Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Развитие современной оптической микроскопии и проблемы создания метода динамической прижизненной микроскопии
1.1 Современная оптическая микроскопия внутриклеточных процессов 8
1.2 Интерферометрические методы 13
1.2.1 Многошаговый метод 14
1.2.2 Оптическая когерентная томография 18
1.2.3 Когерентная фазовая микроскопия 20
1.3 Выводы 23
Глава 2. Метод Когерентной Фазовой Микроскопии
2.1 Особенности фазовых изображений 25
2.2 Описание экспериментальной установки 29
2.3 Свойства фазовых изображений КФМ "Эйрискан" 31
2.4 Метод Динамической Фазовой Микроскопии 34
2.5 Выводы 38
Глава 3. Сверхразрешение в динамических фазовых изображениях. 3.1 Сингулярные точки динамических фазовых изображений 39
3.2 Результаты измерений 40
3.3 Выводы 46
Глава 4. Мембранный электрооптический эффект в митохондрии 4.1 Показатель преломления митохондрий 47
4.2 Подготовка митохондрий к измерениям на КФМ "Эйрискан" 48
4.3 Влияние среды на фазовую высоту митохондрий 51
4.4 Электрооптический эффект в митохондриях 53
4.5 Выводы 57
Глава 5. Идентификация функциональных состояний изолированных митохондрий методом динамической фазовой микроскопии
5.1 Подготовка образцов 60
5.2 Анализ динамических процессов в митохондриях 61
5.3 Результаты измерений 62
5.3.1 Корреляция интенсивности флуктуации и фазовой высоты...62
5.3.2 Влияние среды инкубации на пространственно-временную корреляцию 64
5.4 Обсуждение 79
5.4.1 Влияние энергетического состояния митохондрий на флуктуации фазовой высоты 79
5.4.2 Происхождение пространственно-временной корреляции фазовой высоты 80
5.4.3 Динамический электрооптический эффект 81
5.4.4 Количественная оценка скорости метаболизма 83
5.4.5 Возможность идентификации функциональных состояний митохондрий 85
5.5 Выводы 90
Заключение 92
Литература 94
- Интерферометрические методы
- Свойства фазовых изображений КФМ "Эйрискан"
- Влияние среды на фазовую высоту митохондрий
- Влияние среды инкубации на пространственно-временную корреляцию
Интерферометрические методы
Возможности исследований динамики нативных объектов по полученным с ПЗС камеры изображениям, как правило, ограничены определением их скоростей и траекторий движения (см. рис. 1.1). В видео- и флуоресцентной микроскопии для визуализации движения клеточных органелл, размером менее 1 мкм, используют флуоресцентные маркеры, красители или метод усиления фазового и дифференциально-интеференционного контраста [8]. Это позволило в некоторых случаях преодолеть классический предел оптического разрешения. На рис. 1.2
показаны изображения эндоплазматического ретикулума, иллюстрирующие достижения видеомикроскопии.
С помощью видеомикроскопии оказалось возможным обнаружить биоструктуры с линейным размером менее 200 нм, но регистрировать малые движения внутри субмикронных структур не удавалось [6]. Для этой цели используются потенциал-зависимые флуоресцентные красители. Изменения мембранного потенциала влияют на спектры излучения или поглощения флуоресцирующих сорбированных молекул красителя. Таким образом, даже при условии ограниченного пространственного разрешения по флуктуациям мембранного потенциала удавалось получить информацию о биологических процессах. Флуоресцентные методы пока остаются основным средством исследований динамических явлений на молекулярном и клеточном уровнях.
Развитие компьютерной техники привело к тому, что быстродействия серийного персонального компьютера стало достаточным для захвата и обработки видеопоследовательностей в реальном масштабе времени. Поэтому, на ряду, с дорогостоящими приставками (ARGUS-20, ARGUS-50 Hamamatsu Corp.) получили распространение более доступные по цене программные пакеты анализа изображений. Передача изображения от цифровой ПЗС камеры в персональный компьютер может осуществляться через высокоскоростные порты FireWire IEEE-1394 (400 Мбит/с) и USB 2.0 (480 Мбит/с). Такое программное обеспечение, как правило, предлагается производителями ПЗС- камер и видеомикроскопов. Например, программный пакет KS 400 Software фирма Zeiss поставляет в комплекте с серийными микроскопами Axioplan 2, Axioskop 2, Axiovert 100М. Такое программное обеспечение может включать: - обработку изображений (контраст, фильтрация, сглаживание, резкость, выделение граней); - теневую коррекцию; -12 - определение градиентов; - интерактивное измерение расстояний, углов, траекторий; - быстрое преобразование Фурье (БПФ). В оптических системах мониторинга флуктуации клеточного мембранного потенциала (Hamamatsu, RedShirtlmaging) в качестве коорди-натно-чувствительных фотоприёмников применяются ПЗС и фотодиодные камеры. Динамический диапазон фотодиодных матриц, по сравнению с ПЗС камерами значительно шире (рис. 1.3). Это позволило осуществить измерения на популяциях клеток. Чувствительные ПЗС камеры используются также для определения мембранного потенциала на изолированных клетках [11].
Сравнительный анализ характеристик ПЗС камеры и фотодиодной матрицы, используемых фирмой RedShirtlmaging в оптических системах измерения мембранного потенциала клеток [11].
Мембранный потенциал АЧ в [10,11] оценивался рациометриче-ским методом. Измеряемая величина - отношение интенсивностеи флуоресценции потенциал-чувствительных красителей (родамин 123, эфир тетраметилродамин метил (TMRM), эфир тетраметилродамин этил (TMRE)) для различных длин волн, измеряемых одновременно. Отношение интенсивностеи этих сигналов даёт величину, линейно связанную с мембранным потенциалом. Воспроизводимость измерений около 5 мВ, временное разрешение достигает 0,5 мс [10]. Для калибровки по мембранному потенциалу необходимо построение кинетической зависимо -13-сти измеряемой величины (см. рис. 1.4) [1] или параллельное измерение AW зондовым методом [12].
Калибровочный график для определения потенциал на мембране митохондрии флуоресцентным методом [1]. Шкала значений отношения интенсивности флуоресценции для Я,=573 и А=546 нм показана слева. Шкала значений мембранного потенциала показана справа.
Необходимость калибровки значительно усложняет проведение эксперимента. Другие недостатки флуоресцентных методов [12] также хорошо известны: ограниченный характер информации, генерация супероксидов, ограниченное временное разрешение, зависимость от условий освещения; высокая чувствительность к условиям проведения эксперимента (температура, концентрация красителя), образование свободных радикалов [20,21] и других побочных продуктов фотодинамических процессов.
Дальнейший прогресс в микроскопии внутриклеточных процессов будет зависеть в значительной степени от разработки новых высокочувствительных неинвазивных методов.
Одновременно с исследованиями на основе флуоресцентной микроскопии проводилась разработка других, альтернативных методов получения функциональных изображений с использованием спектрального -14-[11] и временного разрешения, нелинейной оптики [5] и интерферометрии [7,8,16]. Интерферометрические методы применялись в профило-метрии поверхности твердых тел ещё в 80-х годах. В профилометрии использовалась зависимость фазы отражённой волны от пройденного ею пути, т.е. от локальной высоты поверхности. Длина волны в фазовых изображениях является естественным стандартом расстояния. Фазовые изображения являются конкретным примером функционального изображения и могут быть получены, используя следующие методы: многошаговый [7,13,14,16], Фурье-метод (на основе преобразования Гильберта) [17,23], метод временного интервала [25,26]. Эти методы измерения фазы легли в основу оптической профилометрии [7,14,16], томографической микроскопии [13], оптической когерентной томографии [17,23] и когерентной фазовой микроскопии [25,26].
Свойства фазовых изображений КФМ "Эйрискан"
Метод динамической фазовой микроскопии (ДФМ) основан на последовательных многократных измерениях фазы или ОРХ вдоль выбранной на фазовом изображении (топограмме) линии сканирования. В результате формируется двумерный массив (трек-диаграмма) данных h(X,Y,t+mx), гдеХ,У - координаты в плоскости изображения, т=0,1,2,3,... , т - время измерения одного профиля. Сечение трек-диаграммы вдоль оси времени представляет собой регистограмму изменений значений ОРХ в заданной точке фазового изображения. Временное разрешение в этом методе определяется временем измерения фазы в точке и количеством точек в скан-линии. Если линия сканирования состоит из двух точек, минимальное временное разрешение будет около 2 мсек.
Динамический процесс, который в эксперименте проявляется в виде измеряемой физическими методами флуктуации ОРХ, может быть связан с зависящей от времени компонентой скалярного показателя преломления n(r,t) = n(r)+8n(r,t). Нас в дальнейшем будут интересовать пространственно-временные характеристики функции 8n(r,t) и связанные с ними движения. Следует различать внутренние и трансляционные движения. Так, например, наблюдаемые методами видеомикроскопии [6,8] трансляционные движения вдоль микротрубочек макромолекул, митохондрий и других органелл, формально можно представить функцией координат центра частицы (г - ut) с объемом V и показателем преломления 8n(r,t) = 5п(г - ut), где и - проекция средней скорости на траекторию r(t).
В дальнейшем мы уделим основное внимание видам движения, которые можно представить функциями с разделяющимися переменны ми координат и времени, которые более адекватны внутренним движе ниям: 5n(r,t) = 16nm(r)e-j4 Здесь 5nm(r) - собственные функции, удовлетворяющие граничным условиям, Qm - собственные значения частоты, m = 1,2,... При этом предполагаем, что внутри конечного объема V происходят локальные синхронные колебания. При этих условиях измерения ОРХ h(r,t) могут дать ряд значимых динамических параметров объекта: локальные частоты собственных колебаний Qm, радиусы и времена корреляции, а также другие характеристики, известные из статистической теории открытых систем.
Определение функции 5n(r,t) эквивалентно решению обратной задачи - нахождения динамических параметров системы по измеренным в плоскости изображения объекта значениям фазы рассеянной волны Аф(х,у). Некорректность задачи и неоднозначность решений связаны с измерением одной величины (ОРХ), в которую дают вклады многие параметры.
Покажем, что в динамические фазовые изображения преобладающий вклад дают кооперативные процессы [25]. Предположим, что при когерентном освещении поверхности объекта источником с частотой ю, рассеянную волну E2(t) на площадке изображения S с координатами центра X,Y можно представить свёрткой:
Пусть эти N идентичных по размерам динамических объектов расположены вблизи фокальной плоскости z = О внутри слоя с границами z = ±Н/2 и могут быть представлены независящей от координат скалярной функцией показателя преломления np(x,y,z,t) = np(t). Предположим, что площадь пикселя S в плоскости изображения ограничена дифракцией на апертуре объектива. Тогда интегрирование (2.3) должно происходить по площади s = 71W2 = S/M2 круга, радиуса w, где w физическое пространственное разрешение микроскопа. Эквивалентная процедура усреднения может быть произведена также в плоскости изображения X,Y на круге с площадью S = 7rW2, W/w = М.
Фотоприемник регистрирует среднюю по площади пикселя S интенсивность, из которой с помощью интерферометра определяется среднее по площади S значение фазы интерференционного сигнала в фазу переменной составляющей фототока определяется статистическими характеристиками ap(x,y,t) и 5 pp(x,y,t).
Определим зависимость между флуктуациями амплитуды ap(x,y,t) и фазы 5(pp(x,y,t) в двух предельных случаях. Для малых флуктуации (ар(х,уД)«1,5фр(х)уД)«1): 5ср(Х,Y,t) = N-1S59p(x,y,t) И (Ez(X,Y,t) = (ap(x,y,t)) = N(ap(x,y,t)). При отсутствии корреляции в фазовых флуктуациях динамических объектов: /89p(x,y,t)5(pr (x,y,t + T)\ = 0, (р г), и корреляционная функция фазы интерференционного сигнала будет в N раз меньше корреляционной функции фазы изолированного динамического объекта: К,(Х, Y,T) = (8Ф(Х, Y,t)5(p (X,Y,t + т)) = N"2 ЕI (бФр(х, у, 1)6Фг (х, у, t + т) = N"1k(T) (2.4) В случае полной фазовой корреляции: К,(Х,Хт) = М-2ЕЕ (рр(х,уД)5фг (х,уД + т) =к(х) (2.5) Формулы (2.4) и (2.5) находятся в согласии с хорошо известным выводом о том, что в некоррелированных процессах суммируются интенсивности, а в коррелированных - амплитуды. Из этого также следует, что преобладающий вклад в 8ф(Х,УД) будут давать кооперативные процессы с радиусами корреляции, соизмеримыми или большими размерами пикселя. При частичной корреляции процессов их интенсивность при прочих равных условиях будет убывать с ростом числа N независимых элементов вместе с квадратом отношения радиуса корреляции R к разрешающей способности 1/N= (RA/V)2.
Показана некорректность использования в фазовых изображениях некоторых традиционных понятий оптики амплитудных изображений. В частности, в фазовых изображениях можно реализовать, зависящие от входной апертуры объектива сверхразрешение, то есть превышение разрешения над классическим пределом.
Другое необычное свойство состоит в том, что фаза зависит от поляризации рассеянной волны и в общем случае является неоднозначной функцией координат. Поэтому в окрестности нулей интенсивности интерференционного поля могут возникать дислокации волнового фронта.
Развитие метода когерентной фазовой микроскопии позволило разработать метод регистрации динамических фазовых изображений. Его основные преимущества, недоступные другим методам, состоят в возможности количественной оценки параметров кооперативных процессов в нативных, неокрашенных биообъектах, в высокой чувствительности и пространственно-временном разрешении.
Влияние среды на фазовую высоту митохондрий
Информация о динамических процессах в митохондриях извлекалась из трек-диаграммы h(x, t), которая получалась в результате периодического многократного сканирования профиля фазовой высоты h(x) вдоль фиксированной на изображении скан-линии. Полученная таким образом матрица значений h(x, t + рх) (здесь х - время задержки между строками, р = 0,1,2,3... - номер строки) давала равномерную выборку в фиксированной точке скан-линии. Обработка содержащейся в h(x, t) информации о динамическом процессе позволяла представить ее в любой точке скан-линии в виде спектров, спектральных портретов, корреляционных функций и других динамических характеристик. Временное разрешение х = 2-50 мс зависело от выбранного числа пикселей в скан-линии.
Медленные флуктуации ФВ могли быть связаны, как со структурными изменениями митохондрии в различных фазах дыхания и средах инкубации, так и с ее броуновым движением в целом. Механизм относительно быстрых флуктуации был иной. По-видимому, заметный вклад давали малоинерционные процессы, в том числе, зависящие от МП, а также акустические воздействия.
Для собственных шумов микроскопа были характерны значения интенсивности l(x) = 0,5-1 нм2 и спектральной плотности р(х) = 2-5 нм2/Гц. Контрольные измерения вне митохондрии давали значения l(x) = 1-3 нм2, р(х) = 5-10 нм2/Гц. Они были связаны в основном с броуновым движением митохондрий в жидкости и внешними акустическими воздействиями. В энергизованных митохондриях интенсивность и спектральная -плотность флуктуации фазовой высоты достигали 1(х) = 40 нм2, р(х) = 300 - 500 нм2/Гц, соответственно.
Корреляция интенсивности флуктуации и фазовой высоты Поскольку связь флуктуации фазовой высоты (ФВ) с функциональным состоянием (ФС) была далеко не очевидна, первым шагом в этом направлении было исследование зависимости интенсивности l(x,t) флуктуации ФВ от энергизации митохондрии. Интенсивность l(x,t) была наиболее простой и доступной функцией, а ее изменение вдоль скан-линии зависело от ряда факторов, в частности, от состава среды инкубации.
Изменение во времени среднего значения hmax . Справа показана шкала соответствующих значений МП. б) Изменение во времени максимального значения интенсивности флуктуации Ітах, коррелированное с hmax и ДЧР . При введении ротенона, интенсивность флуктуации митохондрии снижалась до уровня шумов. При добавлении сукцината интенсивность флуктуации возрастала, в,г) Корреляция между изменениями ФВ и интенсивности флуктуации при гидролизе АТФ. При введении АТФ в среду с предварительно деэнергизованными ротеноном митохондриями наблюдался значительный рост ФВ и уровень флуктуации интенсивности. Ингибирова-ние АТФазы олигомицином приводило к падению интенсивности флуктуации.
При ПО следовательном введении в среду инкубации ротенона и сукцината. Ранее в главе 4 было показано, что состав среды инкубации влияет на МП и средний по объему митохондрии показатель преломления. Справа на рис. 5.1а приведена шкала рассчитанных значений МП, для значения электрооптической константы К= = hmax / АХ = 3-Ю"7 м/В.
Изменения интенсивности флуктуации lmax коррелировали с hmax (t) (см. рис. 5.16). При ингибировании ротеноном 1-го комплекса дыхательной цепи фазовая высота hmax снижалась до предельной величины 5 -10 нм, характерной для деэнергизованного состояния митохондрии, а интенсивность флуктуации была на уровне шумов (1 = 1-3 нм2). Из рис. 5.1а,б видно также, что последующее введение сукцината увеличивало МП за счет активации комплексов ДЦ и приводило к росту интенсивности флуктуации МП.
При введении АТФ в среду с митохондриями, предварительно де-энергизованными ротеноном, происходил значительный рост ФВ (см. рис. 5.1 в). Корреляция между изменениями ФВ и интенсивности флуктуации при стимуляции АТФазы видна из графиков на рис. 5.1 в,г. С увеличением ФВ (см. рис. 5.1 в) митохондрий резко поднимался уровень флуктуации интенсивности (см. рис. 5.1 г). Ингибирование АТФазы оли-гомицином приводило к падению ФВ и интенсивности флуктуации.
Приведенные на рис. 5.1а-г результаты согласуются с предположением о зависимости интенсивности флуктуации от уровня мембранного потенциала митохондрии. Они также не противоречат результатам измерений флуктуации МП [50,51,56,57]. Статистическая обработка результатов измерений, частично приведенных на рис. 5.1, позволила в координатах lmax, птах определить области параметров, которым соответствуют различные функциональные состояния (ФС) митохондрий. С известной степенью условности на рис. 5.2 обозначены области D1 - для полностью и D2 - для частично деэнергизованных состояний, N - для митохондрий при окислении эндогенных субстратов, Е - для энергизо-ванного состояния (при избытке субстрата).
Обработка результатов измерений в координатах hmax и lmax позволила определить области параметров, соответствующих различным состояниям энергизации митохондрии. Области "D1" и "D2" - для полностью или частично деэнергизованных состояний, "N" - для митохондрий при окислении эндогенных субстратов, "Е" - при избытке субстрата окисления. Например, к состоянию "N" относятся результаты измерений в средах (N) и (F): "N" є (N),(F); "D1" є (A),(C),(D); "D2" є (H),(E); -E" є (B),(G),(I).
Из рис. 5.2 следует отсутствие однозначной корреляции между lmax, hmax и ФС. ЭТО МЫ объясняем тем, что hmax « АХ и lmax являются в известном смысле интегральными параметрами и не определяют однозначно ФС митохондрий. Ниже будет показано, что более конкретную и адекватную информацию о ФС можно получить из анализа пространственно-временных флуктуации.
Влияние среды инкубации на пространственно-временную корреляцию
Приведенные выше результаты подтверждают связь флуктуации ФВ с мембранным потенциалом. Однако МП может оказывать влияние на оптические свойства среды только в результате какого-либо механизма, формально отнесённого к категории электрооптических эффектов. Но более важным и фундаментальным вопросом является статистическая природа флуктуации МП, поскольку они возникают в результате работы большого числа (порядка 1000) источников - протонных помп. Присутствие в спектрах флуктуации ФВ и МП контрастных компонент является весомым аргументом в пользу гипотезы о временной синхронизации протонных помп. Эта взаимная синхронизация протонных помп формально объясняет также пространственную корреляцию флуктуации. Действительно, если радиус действия этого, пока неизвестного, синхронизирующего фактора достаточно велик, то связанные с работой пространственно удаленных помп изменения ФВ будут синхронны. Следовательно, взаимная синхронизация протонных помп может объяснить происхождение пространственно-временной корреляции флуктуации ФВ.
Из формальной аналогии с автоколебательными системами можно сделать вывод, что энергизованная митохондрия представляет собой самоорганизованную систему с механизмом взаимной синхронизации большого (= 103-104) числа источников и характерными временами корреляции флуктуации 0,3 - 1 секунды.
Остаются вопросы относительно энергетики и механизма синхронизации помп, принадлежащих к различным группам ферментов, влия -81 -ний внешних факторов на характерные частоты флуктуации и радиусы их корреляции.
Введение FCCP при малых (= 10"7 М) концентрациях снимает сопряжение и увеличивает скорость потребления кислорода митохондриями [44]. При этом также происходят спонтанные переходы между активным и деэнергизованными состояниями окислительного фосфорили-рования [56], сопровождающиеся большими (свыше 100 мВ) амплитудами изменений МП. Эти переходы еще более отчетливо наблюдались при действии циклоспорина на изолированные митохондрии [50,51]. Приведенные на рис. 5.156 и рис. 5.16 результаты измерений ФВ при малых концентрациях FCCP и с циклоспорином показали во многом аналогичные результаты. Из этих и других наблюдений следовало, что между измеряемыми различными методами флуктуациями МП и ФВ есть не только причинная зависимость, но между ними могут существовать также количественные соотношения, например, пропорциональность. Мы предположили существование этого динамического электрооптического эффекта (ДЭОЭ), не обсуждая его биофизическую природу.
С целью определения соответствующей константы мы использовали результаты измерений больших скачков в флуктуациях ФВ рис. 5.156 и 5.16а, которые в соответствии с [51,56,58,59] можно было идентифицировать, как переходы между активным и пассивным (деэнергизо-ванным) состояниями митохондрии. Максимальное изменение ФВ мы отождествили с величиной скачка МП при открытии РТР поры, приблизительно равного 5T = 100 мВ [51]. Скачок ФВ 8hmax= 30 нм составлял не менее 70 - 80 % от максимально возможного изменения ФВ. Из отношения величин ФВ (8hmax = 20-40 нм на рис 5.16а и Рис. 5.156) и скачка МП 5Т = 100 мВ в предположении линейной зависимости флуктуации ФВ и
Значения 1С и электрооптической константы К= для статических величин (см. главу 4) К= = AvF / hmax = 3-Ю"7 м/В совпадали в пределах принятых допущений и точности измерений.
Приведенные в главе 4 оценки показали, что статические изменения ФВ можно объяснить электрооптическим эффектом во внутренней мембране митохондрии. Природа ДЭОЭ менее понятна и можно ожидать, что помимо ДЭОЭ какой-то вклад в К = бПтах/бЧ могут давать также структурные изменения, опосредованно связанные с МП. Такие медленные, с характерным временем порядка минут, изменения матрикса в процессе дыхания и фармакологических воздействий хорошо известны [49] и подтверждаются данными электронной микроскопии. Однако, большой вклад в 1С структурных изменений, связанных с быстрыми, малоинерционными процессами значительно менее вероятен. Сложность проблемы и большое число факторов, влияющих на ФВ и МП, не позволили пока предложить простую и физически прозрачную модель ДЭОЭ. Предположение о линейной зависимости (5.1) между 8hmax и 84 , а также оценку вклада потенциал-независимых факторов можно будет проверить при одновременном измерении флуктуации ФВ и МП.
Мы придаем принципиальное значение ДЭОЭ, поскольку в случае подтверждения (5.1) появится возможность количественного анализа флуктуации МП, измеряемым с высоким пространственным и временным разрешениями методом динамической фазовой микроскопии (ДФМ).
Ниже мы рассмотрим некоторые следствия ДЭОЭ, в том числе возможность количественной оценки интенсивности метаболизма изолированной митохондрии. Из хемиосмотической гипотезы Митчелла следует, что увеличение МП возможно только в результате работы протонных помп, а его снижение есть следствие необратимой для МП потери энергии на биохимические реакции. При этом не принимаются во внимание биохимические «аккумуляторы» энергии. Согласно этой существенной предпосылке скорость увеличения МП пропорциональна производительности протонных помп, т.е. скорости окисления субстрата.
«Производительность» Н+ помп зависит от принадлежности к группе комплексов ДЦ и может достигать 6 протонов на молекулу сукцината. Число активных Н+ помп rjN зависит от концентрации и состава субстратов и не может превышать величину Л/, равную числу комплексов данного вида на всей поверхности мембраны.
После этих предварительных замечаний можно перейти к оценке скорости метаболизма изолированной митохондрии, предполагая, что известны амплитуды флуктуации МП или константа К позволяет определить их величину по измеренным амплитудам флуктуации ФВ.