Содержание к диссертации
Введение
1 Водоросли арктических морей как уникальный источник полифенольных соединений (обзор литературы) 8
1.1 Морские водоросли как возобновляемый природный ресурс 8
1.2 Характеристика компонентного состава бурых водорослей 12
1.2.1 Основной химический состав 12
1.2.2 Минеральные вещества 13
1.2.3 Липидно-пигментный комплекс 13
1.2.4 Полифенолы 14
1.2.5 Азотсодержащие вещества 15
1.2.6 Структурные и запасные углеводы 16
1.3 Биосинтез, морфология и свойства флоротаннинов 17
1.4 Способы выделения флоротаннинов 22
1.4.1 Выделение флоротаннинов из биомассы водорослей 22
1.4.2 Выделение полифенольной фракции из экстрактов 27
1.5 Методы исследования полимолекулярного состава флоротаннинов 29
1.6 Методы количественного определения и структурного анализа флоротаннинов 30
1.7 Биологическая активность флоротаннинов 36
1.8 Выводы, постановка цели и задач исследований 40
2 Методическая часть 43
2.1 Объект исследований и маршруты экспедиционных работ 43
2.2 Отбор и консервация проб 45
2.3 Оборудование и реактивы 45
2.4 Методы экстракции водорастворимых веществ 48
2.5 Исследование химического состава биомассы водорослей 49
2.5.1 Исследование общего химического состава 49
2.5.2 Определения содержания общего азота 49
2.5.3 Определение содержания липидов 49
2.5.4 Определение содержания пигментов 50
2.5.5 Определение легкогидролизуемых полисахаридов 50
2.5.6 Определение содержания полифенолов 51
2.6 Определение ионного состава экстрактов 51
2.7 Разделение и анализ полифенольных фракций 52
2.7.1 Разделение полифенольной фракции 52
2.7.2 Изучение молекулярно-массового распределения методом гель-проникающей хроматографии 52
2.7.3 Масс-спектрометрия МАЛДИ 53
2.7.4 Хромато-масс-спектрометрический анализ полифенольных соединений 55
2.7.5 Исследование полифенольной фракции методом флуоресцентной спектроскопии 55
2.8 Медико-биологическая характеристика полифенольных фракций 55
2.8.1 Определение антиоксидантной активности полифенольных фракций 55
2.8.2 Исследование бактериостатической активности полифенольных фракций 56
2.8.3 Исследование фунгистатической активности полифенольных фракций 56
2.8.4 Исследование фагоцитарной активности полифенольных фракций 57
3 Разработка схемы выделения полифенольной фракции арктических бурых водорослей (экспериментальная часть) 58
3.1 Изучение содержания полифенолов в арктических бурых водорослях 58
3.2 Разработка схемы селективного выделения полифенольной фракции арктических бурых водорослей 59
3.2.1 Предлагаемая схема выделения полифенольной фракции . 59
3.2.2 Стадия выделения липидно-пигментного комплекса 61
3.2.3 Стадия выделения водорастворимых веществ 62
3.2.4 Стадия деминерализации водного экстракта I 64
3.2.5 Стадия выделения структурных и запасных углеводов из водного экстракта II 66
3.2.6 Стадия выделения полифенолов 68
3.2.6.1 Стадия выделения полифенолов из водно-спиртового экстракта II 68
3.2.6.2 Стадия выделения полифенолов из водного экстракта III 70
3.2.7 Оценка эффективности выделения полифенольной фракции по разработанной схеме 74
4 Исследование состава, структуры и свойств полифенольных компонентов (экспериментальная часть) 78
4.1 Характеристика полимолекулярного состава полифенольной фракции 78
4.2 Исследование компонентного состава полифенолов методами масс-спектрометрии 80
4.3 Установление взаимосвязи полимолекулярного состава и антиоксидантной активности полифенольных компонентов 84
4.3.1 Фракционный состав полифенольной фракции 84
4.3.2 Характеристика полифенольных подфракций 87
4 4.3.3 Взаимосвязь молекулярной массы и антиоксидантной активности полифенолов 94
4.4 Медико-биологическая характеристика полифенольных фракций 97
Выводы 101
Список литературы 103
- Биосинтез, морфология и свойства флоротаннинов
- Предлагаемая схема выделения полифенольной фракции
- Оценка эффективности выделения полифенольной фракции по разработанной схеме
- Медико-биологическая характеристика полифенольных фракций
Биосинтез, морфология и свойства флоротаннинов
Флоротаннины являются основными цитоплазматическими компонентами бурых водорослей и содержатся внутри клетки, как в свободном, так и в связанном состоянии [37]. Около 90 % от общего количества флоротаннинов находится в свободном состоянии в мембранно связанных везикулах, называемых физодами. Остальная часть полифенольных соединений содержится в клеточной стенке, где они связаны в комплекс с альгиновой кислотой за счет ковалентных эфирных и полуацетальных связей, и действуют в качестве структурного компонента, регулируя осмотическое давление [35, 38]. Некоторые флоротаннины могут находиться в водорослях в сульфатированном или галогенированном состоянии [25].
Исследования распределения флоротаннинов в тканях бурых водорослей показали, что данные соединения аккумулируются преимущественно в наружных клетках эпидермиса [39] и во внешнем кортикальном слое [40] талломов, причем авторы работы [40] отметили, что картина распределения полифенолов не зависит от вида бурой водоросли и стадии ее роста. Накопление флоротаннинов во внешних слоях таллома позволяет им быстро реагировать на стресс и выполнять защитные функции. Так, флоротаннины защищают водоросли от повреждения во время отливов за счет способности поглощать ультрафиолетовое излучение и проявлять значительные антиоксидантные свойства [41]. Флоротаннины также являются основной группой соединений, защищающих бурые водоросли от эпифитов [42].
На данный момент собрано большое количество данных по зависимости суммарного содержания флоротаннинов от вида водорослей, места их произрастания, а также от сезона сбора [43–47]. Так, в работе [43] авторы показали высокое содержание полифенолов в водорослях вида Fucus vesiculosus (15,4 – 18,6 % а.с.м.) и Ascophyllum nodosum (14,6 – 14,8 % а.с.м.), произрастающих в Белом и Баренцевом морях. Ранее норвежская группа исследователей [44] также сделала вывод о высоком содержании полифенолов в данных видах водорослей, при этом, максимальное количество целевых компонентов наблюдалось в зимний период (11-14 %), тогда как в апреле-мае снижалась до 8-10 процентов. Проведенные исследования содержания полифенолов в разных частях таллома в трех видах водорослей семейства Fucaceae показало, что в зоне прикрепления к субстрату находится 7-9 %масс полифенолов в свободном состоянии, в центральной части – 8-16 %масс, в зоне роста – 10-25 %масс, а в репродуктивных органах – 5-8 %масс [48]. Содержание связанных полифенолов на порядок ниже и наибольшее содержание было обнаружено в зоне прикрепления таллома к субстрату (0,5-1,5 %масс).
Наличие полифенольных соединений отмечено в составе и других классов морских водорослей. Так, в работе показано [45] низкое содержание полифенолов в зеленых (1,8 %) и красных (1,8-3,2 %) водорослях по сравнению с бурыми водорослями вида Eisenia bicyclis (19,3 %). Стоит отметить, что наибольшая концентрация флоротаннинов отмечена в водорослях, произрастающих в литоральной зоне.
Сопоставительные данные по содержанию полифенольных соединений в красных, зеленых и бурых морских водорослях, произрастающих на побережьях различных стран (таблица 1.3), свидетельствуют о повышенном содержании полифенолов в бурых водорослях семейства Fucaceae северных регионов.
По структуре и полимерным свойствам флоротаннины представляют собой обширную группу молекул, различающихся характером связей между единицами флороглюцина и количеством гидроксильных групп (рисунок 1.4). В зависимости от типа связи между мономерами, флоротаннины могут быть разделены на 4 подкласса: флоретолы и фугалолы (арил-эфирные связи), фуколы (фенильные связи), фукофлоретолы (арил-эфирные и фенильные связи), эколы и кармалолы (производные флоретолов, содержащие фрагмент дибензодиоксина) [49]. Учитывая степень полимеризации, структурное разнообразие флоротаннинов и наличие конформационных изомеров [24] становится необходимым использование более точной их классификации. Так, авторы работы [50] предлагают в подклассах выделить группы линейных и разветвленных флоротаннинов.
Молекулярная масса полифенолов бурых водорослей варьируется в широком диапазоне от 126 Да до 650 кДа [53], но большинство из них обладают массой от 10 кДа до 100 кДа [54]. Есть предположение, что структура флоротаннинов может изменяться на разных стадиях роста и развития слоевища – олигомеры преобразуются в более сложные полифенолы [55].
Фармакологическая значимость полифенолов связана с их структурой и, в особенности, со степенью полимеризации. Однако стоит заметить, что взаимосвязь между молекулярной массой и антиоксидантной активностью флоротаннинов бурых водорослей до сих пор является предметом изучения [56]. Так, Ферререс [57] с соавторами отметили более высокую антиоксидантную активность высокомолекулярных флоротаннинов по сравнению с низкомолекулярной полифенольной фракцией, тогда как в исследованиях [52, 58–61] показано, что увеличение молекулярной массы выделенных флоротаннинов приводит к снижению антиоксидантной способности. При проведении подобных исследований Ванг с соавторами [56] не обнаружили четкой взаимосвязи между антиоксидантной способностью и молекулярной массой флоротаннинов.
Предлагаемая схема выделения полифенольной фракции
Полифенолы бурых водорослей находятся в биомассе как в свободном, так и в связанном с другими компонентами состоянии. При анализе литературных данных и компонентного состава арктических бурых водорослей (раздел 1.2) можно сделать вывод, что для разработки схемы селективного выделения полифенольной фракции необходимо проведение последовательной разборки биомассы растительного объекта с выделением сопутствующих компонентов и максимальным выходом целевой фракции полифенолов. Для этого предложена многостадийная схема обработки арктических бурых водорослей (рисунок 3.2), основанная на принципах «зеленой» химии.
С целью излечения липидно-пигментного комплекса на первой стадии проводили экстрагирование водорослей хлороформом или гексаном в аппарате Сокслета (рисунок 3.3).
Хлорофилл придает хлороформному и гексановому экстрактам насыщенный зеленый окрас. Полнота извлечения липидно-пигментного комплекса контролируется спектрофотометрически и определяется обесцвечиванием новых порций экстракта. Состав гексанового и хлороформного экстрактов представлен в таблице 3.1.
Исследования эффективности данных экстрагентов показали, что в хлороформный экстракт переходит относительно большее количество полифенольных соединений (1,64 %). Однако при использовании хлороформа наблюдается и более полное извлечение пигментов (100 %) и липидов (70,9 %), что делает данный растворитель наиболее оптимальным для обезжиривания водорослей. Обработанные хлороформом водоросли высушивали при 30 С в сушильном шкафу и подвергали дальнейшей обработке.
С целью извлечения водорастворимых веществ арктических бурых водорослей (минеральные вещества, фукоидан, ламинаран, маннит, аминокислоты и полифенолы) необходим подбор эффективных растворителей на основе анализа протолитических свойств экстрагентов. Для этого проведено сравнение следующих методов жидкостной экстракции – водная, водно-кислотная, водно-спиртовая, ферментативная. В таблице 3.2 приведены сопоставительные данные по степени извлечения полифенольной фракции, аминокислот, маннита, легкогидролизуемых полисахаридов, а также по выходу экстракта.
Наибольшего выхода полифенолов (до 100 %) удалось добиться с применением ферментативной экстракции панкреатином, однако при использовании данного метода необходима инактивация ферментов при 95 С, что может вызвать деструкцию полифенольных соединений. Следовательно, оптимальным методом извлечения полифенолов является водная экстракция с выходом 98 % при 60 С в три стадии по 1 ч. с гидромодулем 1:20. Стоит отметить, что данным методом также максимально извлекаются легкогидролизуемые полисахариды (65,5 %) и маннит (до 100 %). Большое количество сопутствующих компонентов в экстракте говорит о необходимости разделения этого экстракта с выделением целевого продукта – фракции полифенолов.
Оценка эффективности выделения полифенольной фракции по разработанной схеме
В результате экспериментальной работы определены оптимальные параметры проведения каждой стадии предлагаемой схемы выделения полифенолов из бурых водорослей (рисунок 3.7). Используя оптимальные параметры отработана схема выделения полифенолов и проведена постадийная оценка ее эффективности (таблицы 3.11 и 3.12). В таблицах 3.11 и 3.12 представлены усредненные данные, полученные при проведении трех серий экспериментов.
Анализ эффективности показал, что на первой стадии извлекаются липиды (68-74 %отн) и практически полностью выделяются пигменты (90-100 %отн), при этом полифенолы остаются в водорослевом остатке I.
При водной экстракции остатка I в водный экстракт I переходит до 100 %отн полифенолов, содержащихся в исходных водорослях, а также экстрагируются все остальные водорастворимые компоненты бурых водорослей: водорастворимые белки и аминокислоты, легкогидролизуемые полисахариды, маннит и минеральные вещества. В белково-целлюлозном комплексе остаются трудногидролизуемые полисахариды, нерастворимые в воде белки, альгиновые кислоты и минеральные соли.
Использование ионообменных смол для очистки водного экстракта I (содержание минеральных веществ 44-64 %отн) позволяет удалить большую часть солей, в результате образуется водный экстракт II, с содержанием минеральных веществ 14-20 %отн.
При осаждении полисахаридов из водного экстракта II происходит снижение их содержания с 41-56 %отн до 12-21 %отн в водно-спиртовом экстракте I. Водно-спиртовый экстракт I содержит 74-95 %отн маннита и дальнейшее его осаждение позволяет снизить содержание данного компонента до 21-26 %отн в водно-спиртовом экстракте II.
На стадии жидкоть-жидкостной экстракции полифенолов из водного экстракта III в органическую фракцию переходит 58-67 %отн полифенолов, содержащихся в исходном сырье. В водном экстракте IV остается до 24-30 отн% полифенолов. Так же стоит отметить, что остаточные количества сопутствующих компонентов в водно-спиртовом экстракте II после жидкость-жидкостной экстракции остаются, в основном, в водном экстракте IV.
Из таблицы с компонентным составом экстрактов/остатков/фракций (таблица 3.12) видно, что на каждой стадии очистки экстрактов доля полифенолов в экстракте увеличивается, а сама органическая фракция содержит в своем составе 73-83 % полифенолов.
Оценка эффективности показала, что разработанная схема выделения полифенолов из бурых водорослей позволяет выделить до 67 %отн целевого компонента, относительно его содержания в водорослях. Доля полифенолов во фракции достигает 83 %. Дальнейшие исследования направлены на исследования состава, структуры и свойств полифенольных компонентов.
Медико-биологическая характеристика полифенольных фракций
Принимая во внимание литературные данные по биологической активности полифенолов бурых водорослей, а также экспериментально определенную их высокую антиоксидантную активность, выполнены медико-биологические исследования, включающие анализ бактериостатических и фунгистатических свойств полифенолов, а также фагоцитарной активности. Характеристика исследуемых проб представлена в таблице 4.9.
Информация о бактериостатических свойствах полифенольных фракций получена с использованием штаммов возбудителей, выделяемых от больных при гнойных, воспалительных и септических процессах (таблица 4.10). Частота средних уровней бактериостатического действия испытуемых полифенольных фракций №1 и 2 фактически не различаются. Образцы №3, 4 и 5, с диапазоном средних молекулярных масс 10-28 кДа, обладают наибольшей средней бактериостатической активностью.
Бактериостатический эффект до 50-85 % культур бактерий. Испытуемые полифенольные фракции №3, 4 и 5 более активно подавляют рост грамположительных бактерий (золотистый стафилококки и пневмококки), чем грамотрицательных (синегнойная палочка и клебсиеллы пневмонии). Установлено, что бактериостатический эффект испытуемых образцов выше на грамположительные бактерии, чем на грамотрицательные. Возможно, в объяснении этого явления имеет значение тот факт, что грамположительные бактерии содержат в своем составе гораздо больше нуклеиновых кислот. Высокий антибактериальный эффект флоротаннинов для грамположительных штаммов бактерий также отмечен в исследованиях, приведенных в работе [152].
Как известно, экстракты полифенолов бурых водорослей проявляют меньшую противогрибковую активность по сравнению с их антибактериальным действием [154]. В результате проведенных исследований нами также было показано, что активность задерживать рост дрожжеподобных грибов у всех полифенольных фракций ниже 50 %, что означает слабые антисептические свойства (таблица 4.11). Фунгистатический эффект достигает максимума 35 %. Менее чувствительны штаммы широко распространенных C. albicans, более чувствительными оказались штаммы, наиболее редко выделяемые от больных – С. krusei. Подфракции №3, 4 и 5 в среднем обладают выраженным фунгистатическим действием по сравнению с другими образцами.
В таблице 4.12 представлены результаты исследования фагоцитарной активности нейтрофилов крови человека в присутствии полифенольных фракций 20пг/мл реактивной взвеси цитратной крови и латекса, как объекта фагоцитоза. Как видно из представленных данных, испытуемые образцы не подавляют фагоцитарную активность нейтрофильных гранулоцитов крови человека. Эти результаты имеют большое значение, поскольку большинство бактерицидных и бактериостатических субстанций и лечебных препаратов, к сожалению, обладают иммунодепрессивными свойствами, снижая в первую очередь функциональную активность фагоцитов. Полученные нами результаты об отсутствии иммунодепрессивного действия у фракций полифенолов согласуется с литературными данными, которые показывают, что экстракты полифенолов бурых водорослей не проявляют цитотоксичности и испытуемые клетки остаются метаболически активны [115, 152].