Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Пространственные структуры циклических депсипептидов, состоящих из сС -аминокислотных и С -оксикислотных остатков 7
1. Конформационная номенклатура пептидов и депси-пептидов 8
2. Циклические тетрадепсипептиды 19
3. Циклические гексадепсипептиды 26
4. Циклические октадепсипептиды 42
5. Циклические додекадепсипептиды 51
Глава 2. Определение кристаллических структур циклододекадепсипептидов
1. Кристаллизация объектов исследования 82
2. Получение экспериментальных данных и модификация программы сбора интегральных интенсивностеи 84
3. Краткое описание комплекса программ по "прямым" методам на основе системы "G?TAN" 88
4. Расшифровка и уточнение кристаллических структур 94
Глава 3. Кристаллическая и молекулярная структура мезо--валиномицина 100
Глава 4. Кристаллическая и молекулярная структура гекса-N--метилвалиномицина 119
Глава 5. Кристаллическая и молекулярная структура "ложного" валиномицина 142
Основные результаты работы 162
Литература ,,,,,,,»,,,.... 164
- Конформационная номенклатура пептидов и депси-пептидов
- Получение экспериментальных данных и модификация программы сбора интегральных интенсивностеи
- Кристаллическая и молекулярная структура мезо--валиномицина
- Кристаллическая и молекулярная структура гекса-N--метилвалиномицина
- Кристаллическая и молекулярная структура "ложного" валиномицина
Введение к работе
Одним из важнейших направлений современной молекулярной биологии и биооргаїїической химии является изучение структуры и функции биологических мембран. При изучении явлений, происходящих в биологических мембранах, широко используются макроциклические соединения, образующие устойчивые комплексы с ионами щелочных металлов и специфически влияющие на ка-тионный транспорт через биологические и искусственные мембраны. К числу таких соединений относятся различные природные и синтетические макроциклические соединения - пептиды, депси-пептиды, депсиды, полиэфиры. Среди веществ этого типа центральное место занимают антибиотики ряда валиномицина. Важная особенность действия валиномицина - высокая К/д/а избирательность индуцированной им катионной проницаемости. Влияние валиномицина на ионный транспорт через мембраны тесно связано с его способностью избирательно образовывать устойчивые комплексы с катионами калия. Учитывая решающую роль конформациоя-ных факторов при функционировании металлокомплексирующих макроциклов, исследования пространственной структуры антибиотиков валиномицинового ряда приобретают особую актуальность.
Интенсивные исследования взаимосвязи между структурой и функцией биологически активных веществ ведутся в Институте би о органической химии им. М.М. Шемякина АН СССР. Для выяснения зависимости между первичной структурой, комплексообразо-ванием и корформационными состояниями в Институте была синтезирована и изучена в растворах серия аналогов валиномицина, отличающаяся от природного антибиотика размером цикла, природой боковых цепей, конфигурацией остатков и заменами сложно- эфирных и амидных групп на амидные, метиламидяыв и сложноэфир-ныв группы. Изучение влияния изменений первичной структуры валиномицина на пространственное строение образующихся аналогов, устойчивость их комплексов и мембранную активность позволяет глубже понять природу взаимодействий, ответственных за функционирование валиномицина. Для этих исследований привлекались разнообразные химические, физико-химические и расчетные методы.
Значительную роль в развитии структурных исследований биологически важных объектов играет рентгеноструктурный анализ. Получаемая этим методом структурная информация является основой для решения проблемы установления связи между структурой и функцией. Тот факт, что этот метод применим только к веществам в кристаллическом состоянии, не умаляет значения получаемых данных, так как в кристаллах исследуемых соединений реализуется одна из оптимальных (а зачастую и энергетически самая выгодная) конформация, существующая в растворе. Структурные исследования позволяют путем установления взаимосвязи между структурой и функцией получить ценную информацию, необходимую для понимания тонких деталей механизма функционирования этих биологически важных молекул. Систематические исследования пространственного строения циклических пептидов и депсипептидов помимо самостоятельного интереса позволяют решить ряд общих вопросов, связанных с выяснением путей реализации замкнутых молекулярных систем. Данные, полученные при рентгеноструктурном исследовании циклодепсипептидов, также представляют интерес с точки зрения выяснения деталей формирования пространственной структуры полипептидных цепей, на базе которых построены все белковые молекулы. Ранее были изучены кристаллические структуры валиномицина [і, 2], его комплексов с металлами [3-7], а также аналогов в свободном состоянии [8-12].
Целью настоящей работы явилось установление "прямыми" методами кристаллических и молекулярных структур трех циклических додекадепсипептидов: цикло[У<Н~пЗІ*Л)-№ь--3)-%-CD-УоЄ-НУ1-Vae-J)-HyOr] ([Vae^, D-l/оЄ3] мезо-HyL -валиномицина); цйкло[-(3)-МеУл"Ьас-Ме\/а?-Л)-Н«|0-] (гекса-А/-метил-валиномицина); цикло[-(Ь-Ну1-у4л-/А/4-^Ь-1/о^-7 (так называемого "ложного" валиномицина). Все эти соединения являются аналогами валиномицина. мезо-Hjjl -валиномицин в отличие от ме-зо-Htji -валиномицина (цикло[-(3)-Vb-HyL-Уа6-2)-Ну0з~] ) исключительно эффективно связывающего ионы калия в растворах, характеризуется относительно слабой комплексообразующей способностью. Константы устойчивости его К*- комплекса в этаноле на 2 порядка ниже, чем у валиномицина и на 3 порядка ниже, чем у мезо-Нуі -валиномицина /І37. Его первичная структура отличается от структуры мезо-Hyl -валияошцина заменами конфигураций остатков Mat в первом и третьем положениях. Гекса-Л/-метилвалиномицин отличается от природного антибиотика валиномицина заменой всех аглидных групп на метиламидные. "Ложный" валиномицин был получен с использованием "топохими-ческого" принципа модификации /14J и отличается от валиномицина заменами стереохимически подобных аминокислотных остатков на оксикислотные остатки и оксикислотных остатков на аминокислотные. Эти два аналога характеризуются отсутствием комплексообразующей способности /ІЬ, Іб/.
На примере этих аналогов предстояло выяснить, какое влияние оказывают данные изменения на пространственное строение депсипептидного остова, и на основе структурных данных объяснить резкое различие в их свойствах.
Решение структур такой сложности "прямыми" рентгеновскими методами является нетривиальной задачей в виду большего числа атомов в элементарной ячейке. Поэтому в задачи работы входила адаптация на мини ЭВМ "EcfcLpsfc С-330" система программ " QTAN" и создание на ее основе комплекса программ для решения структур низкомолекулярных соединений "прямыми" методами.
Конформационная номенклатура пептидов и депси-пептидов
Пространственные структуры пептидов могут быть представлены в виде координат атомов, из которых они состоят. Такое описание является наиболее полным. Все пептиды состоят из аминокислотных остатков с общей формулой - /VHg-CHR-C O ". Аминокислотный остаток может находиться в двух зеркально связанных друг с другом конфигурациях, называемых Ц и D (рис. I). Другим элементарным звеном полипептидной цепи является амидная группа (С О - МН). Ее характерной особенностью является плоское транс- или цис- строение, причем длины связей и валентные углы у этой группы очень слабо зависят от природы бокового остатка (R ) [11 J. Усредненные значения геометрических параметров амидной группы показаны в табл. I. Это позволило ввести конформационнуго номенклатуру для пептидов /18 J. В соответствии с ней допускается, что длины связей и валентные углы для амидных связей, приведенные в табл. I, являются одинаковыми для всех пептидов, так что конформация отдельного остатка в остове цепи полностью определяется тремя независимыми параметрами, а именно: углами вращения вокруг связей N-С , Сч-С , С -N, обозначаемыми как ,47 и со соответственно. Такой способ описания облегчает сравнение конформаций молекул пептидов. Атомы боковых цепей обозначаются посредством букв f , % ,5 (в направлении от С -атома); С4 -X , X? -X , Xу -Xs (X = С, О или S ), связи нумеруются как I, 2, 3, а углы вращения вокруг этих связей обозначаются как К , X , А .
Получение экспериментальных данных и модификация программы сбора интегральных интенсивностеи
Для сбора интегральных интенсивностей было использовано математическое обеспечение для автодифрактометра "Synex-P2I", созданное в Ж АН СССР Ю.В. Некрасовым. Оно является более совершенным, нежели предоставляемое фирмой, поскольку позволяет вести поиск рефлексов в автоматическом режиме, осуществлять контроль за ориентацией монокристалла во время съемки и учитывать его небольшие смещения относительно первоначально установленной позиции; при большом смещении кристалла съемка останавливается и исследователю предоставляется возможность самому принять решение о продолжении съемки. Также осуществляется контроль за радиационным разрушением кристалла (с остановкой съемки, если уровень разрушения превосходит заданный в начале съемки) и необходимым уровнем точности при сборе экспериментальных данных.
С целью использования данного математического обеспечения на автодифрактометре "$упЛХ- Й" была осуществлена его модификация. Она касалась участков программы, связанных с различиями между автодифрактометрами: подпрограммы подготовки движения к заданным углам 29, СО , \р , % ( FSLV 8); подпрограммы опроса датчиков углов и расчета количества приводных импульсов для сдвига осей гониометра на необходимые интервалы (RAXX); подпрограммы открытия и закрытия рентгеновского пучка (OPS Н, CLSH); подпрограммы подготовки к сбору рентгеновских квантов (SSCR ); подпрограммы прерывания, осуществляющей контроль за временными интервалами, необходимыми для расчета скорости движения осей гониометра, контролирующий посылку импульсов движения на моторы осей гониометра и рассчитывающей интенсивность измеренных рефлексов (INTR); подпрограммами, управляющими движением, чтением и записью на магнитную ленту ( FIL , РЕС). Изменены были отдельные константы (связано с различными частотами прерывания в автодифрактомет-рах) в различных участках программы. Для модификации потребовалось дополнительно I04g ячейки. Надо отметить, что все изменения выполнены в кодах мини ЭВМ "Нова-1200". Это связано с тем, что в данном варианте автодифрактометра отсутствует возможность работать на языке программирования более высокого уровня .
Было использовано Си К -излучение, фокус трубки 0,1x1 мм, графитовый монохроматор, режим работы трубки 40 кВ и 35 мА. Все экспериментальные интегральные интенсивности измерялись до разрешения 0,98 А0 /28-методом. Для этих данных были проведены коррекции на факторы Яорентца и поляризации (LP), поправки на поглощение по Филлипсу /"78 7 и радиационное разрушение кристаллов, которое достигало 30$. Массивы экспериментальных структурных амплитуд состояли из 4322, 4457 и 4726 независимых отражений для соединений I, и и Ш соответственно.
Решение фазовой проблемы было осуществлено "прямыми" методами на основе системы программ QTAN, разработанной в Медицинском Институте Буффало (США) для ЭВМ серии PDP / 79_7. Основным достоинством QTAA/ является то, что во временные интервалы, характерные для других доступных комплексов (РЕНТГЕН, MULTAN ), исследователю предоставляется возможность сгенерировать и провести оценку гораздо большего количества вариантов фаз. Это позволяет задавать большой стартовый набор опорных отражений, что является принципиальным при решении сложных структур (число независимых атомов больше 60).
Кристаллическая и молекулярная структура мезо--валиномицина
В отличие от мезо-Hjt -ваяиномицина, исключительно эффективно связывающего ионы калия в растворах, исследуемый аналог характеризуется относительно слабой комплексообразующей спо + собностыо; константы устойчивости его К-комплекса в эталоне на 3 порядка ниже, чем у природного антибиотика валиномицин I3J. На данном примере представляло интерес выяснить, какое влияние оказывает изменение конфигурационной посяедова ДЄПСИ тельности в тетрЭИептидном фрагменте мезо-Нуі -ваяиномицина на пространственное строение депсипептидного остова и на основе полученных структурных данных объяснить резкое различие в свойствах обоих валиномициновых аналогов.
Координаты атомов С, А/ , 0 исследуемого соединения и двух молекул ацетона после последнего цикла уточнения приведены в табл. 17. Упаковка молекул в кристаллической ячейке в проекции вдоль оси показана на рис. 31. Средние плоскости молекулярных циклов в кристаллической решетке приблизительно параллельны плоскости 6 -с ячейки. Каждая молекула циклододека-депсипептида в кристалле связана водородными связями с двумя соседними молекулами; около 20 межмолекулярных контактов ха-рактеризуются межатомными расстояниями меньше 3,5 А.
Величины валентных связей и углов даны в табл. 18 и 19. Геометрические параметры имеют в основном нормальные зна- . чения, характерные для большинства депсипептидных соединений (см. [l\J и цитированные там работы). Исключение составляют заниженные значения валентного угла Cg-Cg-Ojgt 109) и валентных связей боковых цепей Cg-Cg и Сд-С (1,463 и 1,431 А соответственно). В последнем случае отклонения от нормальной длины С-С связи ( І,54І), по-видимому, обусловлены большой амплитудой крутильных колебаний вокруг соответствую-щих связей С -С . На это косвенным образом указывают повышен-ныв значений изотропных температурных факторов концевых С -атомов. Величина частично кратной сложноэфирной связи Cg-Og основной цепи также ниже обычной (1,305 А). Длины карбонильных связей амидных групп (большинство из них участвуют в сильном водородном связывании) заметно больше (в среднем на 0,04 А) соответствующих связей сложноэфирных групп.
Координаты и, как следствие, геометрические параметры сокристаллизующихся молекул ацетона были определены наименее точно. Полученные структурные данные указывают на сильную дезориентацию этих молекул из-за эффектов тепловых колебаний атомов; их температурные факторы в 2-5 раз выше, чем у атомов исследуемого депсипептида, при этом факторы, отвечающие одной молекуле ацетона, в 2 раза выше, чем у другой. В обоих случаях не представлялось возможности сделать однозначный выбор положения (среди трех возможных), отвечающего атому 0; длины предполагаемых С=0 связей оказались сильно завышенными и практически мало отличались от длин двух других связей С-С.
Кристаллическая и молекулярная структура гекса-N--метилвалиномицина
Гекса-/\/-метилвалиномицин отличается от природного антибиотика заменой всех амидных групп на метиламидные. На примере этого аналога представляется интересным выяснить, какое влияние оказывает метилирование всех М Н-групп в валиноми-цине на пространственное строение депсипептидного остова и на основании структурных результатов объяснить отсутствие у него способности образовывать комплексы с ионами щелочных металлов flbj.
Координаты неводородных атомов исследуемого соединения и двух сокристаллизущихся молекул растворителя приведены в табл. 22. Координаты атомов в молекулах диоксана локализованы наименее точно, что не позволило однозначно локализовать атомы 0, поэтому всем атомам растворителя были приписаны рассеивающие способности атома С.
Упаковка молекул в кристаллической ячейке в проекции вдоль оси а показана на рис. 35. Молекулы в кристалле связаны друг с другом, а также с молекулами диоксана слабыми ван-дер-вааль-совыми связями: 25 межмолекулярных контактов характеризуются межатомными расстояниями 3,7 А.
Величина валентных связей и углов даны в табл. 23 и 24. Значения конформационных углов У , v , и X Даны в табл. 25. Внешний вид молекулы и стереоскопическое изображение показаны на рис. 36 и 37. Длины связей и валентных углов в найденной структуре имеют в основном те же значения, что и у других циклических депсипептидных соединений (см. fllj. и цитированные там работы). Величины углов вращения вокруг частично кратных связей указывают на то, что амидные и сложно-эфирные группы имеют в целом плоскую транс-конформацию (Д 0 II0).
Конформационные состояния остатков находятся вблизи минимумов, располагающихся на конформационных картах изолированных остатков. Отклонения от минимумов для метилированных остатков соизмеримы с отклонениями, наблюдающимися в кристаллических
Кристаллическая и молекулярная структура "ложного" валиномицина
Кристаллическая и молекулярная структура "ложного" валиномицина В настоящей главе представлены результаты рентгенострук-турных исследований синтетического аналога, так называемого "ложного" валиномицина, отличающегося от природного антибиотика формальной заменой всех амидннх групп на сложноэфирные и сложноэфирных на амидные. Это соединение принадлежит к группе аналогов, для синтеза которых был использован топохимический метод модификации биологически активных молекул, предусматривающий трансформацию исходной молекулы в целом /"I4J7-"Ложный" ваяйномицин не образует комплексов с hiа+ и К+ и не обладает антимикробной активностью Z"l6_7.
"Ложный" валиномицин исследовался спектральными методами в растворах / 16_7. Было найдено, что у этого аналога дестабилизирована по сравнению с валиномицином система внутримолекулярных водородных связей и не формируется "браслетная" структура. Этот факт объясняется тем обстоятельством, что при образовании р -изгибов последние включали бы в себя остатки с LL - и ХШ -конфигурацией, что термодинамически менее выгодно, чем в случае валиномицина, имеющего Lb - и &U -кон-фигу рации остатков в -изгибах fZIJ.
Координаты и тепловые параметры неводородных атомов "ложного" валиномицина и двух сокристаллизующихся молекул воды приведены в табл. 28,из которой видно, что атомы боковых групп имеют наибольшие тепловые колебания. Положения боковых групп оксикислотных остатков Ъ-Н$1 и #yt X1 характеризуются статистической неупорядоченностью и занимают ДЕЄ позиции (коэффициенты заполнения у обоих остатков составляют 0,8 и 0,2). Величины валентных связей и углов приведены в табл. 29 и 30. Геометрические параметры имеют в ОСНОЕНОМ нормальные значения, характерные для депсипептидных соединений /"IIJ. Средняя величина связи л/ (ОО-С составляет 1,44 1, что ниже обычной на 0,03 1. Исключение также составляют заниженные значения длин валентных связей боковой цепи у остатка D-Hyt (1,467А, 1,472 1, 1,435 Ї). Это, по-видимому, объясняется его статистической неупорядоченностью.