Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Комплексные соединения металлов с флавоноидами (литературный обзор) 12
1.1 Флавоноиды: структуры, содержание в древесине лиственниц 13
1.2 Флавоноиды в качестве органических лигандов в реакциях комплексообразования с ионами металлов 16
1.3 Некоторые металлы в координационной химии и их биологическая роль 17
1.4 Способы получения и возможные структуры комплексных соединений флавоноидов с ионами металлов 20
1.5 Методы исследования структур комплексных соединений металлов с флавоноидами
1.5.1 Методы определения стехиометрии комплексов 28
1.5.2 УФ-спектроскопия в анализе флавоноидов и комплексных соединений 29
1.5.3 Использование ИК-спектроскопии в исследовании комплексных соединений металлов с флавоноидами 31
1.5.4 Исследование структур комплексных соединений металлов с флавоноидами с помощью спектроскопии ЯМР 37
1.5.5 Использование метода масс-спектрометрии в исследовании металлокомплексов флавоноидов 44
1.5.6 Методы определения количества связанной воды в составе флавоноидов и комплексов на их основе 46
1.6 Биологическая активность флавоноидов и их комплексов с металлами 47
1.6.1 Биологическая активность флавоноидов 47
1.6.2 Биологическая активность комплексных соединений металлов с флавоноидами 52
1.7 Использование метода циклической вольтамперометрии в исследовании окислительно-восстановительных свойств флавоноидов и их производных 55
Заключение з
Глава 2 Синтез биологически активных комплексных соединений на основе дигидрокверцетина - продукта глубокой переработки древесины лиственницы (обсуждение результатов) 58
2.1 Способы выделения дигидрокверцетина из древесины лиственницы 59
2.2 Физико-химическая характеристика и стереоизомерия дигидрокверцетина... 61
2.3 Оптимизация реакций комплексообразования дигидрокверцетина с ионами цинка, меди (II) и кальция
2.3.1 Синтез и оптимизация реакции комплексообразования цинка с дигидрокверцетином 64
2.3.2 Изучение реакции образования комплексного соединения меди (II) с дигидрокверцетином 71
2.3.3 Синтез и оптимизация реакции получения комплексного соединения кальция с дигидрокверцетином 78
2.4 Установление структур комплексных соединений цинка, меди (II) и кальция с дигидрокверцетином 85
2.4.1 Характеристика комплексных соединений методом электронной микроскопии 85
2.4.2 Определение растворимости комплексных соединений 85
2.4.3 Определение количества связанной воды в составе комплексов 86
2.4.4 DART масс-спектральная фрагментация комплексных соединений цинка, меди (II) и кальция с дигидрокверцетином 88
2.4.5 Определение элементного состава комплексных соединений цинка, меди (II) и кальция с дигидрокверцетином 91
2.4.6 ИК-спектроскопия комплексных соединений цинка, меди (II) и кальция с дигидрокверцетином 92
2.4.7 Спектроскопия ЯМР комплексных соединений цинка и кальция с дигидрокверцетином 93
2.4.8 Спектроскопия ЭПР комплексного соединения меди (II) с дигидрокверцетином 96 2.5 Изучение электрохимической активности комплексных соединений цинка, меди (II) и кальция с дигидрокверцетином 100
2.6 Определение антиоксидантной активности комплексных соединений цинка, меди (II) и кальция с дигидрокверцетином
2.6.1 Выбор действующей концентрации комплексов 105
2.6.2 Определение влияния комплексных соединений цинка, меди (II) и кальция с дигидрокверцетином на процессы перекисного окисления липидов в опытах in vitro 105
2.7 Перспективы использования комплексного соединения цинка с дигидрокверцетином в качестве фармацевтической субстанции для лечения ожоговых ран 107
Глава 3 Экспериментальная часть 110
3.1 Спектрофотометрическое определение содержания дигидрокверцетина в анализируемом растворе 112
3.2 Условия синтезов комплексных соединений цинка, меди (II) и кальция с дигидрокверцетином
3.2.1 Синтез и оптимизация комплексного соединения цинка с дигидрокверцетином 114
3.2.2 Синтез и оптитмизация комплексного соединения меди (II) с дигидрокверцетином 117
3.2.3 Синтез и оптимизация комплексного соединения кальция с дигидрокверцетином 119
3. 3 Определение ионов металлов в анализируемых растворах 122
3.3.1 Определение содержания ионов цинка 122
3.3.2 Определение содержания ионов меди (II) 123
3.3.3 Определение содержания ионов кальция 1 3.4 Расчет количества связанной воды в составе комплексов 124
3.5 Определение антиоксидантной активности комплексных соедиений цинка, меди (II) и кальция с дигидрокверцетином in vitro 125
3.5.1 Приготовление растворов для выбора действующей концентрации 125
3.5.2 Определение малонового диальдегида в плазме крови 125
3.5.3 Определение диеновых и триеновых конъюгатов в плазме крови 125
3.5.4 Определение активности каталазы 126
выводы 128
Список литературы 129
- Методы исследования структур комплексных соединений металлов с флавоноидами
- Оптимизация реакций комплексообразования дигидрокверцетина с ионами цинка, меди (II) и кальция
- Определение влияния комплексных соединений цинка, меди (II) и кальция с дигидрокверцетином на процессы перекисного окисления липидов в опытах in vitro
- Синтез и оптимизация комплексного соединения кальция с дигидрокверцетином
Введение к работе
Актуальность темы. Актуальность данной работы обусловлена выполнением тематического Плана научно-исследовательской работы (государственного задания) Федерального государственного бюджетного учреждения науки Иркутского института химии им Е.А. Фаворского СО РАН V.48.1. «Разработка теоретических основ комплексной переработки биомассы хвойных пород Сибири для создания технологий получения инновационных медицинских и ветеринарных препаратов» (Per. № 01201281998) и работ по проекту Программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Фундаментальные науки - медицине» на 2013-2014 гг. (№ ФНМ-2012-02) «Разработка инновационного препарата для комбустиологии на основе продуктов комплексной переработки биомассы лиственницы сибирской».
Одним из важнейших направлений исследований химии древесины является изучение химических компонентов древесной биомассы с целью выявления ее практического потенциала. В последние годы пристальное внимание уделяется разработкам химических превращений уже существующих, коммерчески доступных первичных продуктов переработки биомассы растительного сырья, на основе которых можно расширять ассортимент продуктов с полезными свойствами и добавленной стоимостью, что в целом будет способствовать повышению уровня переработки всей растительной биомассы. Основным компонентом флавоноидной фракции (80-85%) древесины лиственницы сибирской (Larix sibirica Ledeb.) и лиственницы Гмелина (L. gmelinii (Rupr.) Rupr.) является отрсшс-(+)2Л37?-дигидрокверцетин (ДКВ), который привлекает к себе неизменный исследовательский и практический интерес, обусловленный как ярко выраженным биологическим потенциалом, так и коммерческой доступностью.
Одним из подходов к расширению арсенала лекарственных средств является направленная модификация структуры базового соединения, для которого уже известна фармакологическая активность. В последнее время флавоноиды часто используются в качестве органических лигандов для получения комплексов металлов с ценными функциональными свойствами, в том числе и усиленной биологической активностью. Комплексы Zn, Cu(II), Fe(II), Fe(III), Al, Ca, Mg, Sn(II) и других металлов с полифенольными лигандами демонстрируют высокую антиоксидантную активность, превосходящую активность исходных флавоноидов. Однако примеры использования (+)-дигидрокверцетина как лиганда для получения новых координационных соединений весьма немногочисленны. Получение ценных биологически активных комплексных соединений с биогенными металлами на основе ДКВ с целью создания новых высокоэффективных медицинских препаратов позволит расширить ассортимент импортозамещающих лекарственных средств и повысить рентабельность химической переработки биомассы лиственницы.
Цель и задачи исследования. Целью данной работы является синтез и оптимизация реакций образования биологически активных комплексных соединений цинка, меди (II) и кальция с (+)-дигидрокверцетином.
Для достижения цели были поставлены и решены следующие задачи:
- направленный синтез комплексных соединений (КС) цинка, меди (II) и кальция с (+)-дигидрокверцетином с сохранением конфигурации 2R3R аномерных центров и функциональных группировок, отвечающих за проявление антиоксидантной активности исходного соединения-лидера (катехольный фрагмент молекулы флавоноида);
-оптимизация реакций комплексообразования по выходу продукта;
-установление структур полученных соединении;
-оценка электрохимического поведения и антиоксидантной активности КС;
-оценка возможности использования КС цинка с ДКВ в медицине.
Объект исследования - реакции комплексообразования ионов металлов с mpauc-(+)-2R3R дигидрокверцетином.
Предмет исследования - комплексные соединения цинка, меди (II) и кальция с транс-(+)-2R3R дигидрокверцетином.
Научная новизна. Впервые изучены реакции комплексообразования цинка, меди (II) и кальция с mpaHC-(+)-2R3R дигидрокверцетином - флавоноидом древесины лиственницы в водной и водно-спиртовой среде; оптимизированы условия реакций, что позволило с высокими выходами (70-89 %) выделить индивидуальные продукты в виде порошков и установить их строение с применением современных физико-химических методов исследования: ЯМР *Н и 13С, ИК, масс-спектрометрии DART, элементного анализа, рентгеновского спектрального энергодисперсионного микроанализа (РСЭДМА) и термогравиметрии (ТГ). Разработаны лабораторные регламенты получения комплексов цинка, меди (II) и кальция с ДКВ.
Методом циклической вольтамперометрии изучено электрохимическое поведение КС и подтверждены факторы, определяющие их антиоксидантные свойства. Определена антиоксидантная активность КС в экспериментах in vitro на сливной плазме крови здоровых доноров. В опытах in vivo установлены ранозаживляющая и антимикробная активности фармацевтической композиции, разработанной на основе цинкового комплекса ДКВ.
Практическая значимость работы. Результаты оптимизации реакции получения КС дают возможность выдать исходные данные для проектирования и создания экспериментальных установок по наработке опытных партий КС для разработки фармакологических субстанций и нормативной документации. Создание высокоэффективных медицинских препаратов на основе производных ДКВ может существенно увеличить рентабельность химической переработки древесины лиственницы, что в свою очередь будет способствовать развитию отечественного лесопромышленного комплекса. Это позволит более полно использовать экстрактивные вещества древесины лиственницы для расширения круга импортозамещающих лекарственных средств, биологически активных добавок и улучшенной косметики. Разработанные лабораторные регламенты получения КС позволят наработать экспериментальные партии для дальнейших биологических исследований.
Достоверность и обоснованность результатов и выводов базируются на применении современных методов анализа, выполнении исследований с использованием аккредитованных лабораторий, поверенных приборов, применении методов математической статистики при обработке данных.
Личный вклад автора. Автором выполнены экспериментальные исследования и разработаны лабораторные регламенты. Автор принимал непосредственное участие в планировании эксперимента, расшифровке спектров и обсуждении структурных и спектральных данных, интерпретации полученных результатов, поиске литературы, формулировке выводов и написании статей.
Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы докладывались на VI Международной конференции «Traditional medicine: ways of
integration with modern health care» (Улан-Удэ, 2013), XXVII Международной научно-технической конференции «Реактив-2013» (Иркутск, 2013), Всероссийской научно-методической конференции с международным участием «Инновационные технологии в фармации» (Иркутск, 2014).
Публикации. Основное содержание работы изложено в 14 публикацях, из которых 4 статьи в журналах, рекомендованных ВАК, и 1 патент.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения,3 глав, выводов, списка цитируемой литературы из 168 наименований и 5 приложений. Работа изложена на 183 страницах, содержит 14 таблиц, 24 рисунка и 4 схемы.
Методы исследования структур комплексных соединений металлов с флавоноидами
Флавоноиды проявляют хелатирующие свойства, поскольку способны связывать ионы металлов, и поэтому они могут влиять на сорбцию металлов в процессе питания человека и животных и воздействовать на баланс металлов в организме и клеточный окислительный статус.
Способность флавоноидов образовывать комплексы может быть использована для подавления токсичности при отравлении организма тяжелыми металлами. Формирование кверцетином алюминиевых комплексов может уменьшать неврологические расстройства, а молибденовых - снижать токсичность при облучении [15].
Кроме медицинского аспекта, изучение реакций комплексообразования ионов металлов с флавоноидами связано с возможностью получения соединений с заданными физико-химическими свойствами, которые предполагают их практическое использование в различных областях. Например, изучаются магнитные свойства флавоноидных комплексов лантаноидов [21]; образование комплексов из полигидроксифлавонов и полиметоксифлавонов с металлами II группы приводит к получению флуоресцирующих соединений [22], что предполагает возможность создания фотохромофоров на основе природных полифенолов; взаимодействие флавоноидов с наночастицами различных металлов предполагает ряд преимуществ, важных для практического использования наноразмерных материалов [11, 23]. При большом разнообразии флавоноидов их использование в комплексообразовании с ионами металлов ограничивается, в основном, небольшим рядом соединений, которые, как правило, имеют коммерческую доступность.
Например, на основе кверцетина были проведены исследования его комплексообразования с широким спектром металлов: Al +, Zn +, Си +, Sn +, Fe +, Fe3+, Ве2+, Mg2+, Са2+, Cd2+, Ga2+, Pd2+, BF2+ и рядом лантаноидов [15, 21, 22, 24-31, 32-44]. Для морина установлены структуры комплексов морина с ионами Sn , Cu2+, Fe2+, Mg2+, Ca2+, Zr4+, Mo042" [15, 21, 27, 41, 45-49], представлены результаты исследований строения и свойств металлокомплексов рутина с ионами Al , Zn , Cu2+, Со2+, Ni2+, Mn2+, Fe2+, Fe3+, Sn2+, U022+ [15, 24, 26, 30, 50-56]. В меньшей степени в научной литературе отображено участие в качестве лигандов металлокомплексов таких флавоноидов, как примулетин (5-гидроксифлавон), дигидроксифлавоны, галангин, гесперидин, нарингин, нарингенин, кемпферол, катехин, эпикатехин, лютеолин, физетин, дигидрокверцетин, байкалеин, хризин, силибинин.
В состав живых организмов входит более 70 элементов таблицы Менделеева. По содержанию в организме они делятся на макроэлементы (С, Н, О, N, Р, S, Са, К, Na, CI, Mg - на их долю приходится 99,5 % веса тела) и микроэлементы (МЭ), массовая доля которых в организме менее 0,01 %. МЭ подразделяются на эссенциальные (жизненно необходимые), присутствующие в составе различных белковых структур, необходимые для нормального роста и развития организма, и токсические, в высоких дозах вызывающие поражение клеток, а в малых дозах оказывающие стимулирующее действие на различные биологические процессы. Эссенциальный МЭ, за очень редким исключением, нельзя заменить другим без нарушения биологической функции [77].
Кальций - основной структурный компонент костной ткани. Кроме того, ионы кальция играют важнейшую роль в регулировании различных биологических процессов, таких как мышечное сокращение, свертывание крови, активность ферментов, возбудимость клеточных мембран. Они способствуют секреции гормонов, увеличивают проницаемость мембраны клеток для ионов калия, служат посредниками во внутриклеточной передаче сигналов [78-81].
Железо является одним из наиболее распространенных микроэлементов на Земле. Оно входит в состав более 70 ферментов, выполняющих различные функции, основные из которых - транспорт электронов (цитохромы, железосеропротеиды), транспорт и депонирование кислорода (важнейшим кислородпереносящим белком является гемоглобин), участие в формировании активных центров окислительно-восстановительных ферментов (оксидазы, супероксиддисмутаза и др.), транспорт и депонирование железа (трансферрин, ферритин) [77, 78, 81-83]. Недостаток железа в организме вызывает анемию.
Медь представляет собой один из важнейших МЭ, необходимых для жизнедеятельности человека, животных и растений. Ионы меди входят в состав ферментов и белков, играющих важную роль в окислительно-восстановительных процессах, участвующих в реакциях окисления органических субстратов молекулярным кислородом. Являясь переходным металлом, медь может находиться в двух валентных состояниях и в зависимости от природы и расположения лигандов позволяет медьсодержащим белкам охватывать широкий диапазон окислительно-восстановительных потенциалов и обратимо связывать кислород и диоксид углерода [82]. Медь обладает выраженным противовоспалительным свойством и смягчает проявление аутоиммунных заболеваний. Недостаток меди в организме приводит к снижению активности медьзависимого фермента лизилоксидазы, может ингибировать активность супероксиддисмутазы - фермента, ответственного за ингибирование процессов перекисного окисления липидов мембран клеток, может быть одной из причин возникновения расстройств центральной нервной системы и вызывать анемию [77,81,82].
Оптимизация реакций комплексообразования дигидрокверцетина с ионами цинка, меди (II) и кальция
Извлечение экстрактивных веществ из древесины лиственницы производят с использованием органических растворителей или смесей органических растворителей с водой, из которых чаще всего используются системы метанол (этанол) - вода или ацетон - вода.
Использование водно-ацетоновой смеси для выделения ДКВ защищено патентами [123-125]. Предложено получение диквертина, содержащего 90-92 % ДКВ, экстракцией опилок древесины лиственницы водно-ацетоновым экстрагентом в кислой среде непосредственно после обработки сырья кипящей водой с последующей кристаллизацией целевого продукта из спирта или водно-спиртового раствора [123]. Для упрощения, сокращения времени процесса выделения ДКВ и повышения выхода целевого продукта с сохранением высокой степени его чистоты опилки древесины лиственницы, предварительно увлажненные горячей водой до влажности 60-70 %, экстрагировали ацетоном при нагревании с последующим упариванием экстракта и кристаллизацией из водно-солевого или водно-спиртового раствора [124]. Существует способ выделения нативных биофлавоноидов - дигидрокверцетина и дигидрокемпферола, включающий абсорбцию полученного из спиртоэфирной фазы сухого экстракта флавоноидов водноацетоновым растворителем. После вакуумной разгонки раствора биофлавоноиды перекристаллизовывают из воды [125]. Данный способ переработки древесины лиственницы предполагает двухстадийную экстракцию из деструктурированной древесины в условиях нахождения компонентов в псевдоожиженном состоянии. В качестве растворителей используют эмульсии: на первой стадии - неполярного углеводорода алифатического ряда в воде, а на второй - низкокипящего эфира и водного этилового спирта в воде. Ранее был предложен способ выделения ДКВ экстракцией древесины лиственницы водой с последующим отделением экстракта от полисахаридной части на колонке с полиамдным сорбентом, элюированием с полиамида водно-ацетоновой смесью в соотношении 3:7 и упариванием водно-ацетонового экстракта [11].
На основе использования в качестве экстрагента этилацетата разработаны три способа выделения ДКВ, в одном из которых охлажденный экстракт, полученный экстракцией опилок древесины лиственницы водой при нагревании, смешивают с полиамидным порошком, целевой продукт экстрагируют этилацетатом и кристаллизуют из горячей воды [126]. Два другие способа получения ДКВ не предполагают использование полиамидного сорбента. В одном из них экстракцию измельченной древесины лиственницы этилацетатом проводят при температуре кипения этилацетата, затем экстракт фильтруют и упаривают до получения сухого остатка, который затем смешивают с бензином или гексаном с последующей отгонкой растворителя [127]. Другой способ разработан для упрощения процесса выделения ДКВ и снижения расхода органических растворителей и энергетических затрат, в котором древесина перед экстрагированием этилацетатом предварительно пропитывается водой. После обработки упаренного экстракта гексаном (или бензином) ДКВ перекристаллизовывается из горячей воды [128].
Разработаны и другие способы получения ДКВ. Например, лиственничные опилки, полученные при измельчении отходов лесозаготовки и лесопереработки лиственницы, подвергают твердофазной механохимической обработке в присутствии сухого NaOH, после чего смесь заливают водой, фильтруют и осаждают ДКВ из водного экстракта подкислением НС1 до рН 1,5-2,0 [129]. Предполагается, что данный способ позволяет повысить чистоту и выход целевого продукта, но использование таких жестких условий для выделения флавоноида вряд ли сохранит его нативную структуру.
Создание в лаборатории химии древесины ИрИХ СО РАН комплексной безотходной технологии переработки биомассы лиственницы устраняет недостатки предложенных способов выделения ДКВ. Благодаря полному использованию всех компонентов древесины и коры по экологически безопасным технологиям повышается степень извлечения экстрактивных веществ до 85-95 % от их содержания в древесине, уменьшаются потери растворителя (до 1 %) благодаря разработанной системе регенерации экстрагентов. При этом все выделяемые вещества благодаря сохранению нативных свойств обладают высокой биологической активностью. Одновременно с получением широкого спектра биологически активных продуктов решаются экологические проблемы утилизации отходов лесозаготовительных и деревоперерабатывающих производств [11].
Исследования физико-химических свойств дигидрокверцетиина, выделенного из древесины лиственницы, позволили разработать и создать нормативную документацию на его стандартный образец [12, 130]. ДКВ представляет собой белый мелкокристаллический порошок, хорошо растворимый в ацетоне, метаноле, этаноле, этилацетате, очень мало растворимый в воде при 25 С, с температурой плавления 220-222 С, значение удельного оптического вращения плоскости поляризации [а]о составляет +35 [130]. УФ-спектр ДКВ характеризуется присутствием полосы поглощения с максимумом при 290±2,0 нм с плечом в области 320-327 нм. ИК-спектр ДКВ содержит полосы поглощения, соответствующие структурным фрагментам молекулы (валентные колебания: v(0-Н) 3300 - 3500 см"1; v(C=0) 1637 - 1647 см"1; деформационные колебания: S(C-H) ароматического ядра 650-850 см"1) [12]. ИК-спектр твердого образца ДКВ в вазелиновом масле характеризуется более высоким разрешением, чем соответствующий спектр, полученный в таблетках с КВг. В нем хорошо разрешаются полосы поглощения v(O-H) свободных (3550 см"), а также связанных внутримолекулярной и межмолекулярной водородной связью (3406 см" и широкая полоса с максимумом при 3250 см" , соответственно). Валентные колебания v(C-H) в ароматическом кольце при 3080 см" и валентные колебания ароматического кольца при 1615 и 1588 см" также хорошо проявляются. На участие карбонильной группы в водородной связи указывает положение интенсивной полосы v(C=0) (1644 см"1) [130]. Спектры 1Я и 13С ЯМР ДКВ в ДМСО-Об в области 0,5-12 м.д. для протонного спектра и в области 70-200 м.д. для углеродного спектра содержат сигналы, представленные в [130].
Поскольку ДКВ является представителем флаванонолов, его молекула содержит два асимметрических атома углерода (С-2 и С-3) в дигидро-у-пироновом фрагменте (цикл С), и возможно существование ДКВ в виде четырех энантиомеров (двух пар диастереоизомеров) (рис. 2.1).
Определение влияния комплексных соединений цинка, меди (II) и кальция с дигидрокверцетином на процессы перекисного окисления липидов в опытах in vitro
УФ-спектры регистрировали на спектрофотометре СФ-26, в кюветах /=1,0 см. рН-Метрию проводили на приборе Эксперт-рН. Рентгеновский спектральный энергодисперсионный микроскопический анализ (РСЭДМА) выполнен с помощью электронного микроскопа фирмы Hitachi марки ТМ 3000, датчик: X-ray детектор SDD XFlash 430-Н. ИК-спектры записывали на приборе Bruker Vertex 70 в таблетке с КВг (2.5 мг/300 мг КВг).
Термогравиметрический анализ осуществляли на приборе синхронного термического анализа STA 449 F3 Jupiter фирмы Netzsch в динамическом режиме (скорость нагрева образца 5 град/мин) в токе азота (скорость подачи газа 30 мл/мин).
Спектры ЯМР растворов соединений в ДМСО-Й?6 регистрировали при температуре 26 С. Спектры ЯМР С образцов регистрировали на приборе Bruker DPX 400 с рабочей частотой 100,6 МГц. Использовали многократное накопление на полосе 28000 Гц при времени выборки данных 1,2 с и с релаксационной задержкой 7 с. Спектры Н и двумерные спектры ЯМР COSY, HSQC, НМВС регистрировали на приборе Bruker Avance с рабочей частотой 400,1 Гц. Для регистрации спектров Н использовали 16-кратное накопление сигналов на полосе 8012 Гц при времени выборки данных 2,04 сие релаксационной задержкой 2 с. Двумерные спектры регистрировали с использованием импульсных градиентов поля с временем выборки данных 0,14 с и от 256 до 1024 прохождений по координате ti с релаксационной задержкой 1,5 с; по координате І2 время выборки данных составляло 0,14 с (COSY), 0,03 с (HSQC) и 0,07 с (НМВС) и от 512 до 2048 прохождений. В эксперименте HSQC для наблюдения максимальных амплитуд кросс-пиков использовалась константа JCH = 140 Гц, а для эксперимента НМВС использовалось значение константы VCH = 4 Гц.
Масс-спектрометрию MALDI проводили на масс-спектрометре Bruker autoflex speed, оснащенном твердотельным УФ-лазером с Х=355 нм и рефлектроном с использованием четырех матриц: 3-индолакр иловая кислота (IAA), 2,5-дигидроксибензойная кислота (DHB), 1,8,9-антрацентриол (AT), 2-(4 Ill гидроксифенилазо)бензойная кислота (НАВА). Навеску образца растворяли в ДМСО, отбирали 20 мкл раствора и добавляли 20 мкл раствора матрицы в ТГФ (30 мг/мл). 1 мкл смеси наносили на металлическую подложку, выжидали до момента улетучивания растворителя и регистрировали масс-спектры. Масс-спектрометрию DART проводили на времяпролетном масс-спектрометре JMS100LP AccuTOF в диапазоне 100-1000 Да в температурном диапазоне (от 150 до 300 С) при скоростях газа от 0,5 до 3 л/мин. Наилучшего соотношения сигнал/шум удалось добиться в режиме регистрации отрицательных ионов при скорости потока 1 л/мин и температуре источника 300 С, в режиме регистрации положительных ионов зарегистрировать масс-спектры комплексов не удалось.
ЭПР спектры были сняты на импульсном спектрометре ELEXSYS Е580 Bruker (Х-диапазон 9,7 GHz) в постоянном режиме при комнатной температуре. Амплитуда модуляции 1 и 10 G, усиление 60 dB, постоянная времени 0,02 с, время конверсии 0,06 с, микроволновая мощность 0,6325 mW. Точность измерения g-фактора составляет ±0,001 в диапазоне развертки поля 6000 G и ±0,0002 в диапазоне 100 G. В качестве стандарта для расчета спиновой концентрации использовался СиСЬ.
Исследование электрохимического поведения комплексов проводилось методом циклической вольтамперометрии. Для электрохимических измерений использовали установку на базе потенциостата IPC - pro М (Россия), включающую: трехэлектродную ячейку объемом 50 мл, графитовый рабочий электрод с площадью видимой поверхности 0,39 см , хлор серебряный электрод сравнения В AS RE-1, где внутренний раствор был заменен на насыщенный раствор AgCl и КС1 согласно [152], платиновый вспомогательный электрод. Посуда, необходимая для приготовления растворов исследуемых веществ и электрохимических измерений, обрабатывалась смесью концентрированной серной кислоты и 30%-ого пероксида водорода, затем проточной горячей водой и ополаскивалась бидистиллированной водой, после чего помещалась в сушильный шкаф для удаления воды. Концентрации анализируемых растворов составляли 5-10" М. Перед измерением вольтамперограмм раствор в ячейке продували аргоном в течение 10 мин. Все эксперименты выполнены при комнатной температуре. В качестве фонового электролита использовался 10" М раствор ІЛСЮд в ДМСО. Порядок выполнения эксперимента был следующим: измерялись циклические вольтамперограммы в фоновом растворе при скорости развертки потенциала (v) 5, 20, 50 мВ/с, затем измерялись циклические вольтамперограммы в растворе комплекса или ацетата металла - комплексообразователя при v 2, 5, 10, 20,50, 100, 200и500мВ/с.
Содержание ДКВ в растворах определяли спектрофотометрически с помощью градуировочного графика.
Спектрофотометрическое определение содержания дигидрокверцетина в анализируемом растворе
Приготовление стандартного раствора №1. 0,10 г ДКВ стандартного образца (точная навеска) растворяли в 70 мл 96%-ного этилового спирта в мерной колбе вместимостью 100 мл, доводили объем раствора этиловым спиртом 96% до метки и перемешивали. Концентрация полученного раствора ДКВ составляла 10 г/мл.
Приготовление стандартных растворов №2. Из раствора №1 разведением готовили серию растворов с содержанием ДКВ 7,5-10" ; 5,0-10" ; 2,5-10" и 1,0-10" г/мл.
Приготовление стандартных растворов №3. Из растворов №2 готовили растворы для построения калибровочного графика следующим образом: 1 мл раствора переносили в мерную колбу вместимостью 50 мл, доводили объем раствора до метки 96 %-ным этиловым спиртом и перемешивали. Концентрации полученных растворов составляли 1,5-10" ; 1,0-10" ; 5-10" и 2-10" г/мл.
Оптическую плотность А растворов №3 измеряли на спектрофотометре в максимуме поглощения при 290+2 нм в кювете с толщиной слоя 1 см. В качестве раствора сравнения использовали 96 %-ный этиловый спирт.
По полученным значениям оптической плотности строили график зависимости: A=f(C). Уравнение зависимости имеет вид: у = 0,0609 х - 0,0069; R = 0,9992.
Спектрофотометрическое определение содержания дигидрокверцетина в анализируемом растворе. В мерную колбу на 50 мл отбирали аликвоту 0,025 мл анализируемого раствора и доводили до метки 96 %-ным этиловым спиртом. Содержание ДКВ в исследуемом растворе рассчитывали по формуле, выведенной из градуировочного графика: т(ДКВ)=(А+0,0069)-Уобщ-0,82/Уал, где А -оптическая плотность, %, Уобщ - объем анализируемого раствора, мл, Уал -объем аликвоты, мкл.
Синтез и оптимизация комплексного соединения кальция с дигидрокверцетином
Пристальное внимание исследователей к изучению строения и свойств комплексных соединений металлов с различными флавоноидами во многих случаях сопряжено с определением антиоксидантной активности этих соединений. Для оценки антиокислительных свойств природных и синтетических соединений используют различные физико-химические методы, биохимические тест-системы и экспериментальные модели [3].
Изучение антиоксидантной активности комплексных соединений цинка, меди (II) и кальция с дигидрокверцетином проводилось в экспериментах in vitro на сливной плазме крови здоровых доноров. Определяли влияние КС и ДКВ на процессы перекисного окисления липидов (ПОЛ) в плазме крови. Для этого определяли в плазме крови содержание малонового диальдегида (МДА), возникающего в организме при деградации гидроперекисей липидов активными формами кислорода и служащего маркером ПОЛ и оксидативного стресса, диеновых и триеновых конъюгатов (ДК, ТК), которые представляют собой гидроперекиси липидов с сопряженными двойными связями, а также активность фермента каталазы.
Определение действующей концентрации проводили на основании изменения содержания МДА в плазме крови в присутствии КС и ДКВ по отношению к контрольному опыту [156].
Для экспериментов готовились 1%-ные суспензии исследуемых веществ в ДМСО, из которых были приготовлены растворы в диапазоне концентраций 0,001-0,1 % [142, 157, 158]. В качестве контрольного образца использовали раствор, содержащий плазму крови в ДМСО.
Максимальное снижение содержания МДА в плазме крови по сравнению с контролем наблюдалось при использовании 0,005%-ного раствора КС цинка с ДКВ. КС меди (II) с ДКВ снижает содержание МДА только в концентрации 0,005%. Наибольшая активность КС кальция с ДКВ показана в концентрации 0,001%. Для сравнительной характеристики антиоксидантной активности полученных комплексов дальнейшие исследования проводились для растворов КС в одинаковой концентрации 0,005 %.
Определение влияния комплексных соединений цинка, меди (II) и кальция с дигидрокверцетином на процессы перекисного окисления липидов в опытах in vitro Состояние ПОЛ оценивали по содержанию в плазме крови МДА и первичных продуктов ПОЛ - диеновых (ДК) и триеновых (ТК) конъюгатов. Определение ДК имеет преимущество для оценки ПОЛ по сравнению с другими продуктами, поскольку отражает раннюю стадию окисления.
Анализ полученных данных демонстрирует, что цинковый комплекс снижает содержание МДА в плазме крови на 14,9 % по сравнению с контролем, что превосходит в 2 раза этот показатель для ДКВ (7,5 %). КС меди (II) и кальция с ДКВ снижают содержание МДА в плазме крови на 11,2 и 3,7 %, соответственно.
Существенного влияния ДКВ и исследуемых комплексов на уровень первичных продуктов ПОЛ (ДК и ТК) в плазме крови не выявлено.
Для оценки антиоксидантного статуса организма исследуют также активность антирадикальных и антиперекисных ферментов в плазме крови. Одним из таких ферментов, широко распространенных в организме человека и животных и сохраняющих свою высокую активность длительное время, является каталаза. Ее роль в организме заключается в предотвращении накопления пероксида водорода, который образуется при дисмутации супероксидного аниона и при аэробном окислении восстановленных флавопротеидов. Для клинических и экспериментальных исследований широко используется спектрофотометрический метод определения активности каталазы, являющийся достаточно точным, чувствительным и простым в исполнении [160].
Проведенные эксперименты не выявили существенного влияния исследуемых соединений на активность каталазы.
Таким образом, проведенные исследования позволяют сделать вывод, что синтезированные нами комплексные соединения цинка, меди (II) и кальция с ДКВ проявляют антиоксидантную активность, влияя на уровень ПОЛ в плазме крови. Наиболыпую активность показал цинковый комплекс, что позволяет прогнозировать перспективность его использования в медицине.
Результаты, полученные в экспериментах in vitro по исследованию антиоксидантной активности синтезированных комплексов, не противоречат выводам, полученным при исследовании окислительно-восстановительного поведения комплексов дигидрокверцетина методом циклической вольтамперометрии, где максимальную электрохимическую активность проявил цинковый комплекс дигидрокверцетина.
Многокомпонентные препараты, содержащие биологически активные вещества, в частности антиоксиданты, эффективны при лечении ожогов, поскольку оказывают регулирующее влияние на восстановительные процессы в клетках. Важную роль в профилактике и лечении раневой инфекции у обожженных отводят антибактериальным препаратам, которые позволяют снизить инвазивный сепсис ожоговой раны и вызванные в этой связи осложнения [161, 162].
Дигидрокверцетин является одним из самых активных природных антиоксидантов, а его цинковый комплекс демонстрирует еще более высокую эксприментально подтвержденную антиоксидантную активность. Это дало основание для разработки оригинальной фармацевтической композиции для лечения ожоговых ран с использованием цинке о держащего комплекса в качестве действующего вещества. Еще одним компонентом этой композиции является лиственничный воск.