 %.
5 Разработана карта экспресс-оценки чистоты культуры, позволяющая оперативно осуществлять текущий микробиологический контроль на производстве, и рекомендации по составу растительного субстрата для каждого продуцента.
Положения, выносимые на защиту: в рамках специальности 05.21.03 - Технология и оборудование химической переработки биомассы дерева; химия древесины в соответствии с п. 9 - «Биохимия и микробиологическая переработка растительного сырья» на защиту выносится:
влияние гидродинамической обработки на химический состав и свойства растительного сырья (сосновые опилки и вегетативная часть топинамбура), предназначенного для микробиологической конверсии;
культуральные и морфологические характеристики поверхностного и глубинного мицелия Pleurotus ostreatus РО-4.1 и Pleurotus djamor PD-3.2 и разработанная на их основе карта экспресс-оценки чистоты культуры;
химический состав кормовых продуктов, полученных микробиологической переработкой растительного сырья;
технологические режимы получения биомассы мицелия Pleurotus ostreatus РО-4.1 и Pleurotus djamor PD-3.2 глубинным и глубинно-твердофазным способом;
технология опытного микробиологического производства по выпуску 100 тонн в год кормового продукта.
Апробация работы. Основные положения диссертации представлялись па. международных: «Наука и образование: опыт, проблемы, перспективы развития» (Красноярск, 2014), «Биотехнологии в химико-лесном комплексе» (Архангельск, 2014), «Наука и современность» (Уфа, 2015) и всероссийских: «Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья» (Барнаул, 2014), «Лесной и химический комплексы - проблемы и решения» (Красноярск, 2014, 2015), «Молодые ученые в решении актуальных проблем науки» (Красноярск, 2014-2016), «Фундаментальные и прикладные аспекты биотехнологии» (Иркутск, 2015) конференциях.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 18 печатных работ, в том числе 6 статей в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.
Личный вклад автора. Автором осуществлен подбор методов исследования, планирование и проведение экспериментов по культивированию штаммов; получение и подготовка образцов биомассы мицелия и кормовых продуктов, анализы, обработка результатов; разработка технологии опытного цеха; подготовка тезисов, статей.
Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, 4-х глав, выводов, 5 приложений. Библиографический список включает 203 источника. Текст диссертации изложен на 157 с, содержит 22 рисунка и 27 таблиц.
Предобработка растительного сырья
Для эффективной микробиологической конверсии растительного сырья с высоким содержанием целлюлозы, лигнина, а также смолистых веществ целесообразно проведение его предварительной обработки в целях повышения биодоступности для продуцента. К настоящему времени известны и используются различные методы предобработки, в основе которых лежит физическое, химическое и биологическое воздействие на растительную биомассу. Предварительная обработка, являясь одной из важнейших стадий переработки растительной биомассы, изменяет структуру лигноцеллюлозного комплекса. Важно, что этому сопутствует увеличение площади доступной поверхности лигноцеллюлозы; также при этом происходит частичная деполимеризация и декристаллизация целлюлозы, растворение гемицеллюлоз, изменение в структуре и содержании лигнина [32].
Эффективность использования растительных субстратов существенно повышает их химическая предобработка. В условиях производства применимы два основных направления этого метода – щелочная обработка и кислотный гидролиз. Широко известен метод обработки соломы гидроксидом натрия. Этот метод основан на способности щелочи разлагать лигнин и вызвать набухание целлюлозы. Обработку рекомендуется проводить в две стадии, вторая стадия включает в себя автоклавирование соломы в щелочном растворе [29, 32].
В Советском Союзе, начиная с 30-х годов XX века, всесторонне исследовался гидролиз древесного сырья минеральными кислотами [29, 48]. Этот процесс был положен в основу создания гидролизной промышленности, выпускавшей в качестве конечной продукции этанол, фурфурол, ксилит, кормовые дрожжи и др.[48, 50].
При сравнении технологических режимов переработки растительного сырья и процессов, при этом протекающих, наиболее перспективным можно считать гидролиз с применением концентрированной серной кислоты, по сравнению с использованием соляной кислоты, поскольку отмечается ряд существенных преимуществ, основными из которых являются: отсутствие летучести у кислоты, меньший износ оборудования из-за коррозии, возможность непрерывного ведения процесса и исключение из него стадии регенерации катализатора [29].
Необходимо отметить, что применение жестких химических реагентов, к которым относятся минеральные кислоты и щелочи, нецелесообразно при подготовке субстратов к микробиологической конверсии. Минеральная составляющая, попадающая в субстрат при обработке, не утилизируется микроорганизмами-продуцентами и практически всегда ингибирует их рост [29]. Также необходимы дополнительные затраты на очистку сточных вод при ведении процесса с использованием сильных кислот. С учетом вышесказанного, перспективными являются процессы гидролиза без использования трудно утилизируемого катализатора [48].
В связи с вышесказанным, в настоящее время активно исследуются процессы предобработки растительного сырья для проведения ферментативного гидролиза. Среди наиболее широко применяемых в последние десятилетия в мировой практике способов – обработка сырья слабыми минеральными кислотами, щелочами и гидротермальная обработка, относящиеся к наиболее изученным [61-63].
В работах Е.А. Скибы с сотрудниками [64] и О.В. Байбаковой [65] показано влияние предварительной обработки лигоноцеллюлозного сырья на протекание ферментативного гидролиза: отмечается, что продукты деструкции лигнина ингибируют процесс, а при их удалении эффективность ферментативного гидролиза повышается. Исследования В.П. Саловаровой [66] экспериментально обоcновывают использование щелочной, окислительно-щелочной, водно-бута-нольной и азотнокислой делигнификаци лигноцеллюлозного сырья с целью комплексной переработки вторичных растительных ресурсов, предлагаются оптимальные режимы предобработки, которые ведут почти к 100 % конверсии субстратов при их ферментативном гидролизе техническими препаратами.
Не менее важным, чем делигнификация растительного сырья, является увеличение степени доступности самой целлюлозы для ферментной обработки. Отмечается, что по мере снижения степени кристалличности целлюлозы, повышается ее доступность для ферментативного гидролиза [67, 68].
В работах О.В. Голязимовой с сотрудниками [69, 70] исследуется процесс активации ферментативного гидролиза растительной биомассы с помощью периодического механического измельчения субстрата, производимого по мере снижения скорости ферментативного процесса, в результате чего наблюдается повышенный выход редуцирующих веществ от массы исходного сырья.
Также хорошо известен способ предобработки лигноуглеводных материалов с использованием «парового взрыва» или автогидролиза – предобработки водяным паром под давлением, повышающей конверсию сырья, в первую очередь, за счет расщепления гемицеллюлоз как легкогидролизуемых компонентов [71, 72].
Целесообразным представляется сочетание нескольких методов подготовки растительной биомассы для последующего эффективного использования, предложенных в работах [73, 74], где исследуется влияние механохимических воздействий на эффективность ферментативного гидролиза растительного сырья: в результате последовательного применения гидротермической и щелочной либо кислотной предобработки растительной массы и ее последующего ферментативного гидролиза получаются глюкозо-пентозные гидролизаты с преимущественным – до 80 % содержанием глюкозы
Одним из основных эффективных методов предварительной обработки сырья для дальнейшей биоконверии, ферментативной или химической обработки является механическое измельчение. Существует ряд приемов измельчения как древесного, так и недревесного сырья с помощью мельниц различных типов и получением частиц разного размера. В результате такого воздействия достигается увеличение удельной поверхности сырья, способности к гидратации и повышение доступности его углеводного комплекса для дальнейшей химической или ферментативной обработки [29, 75].
Метод гидродинамической активации растительного сырья
Содержание индивидуальных зольных компонентов определяли рентге-но-флуорисцентным методом с помощью прибора марки «Спектроскан 004» (НПО «СПЕКТРОН», С.-Пб).
Исследование белков. Легкорастворимые белки выделяли с помощью 0,01М трис-HCl буфера (рН 8,3) [180]. Для этого навеску биомассы суспендировали в буфере и выдерживали в течение одного часа, периодически встряхивая. Водорастворимые и слабосвязанные с мембранами белки (периферические), перешедшие в раствор, отделяли центрифугированием при 9000 об/мин в течение 15 минут. Для полного извлечения экстрагирование проводили три раза.
Содержание общего и легкорастворимого белка в сырье, глубинной биомассе, кормовом продукте определяли с помощью красителя амидо-черного 10В по методу, описанному Г.А. Бузуном и др. в работе [181]. Для определения брали навеску 100 мг и гомогенизировали с 10 мл воды, отбирали по 0,5; 1; 1,5 и 2 мл в пробирку для центрифугирования на 10 мл, затем добавляли 1 мл осаждающего реагента и выдерживали при комнатной температуре в течение 60 мин. Опыт проводили в 3 повторностях. Осаждающий реагент состоял из 37,65 г лимонной кислоты; 1,136 г Na2HP04 Х12Н2O; 0,6 г амидо-черного 10 В и дистиллированной воды до литра. Через 60 мин объем в пробирке доводили до 10 мл и центрифугировали в течение 10 мин при 9000 об/мин. Количественное содержание белка определяли спектрофотометрически с помощью фотоэлектрокало-риметра ФЭК-56 М со светофильтром при длине волны 590 нм. Калибровочную кривую строили по смеси бычьего сывороточного альбумина, рибонуклеазы и интерферона человеческого лейкоцитарного.
Аминокислотный состав белков [182] определяли на автоматическом анализаторе аминокислот ААА 339М (Microtechna, Чехия). Пробы для анализа готовили следующим образом: образец, содержащий белок (около 25 мг) помещали в специальные ампулы, добавляли по 10 мл 6 н HCl. Ампулы запаивали, ставили в термостат на 24 ч при температуре 103-105 С. После окончания гид ролиза ампулы охлаждали, вскрывали, содержимое ампул количественно переносили в фарфоровые чашки. Чашки с гидролизатом ставили на водяную баню в вытяж-ной шкаф и выпаривали (с вентилятором) при температуре не более 50 С. После выпаривания HCl в чашки добавляли дистиллированную воду, снова выпаривали досуха. Операцию повторяли 3-4 раза. После полного удаления HCl чашки охлаждали и добавляли по 2 мл 10 % изопропилового спирта. Содержимое чашек тщательно перемешивали стеклянными палочками для полного растворения аминокислот и переносили в центрифужные пробирки, затем центрифугировали в течение 10 мин при 4000 об/мин. Растворы аминокислот сливали в сухие пробирки, плотно закрывали пробками и сохраняли в холодильнике для дальнейших анализов.
Биологическую ценность белков рассчитывали по величине показателя скора [183]. В качестве шкалы сравнения использовали эталонный образец - казеин с оптимальным содержанием незаменимых аминокислот, предложенный Объединенным экспертным комитетом ФАО/ВОЗ [184].
Исследование углеводов растительного сырья, глубинного мицелия Pleurotus и кормового продукта проводили по методике [179, 176].
Определение содержания моносахаридов. Навеску 2,5 г исследуемого материала заливали 25 мл дистиллированной воды, растирали в фарфоровой ступке и центрифугировали 15 мин при 8000 об/мин, затем сливали надо-садочную жидкость, замеряли объем, разбавляли в два раза дистиллированной водой и определяли в ней содержание редуцирующих веществ (РВ) по методу Бертрана [176]. Осадок использовали для определения содержания легкогидро-лизуемых полисахаридов (ЛГП). Массовую долю редуцирующих веществ (Хр в), %, в надосадочной жидкости рассчитывали по формуле Хр.в. = Т 100 / Vх 1000, (4) где V - объем гидролизата, израсходованный на титрование 10 мл медно-щелочного раствора; Т - титр медно-щелочного раствора. Затем вычисляли массовую долю моносахаридов (Хмс), %, к массе абсолютно сухого исследуемого материала по формуле Хм.с. = Хр.в. х V х Кл / g, (5) где Хрв - массовая доля редуцирующих веществ в материале, %; V - объем надосадочной жидкости, мл; Кл - коэффициент пересчета моносахаридов в полисахариды для грибного мицелия = 0,885; g - а.см. исследуемого материала, г. Определение содержания ЛГП. Осадок после извлечения моносахаридов нагревали со 100 мл 2 %-й НС1 в колбе с обратным холодильником над электрической плиткой при слабом кипячении 3 ч. По окончанию раствор фильтровали через бумажный фильтр на воронке Бюхнера. Остаток на фильтре промывали горячей водой до отрицательной реакции на кислоту. Фильтрат и промывные воды сливали вместе и доводили водой в мерной колбе до 250 мл [179].
Содержание редуцирующих веществ в растворе определяли по [176]. Вычисляли массовую долю ЛГП (Хлгп), %, к а.с.м. исследуемого материала по формуле Хлгп = Хрв х V х Кл / g х 100 х 100, (6) где Хрв - массовая доля РВ в материале, %; V - объем гидролизата, мл; Кл - коэффициент пересчета моносахаридов в полисахариды: для грибного мицелия = 0,885; g - а.см. исследуемого материала, г. Определение содержания трудногидролизуемых полисахаридов (ТГП). Остаток исследуемого материала после гидролиза ЛГП и промывки количественно переносили с фильтра в стакан на 100 мл и высушивали до воздушно-сухого состояния, затем обрабатывали 7,5 мл 80 %-й H2SO4 при комнатной температуре в течение 3 ч, периодически перемешивали стеклянной палочкой. Смесь из стакана количественно переносили в коническую колбу вместимостью 250 мл, смывая 100 мл дистиллированной водой. Колбу присоединяли к обратному холодильнику и кипятили на электрической плитке в течение 3 ч. После окончания гидролиза фильтровали раствор через воронку Бюхнера с бумажным фильтром. Остаток на фильтре промывали небольшими порциями горячей воды до отрицательной реакции на кислоту по индикатору метиловому оранжевому. Фильтрат и промывные воды переносили в мерную колбу на 500 мл. После охлаждения доводили объем раствора до метки дистилли-рованной водой и тща-тельно перемешивали. Из полученного раствора отбирали пипеткой 50 см в мерную колбу на 100 мл и осторожно при постоянном перемешивании нейтра-лизовывали 2 н NaOH по метиловому оранжевому. Объем раствора доводили до метки дистиллированной водой до 100 мл. В нейтра-лизованном растворе обратным титрованием определяли концентрацию РВ [176, 179]. Массовую долю РВ в разбавленном нейтрализованном гидролизате полисахаридов (Хп), %, соответственно, рассчитывали по формуле
Определение кинетических параметров роста мицелия штаммов Pleurotus ostreatus PO-4.1 и Pleurotus djamor PD-3.2 в условиях глубинного культивирования
Качество и количество биомассы, получаемой при микробиологическом производстве и используемой для переработки растительного сырья с получением продуктов биоконверсии, во многом определяется видом штамма-продуцента. В этой связи, характеризуя Pleurotus ostreatus PO-4.1 и Pleurotus djamor PD-3.2, в первую очередь необходимо исследовать и описать их культуральные и морфологические признаки, необходимые для постоянного микробиологического контроля чистоты культур на производстве. Для облегчения этого процесса необходимо разработать карту экспресс-оценки продуцента, в которой собраны характеристики каждого производственного штамма, позволяющие с использованием стандартного лабораторного оборудования и набора базовых методов проводить текущий контроль используемой на производстве культуры.
Самым надежным методом идентификации и подтверждения чистоты культуры гриба является получение плодового тела. В лабораторных условиях были получены плодовые тела P. ostreatus PO-4.1 и P. djamor PD-3.2, демонстрирующие весь набор необходимых для видовой идентификации макроморфо-логических признаков (рисунок 3.1) а – плодовые тела P. ostreatus б – плодовые тела P. djamor Плодовые тела Pleurotus ostreatus и Pleurotus djamor, полученные в лабораторных условиях
Плодовые тела обоих видов образуют сростки, шляпка эксцентрическая, вдавленная. Гименофор пластинчатый, пластинки частично сросшиеся. Обра 58 щает на себя внимания различия в окраске плодовых тел. У P. ostreatus ножка белая, шляпка светло-серая, темнеющая к краям. Шляпка и верхняя часть ножки плодового тела P. djamor окрашены в характерный для этого вида розовый цвет.
Следует принять во внимание трудоемкость и значительную длительность такой идентификации, поскольку для выгонки плодовых тел требуется около 30 суток, соответственно такой метод контроля чистоты культуры неэффективен в условиях непрерывного производства, основанного на конверсии растительных субстратов грибными культурами.
Для разработки критериев микробиологического контроля продуцента, применимых на производстве, необходимо определить совокупность культу-рально-морфологических признаков используемых штаммов P. ostreatus и P. djamor, позволяющих осуществлять текущий контроль чистоты и состояния культуры с высокой достоверностью. К критериям подобного рода можно отнести форму и цвет колоний на поверхности плотных сред, окраску среды, выделение экссудата, запах. На микроуровне необходимо исследовать строение гиф, оценить формирование в культуре мицелиальных тяжей, анастомозов, ризо-морф, пряжек и иных образований. Наличие пряжек служит одним из основных признаков, подтверждающих принадлежность к базидиальным грибам, однако существуют базидиомицеты, на гифах которых пряжки отсутствуют [195]. Для корректной идентификации продуцента все его культурально-морфологические признаки в производственной культуре должны учитываться в комплексе.
Чистые культуры P. ostreatus PO-4.1 и P. djamor PD-3.2 выращивали на агаризованной среде в чашках Петри (рисунок 3.2). В ходе радиального роста оба штамма сформировали колонии, характеризующиеся следующими признаками: форма округлая с выраженной концентрической зональностью, цвет матово-белый у P. ostreatus PO-4.1 и розовато-бежевый у P. djamor PD-3.2, край ворcинчатый, профиль плоский, структура волокнистая, мицелий пушистый, с трудом отделяемый от субстрата. а – чистая культура P. ostreatus PO-4.1 б – чистая культура P. djamor PD-3.2
Отличительной чертой поверхностной культуры P. djamor PD-3.2 является характерная розоватая окраска мицелия, что служит дополнительным идентификационным признаком этой культуры. Также наблюдается интенсивное розовое окрашивание среды через 14 суток культивирования.
Следует отметить, что штамм P. djamor PD-3.2 способен к активному образованию примордиев ярко-розового цвета даже в условиях поверхностного культивирования на агаризованной среде с возраста 12-14 суток.
Микроморфологические особенности воздушного мицелия исследуемых штаммов рода Pleurotus приведены на рисунке 3.3.
На рисунке 3.3 (а) мицелий P. ostreatus представлен сильно разветвленными септированными гифами диаметром 2,0-3,0 мкм с многочисленными пряжками. На гифах образуются шаровидные головчатые структуры, причем их количество возрастает с увеличением срока культивирования (21 сутки культивирования и более).
Химический состав глубинных культур Pleurotus ostreatus PO-4.1 и6 Pleurotus djamor PD-3.2 7
Для определения принципиальной пригодности выбранных штаммов P. ostreatus и P. djamor для переработки выбранных видов сырья провели поверхностное (твердофазное) культивирование на механически измельченной вегетативной части топинамбура (размер частиц 5-10 мм) и сосновых опилках (фракция до 3-5 мм), используя в качестве посевного материала глубинные культуры. Культивирование проводили в течение семи суток. Установлено, что скорость роста штамма P. djamor на неактивированной вегетативной части топинамбура на 15 % превосходит таковую у штамма P. ostreatus. Вероятно, это связано с тем, что P. djamor является эндемичным видом субтропиков и тропиков [113, 131], и древесина сосны для него – несвойственный субстрат.
Колонизация субстрата из неактивированных сосновых опилок мицелием P. ostreatus происходит почти на 40 % быстрее, чем мицелием P. djamor. При этом вегетативная часть топинамбура колонизируется мицелием P. ostreaus вдвое быстрее, чем сосновые опилки, а скорость роста P. djamor на субстрате из топинамбура втрое превышает скорость его роста на сосновых опилках.
В целом, штаммы P. ostreatus и P. djamor способны к росту и, как следствие, утилизации выбранных видов субстратов. Очевидно, вегетативная часть топинамбура по своему химическому составу (см. таблицу 3.1) является более легкодоступным субстратом для мицелия Pleurotus. Необходимо отметить более высокую способность P. ostreatus к утилизации сосновых опилок, при том, что для обоих штаммов этот субстрат является более сложным для конверсии.
Для получения посевного материала для дальнейшей микробиологической переработки растительного сырья (сосновые опилки, вегетативная часть топинамбура) было проведено глубинно-твердофазное культивирование обоих штаммов Pleurotus на жидкой среде с добавлением в среду для культивирования 3 % гидродинамически активированных сосновых опилок или вегетативной части топинамбура и набора солей по прописи крахмалоаммонийной среды, время культивирования – трое суток. Культивирование проводили в выше подобранных условиях (см. таблицу 3.10).
Использование гидродинамически активированного растительного сырья на стадии получения посевного материала позволяет адаптировать штаммы-продуценты к особенностям сырья, активировать их мультиферментные комплексы и, таким образом, в дальнейшем провести процесс твердофазного культивирования на этих видах сырья в более короткий срок, наиболее полно утилизировать лигноуглеводный комплекс субстрата и получить наибольший выход продукта. Для сокращения времени лаг-фазы при адаптации к новому виду субстрата в среде для культивирования сохраняли 1 % содержание крахмала.
Необходимо отметить, что предварительные эксперименты по внесению большего, чем 3 % количества растительных субстратов в среду для культивирования показали невозможность равномерного механического перемешивания культуральной жидкости, недостаточную аэрацию и, как следствие, неравномерный рост мицелия в культуре с тенденцией к образованию агломератов на поверхности среды и налипанию на стенки и внутренние элементы рабочей емкости биореактора.
Важным параметром оценки эффективности процесса микробиологической переработки является определение степени биоконверсии растительного субстрата. Полнота утилизации субстрата свидетельствует об активном метаболизме продуцента, а также о степени пригодности биологического объекта для эффективной микробиологической переработки выбранного субстрата.
Для оценки эффективности процесса микробиологической переработки гидродинамически активированного сырья определяли основные показатели процесса биоконверсии. Степень биоконверсии растительного субстрата рассчитана с учетом убыли массы субстрата и содержания белка в засевной глубинной культуре, результаты приведены в таблице 3.18.
Из данных таблицы видно, что степень биоконверсии предварительно активированных сосновых опилок увеличивается примерно на 30 % при культивировании P. ostreatus и на 20 % – P. djamor. Степень биоконверсии предварительно активированной вегетативной части топинамбура увеличивается примерно на 10 % при культивировании P. ostreatus и на 18 % – P. djamor. В случае топинамбура меньшее влияние гидродинамической обработки сырья объясняется его изначально более благоприятным химическим составом (см. таблицу 3.1) для культивирования видов Pleurotus. Вместе с тем гидродинамическая обработка сырья при получении засевной культуры на среде с вегетативной частью топинамбура позволяет получать инокулят с более высоким содержанием белка.