Введение к работе
Актуальность проблемы
В настоящее время основной задачей биологических экспериментов в космических полетах (КП) является изучение фундаментальных механизмов адаптации земных организмов к воздействию комплекса факторов (главным образом, невесомости и радиационного облучения) на клеточном, тканевом, органном уровнях. Наиболее выраженно на условия КП реагируют вестибулярный аппарат, нервная, эндокринная, сердечно-сосудистая и костно-мышечная системы (в кн. «Основы космической биологии и медицины» под ред. О.Г. Газенко, М. Кальвина, 1975; в кн. «Человек в космическом полете» под ред. В.В. Антипова, А.И. Григорьева, К. Лич Хантун, 1997; Smith S.M., Heer M. et al., 2015).
Костный мозг (КМ) представляет собой депо стволовых и прогениторных клеток мезенхимального происхождения, функционирование которых обеспечивает физиологический гемопоэз и гомеостаз костной ткани. От состояния этого компартмента в значительной мере зависит адаптация организма к неблагоприятному воздействию факторов КП и последующему возвращению к условиям нормальной гравитации.
В ходе предыдущих исследований в рамках программ «Бион» (1973-1997 гг.) после 7–22 суточных полетов крыс Wistar на биоспутниках «Космос», «Спэйслэб-3», «СЛС-1», «СЛС-2» обнаружено, что во время КП происходит угнетение эритропоэза в костном мозге и селезенке крыс, лимфопоэза при усилении гранулоцитарно-макрофагального ростка на фоне снижения числа костномозговых гемических прогениторов крыс (Швец В.Н. и др., 1977, 1984; Серова Л.В. и др., 1981, 1993; Vacek A. et al., 1982, 1990, 1991; Газенко О.Г., Ильин Е.А. и др., 1987; Udden M.M., Driscoll T.B. et al., 1995). В отличие от гемопоэтического дифферона данных о влиянии факторов КП на стромальные предшественники – мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (ММСК) пока немного. Было показано негативное влияние на негемопоэтические прогениторные клетки КМ, в том числе уменьшение числа костно-мозговых стромальных прогениторных клеток (КОЕ-ф) у крыс после полета (Wronski T.J. et al., 1983; Vacek A., Bueverova E.I. et al., 1990). Более поздние исследования на борту МКС показали, что в условиях КП угнетается дифференцировка ММСК, что сопровождается увеличением числа малодифференцированных предшественников. Молекулярно-генетические исследования выявили снижение экспрессии маркерных генов мезенхимальных клеток КМ (Blaber E.A., et al., 2013, 2014).
Возобновленная программа «Бион» позволила провести анализ влияния факторов длительного (до 30 суток) КП на физиологические системы организма млекопитающих (мышей), и оценить процессы восстановления в период реадаптации к земным условиям (Сычев В.Н., Ильин Е.А. и др., 2014). После КП установлены существенные патологические морфофункциональные изменения нервной, иммунной, костно-мышечной, сердечно-сосудистой, пищеварительной, эндокринной, кроветворной и дыхательной систем, прояснена динамика их восстановления (В кн. «Космический научный проект «Бион-М1»», под ред. А.И. Григорьева, 2016).
Исследования изменений потенциала ММСК и специфика их взаимодействия с гемопоэтическими предшественниками, локализованными в костном мозге, в условиях длительного КП и моделировании эффектов основных его факторов, особенно при их комбинированном действии, являются актуальными с точки зрения понимания физиологии регенеративных процессов иммунной системы, эритропоэза и сохранения стромального компонента в условиях длительного КП.
Цель работы: Изучение влияния факторов КП и моделирования их эффектов на основные морфофункциональные параметры прогениторных клеток костного мозга грызунов.
В соответствии с указанной целью были поставлены следующие задачи исследования:
-
Охарактеризовать функциональные и фенотипические особенности стромальных предшественников и гемопоэтических клеток костного мозга мышей после 30-суточного полета биоспутника «Бион-М1»;
-
Оценить морфофункциональное состояние стромальных предшественников и гемопоэтических клеток костного мозга крыс после 30-суточного антиортостатического вывешивания;
-
Оценить комбинированное действие факторов опорной разгрузки и ионизирующего излучения на нишу прогениторных клеток костного мозга крыс;
-
Охарактеризовать процессы реадаптации ниши прогениторных клеток костного мозга грызунов после длительного (30-суточного) КП и моделирования эффектов микрогравитации и космического облучения.
Научная новизна
Впервые в первичной культуре охарактеризована популяция клеток из КМ большеберцовой кости мышей линии C57Bl/6N после 30-суточного КП на борту биоспутника «Бион-М1» и 30-суточного отставленного наземного контрольного эксперимента. Анализ in vitro не выявил повреждения пула стромальных предшественников, в то же время были нарушены процессы гранулоцито- и эритропоэза. Установлено, что 7-суточного периода реадаптации недостаточно для полного восстановления гемопоэза.
Впервые исследована чувствительность клеток КМ бедренной кости крыс линии Wistar
после 30-суточного антиортостатического вывешивания и 6-кратного фракционированного -
облучения в суммарной дозе 3 Гр, а также последующего 2-недельного периода восстановления.
Для стромальных предшественников в условиях опорной разгрузки и облучения показано
изменение иммунофенотипа, способности к формированию колоний, остео- и
адипокоммитирования.
Впервые обнаружен интерферирующий эффект действия опорной разгрузки и
ионизирующего излучения на клетки ниши КМ крыс линии Wistar, проявляющийся в увеличении
радиочувствительности стромальных предшественников и ее снижении у гемопоэтических
предшественников.
Теоретическая и практическая значимость работы
Полученные результаты вносят значительный вклад в существующие представления о влиянии факторов КП на нишу прогениторных клеток КМ млекопитающих. Установлено, что длительный КП не вызывает необратимых негативных изменений морфологии и функциональной активности прогениторных клеток ниши КМ. При этом на 7 сутки реадаптации не происходит полного восстановления функциональной активности прогениторных клеток КМ после 30-суточного КП. Период реадаптации прогениторных клеток КМ разных дифферонов отличается по продолжительности, что позволяет предположить необходимость изучения нескольких этапов восстановления, начиная от 1 – 3 суток до 2 – 3 недель.
При моделировании факторов КП (микрогравитация и радиационное облучение) был
выявлен интерферирующий эффект действия этих факторов. Установлено, что в условиях опорной
разгрузки изменяется чувствительность прогениторных клеток КМ к действию
фракционированного - излучения.
Предложен и успешно апробирован метод комплексного анализа in vitro функциональной активности стволовых и прогениторных клеток из КМ млекопитающих после длительного КП и моделирования его эффектов, а также процессов реадаптации к нормальным условиям. Полученные результаты используются при подготовке курса лекций по космической биологии и медицине для студентов и аспирантов.
Положения, выносимые на защиту
-
После 30-суточного КП на биоспутнике «Бион-М1» происходит угнетение эритроидного и гранулоцитарного ростков гемопоэза на фоне функциональной сохранности пула мультипотентных стромальных стволовых клеток.
-
Период 7-дневной реадаптации не обеспечивает полного восстановления пула гемопоэтических клеток костного мозга мышей линии C57Bl/6N после длительного КП.
-
Выявлен интерферирующий эффект действия опорной разгрузки и -излучения на клетки ниши костного мозга крыс линии Wistar, выраженный в снижении радиорезистентности стромальных предшественников костного мозга повышении радиорезистентности гемопоэтических стволовых клеток. В течение 14-ти суток реадаптации происходит восстановление функциональной активности пула стромальных и гемопоэтических предшественников.
Апробация работы
Основные результаты и положения диссертации были представлены и обсуждены на V Всероссийской научно-практической конференции «Стволовые клетки и регенеративная медицина» (Москва, 2013), XXXVIII, XL, XLI Академических чтениях по космонавтике (Москва, 2014, 2016, 2017), XIII, XIV Конференциях молодых ученых, специалистов и студентов (Москва, 2014, 2015), 40th COSPAR Scientific Assembly (Russia, Moscow, 2014), XV Конференции по космической биологии и авиакосмической медицине с международным участием «Проект Бион-М1: результаты и перспективы экспериментов и исследований» (Москва, 2014), 36th, 38th Annual Meeting of the International Society for Gravitational Physiology (Slovenia, Ljubljana, 2015; Russia, Moscow, 2017), XVI Конференции по космической биологии и медицине с международным участием, школе молодых ученых (Москва, 2016), Конференции с международным участием «Клеточная биология: проблемы и перспективы» (Санкт-Петербург, 2017).
По теме диссертации опубликована 20 печатных работ, в том числе 5 статей в журналах из перечня ВАК РФ.
Результаты диссертационной работы были обсуждены и рекомендованы к защите на заседании секции Ученого совета Федерального государственного бюджетного учреждения науки Государственного научного центра Российской Федерации – Института медико-биологических проблем Российской академии наук «Космическая физиология и биология» (протокол № 4 от 14.09.2017).
Работа выполнена в рамках Госзадания ГНЦ РФ – ИМБП РАН по плану фундаментальных исследований ГНЦ РФ-ИМБП РАН и при частичной поддержке грантов НШ-371.2014.04 и НШ-7471.2016.4.
Структура и объем диссертации
Диссертация состоит из глав «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение», «Заключение», «Выводы» и «Список литературы». Текст диссертации изложен на 190 страницах, содержит 64 рисунка и 13 таблиц. Список литературы состоит из 376 цитируемых источников, из которых 68 – на русском и 308 – на иностранном языке.