Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 15
1.1 Структурные белки цитоскелета и межклеточных контактов: структура, функции и участие в механической рецепции 15
1.1.1 Актиновый цитоскелет эндотелиальных клеток 17
1.1.2 Микротрубочки эндотелиальных клеток 24
1.1.3 Кадгерин эндотелия сосудов 29
1.1.4 Механическое воздействие: возможные рецепторы и преобразователи сигнала.32
1.2 Механизмы воздействия фактора некроза опухоли альфа на проницаемость
эндотелиальных клеток 36
1.2.1 Воздействие фактора некроза опухоли альфа на микротрубочки 38
эндотелиальных клеток 38
1.2.2 Воздействие фактора некроза опухоли альфа на VE-кадгерин 41
эндотелиальных клеток 41
1.3 Микрогравитация как механическая стимуляция эндотелиальных клеток 42
1.4. Молекулы адгезии эндотелиальных клеток: участие в реакции воспаления и
механизмах гравитационной чувствительности 49
1.4.1 Роль молекул адгезии в рекрутировании лейкоцитов, строение, экспрессия и сайты связывания VCAM-1 49
1.4.2 Строение ICAM-1, экспрессия и кластеризация 54
1.4.3 Строение Е-селектина, экспрессия и кластеризация 1.5 Влияние микрогравитации на экспрессию молекул адгезии 59
1.6 Влияние микрогравитации на секрецию интерлейкинов 62
эндотелиальными клетками 62
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 68
2.1 Используемое оборудование, материалы и реактивы 68
2.1.1 Оборудование 68
2.1.2 Химические реагенты 69
2.1.3 Моноклональные антитела 70
2.2 Приготовление сред для культивирования эндотелиальных клеток 70
2.2.1 Приготовление полной среды 70
2.2.2 Приготовление среды для культивирования эндотелиальных клеток 70
2.2.3 Приготовление среды для криоконсервации клеток 70
2.3 Выделение и культивирование сосудистых эндотелиальных клеток
2.3.1 Получение первичной культуры эндотелиальных клеток пупочной вены человека 70
2.3.2 Пассирование первичной культуры эндотелиальных клеток 71
2.3.3 Криоконсервация культивируемых эндотелиальных клеток 72
2.4 Методы исследования 72
2.4.1 Структура исследования эффектов моделируемой микрогравитации. Параметры экспериментальной установки 72
2.4.2 Принцип метода проточной цитофлуориметрии для анализа антигенов и морфологических характеристик клеток 74
2.4.3 Оценка жизнеспособности культивируемых ЭК пупочной вены человека 75
2.4.4 Оценка иммунофенотипа культивируемых ЭК пупочной вены человека 75
2.4.5 Иммуноцитохимическое окрашивание клеток 76
2.4.6 Определение содержания цитокинов в среде культивирования 77
2.4.7 Анализ уровня экспрессии генов 79
2.5 Статистическая обработка результатов 80
Глава 3. Результаты исследования и их обсуждение 81
3.1. Влияние моделирования эффектов микрогравитации на морфологию и цитоскелет эндотелиальных клеток человека in vitro 81
3.1.1. Влияние моделирования эффектов микрогравитации на актиновый цитоскелет
3.1.2. Влияние моделирования эффектов микрогравитации 92
на систему микротрубочек 92
3.2. Жизнеспособность культивируемых эндотелиальных клеток в условиях моделируемой микрогравитации 98
3.3 Влияние моделируемой микрогравитации на экспрессию молекул клеточной адгезии эндотелиальных клеток 100
3.3.1. Профиль поверхностных маркеров эндотелиальных клеток 100
3.3.2. Влияние моделирования эффектов микрогравитации на экспрессию молекул клеточной адгезии 103
3.3.2. Влияние моделирования эффектов микрогравитации на экспрессию 115
VE-кадгерина адгезионных контактов эндотелиальных клеток 115
3.4. Влияние моделирования эффектов микрогравитации на секрецию цитокинов эндотелиальными клетками 122
Заключение 130
Выводы 132
Список литературы
- Актиновый цитоскелет эндотелиальных клеток
- Приготовление сред для культивирования эндотелиальных клеток
- Принцип метода проточной цитофлуориметрии для анализа антигенов и морфологических характеристик клеток
- Влияние моделирования эффектов микрогравитации на экспрессию молекул клеточной адгезии
Введение к работе
Актуальность проблемы
Хорошо известно, что микрогравитация, как один из основных факторов космического полета, приводит к дисрегуляции сердечно-сосудистой системы (Газенко, Григорьев, Егоров, 1990; Charles, Lathers, 1994; Богомолов, Самарин, 2007; Котовская, Фомина, 2010). Важным функциональным элементом, вовлекаемым в эти процессы, является эндотелий, изменения которого регистрируются после космических полетов и при проведении наземных модельных экспериментов (Григорьев, Котовская, Фомина, 2009; Moore, Thornton, 1987; Sofronova, Tarasova, Gaynullina et al., 2015).
Хорошей моделью для изучения структурно-функциональных и молекулярно-клеточных изменений при действии микрогравитации являются эндотелиальные клетки (ЭК), которые в условиях культивирования in vitro образуют монослой клеток, идентичный тому, что выстилает внутреннюю поверхность сосудов в живом организме. Эндотелиальный монослой является основным барьером между кровью и подлежащими тканями и функционирует как механически чувствительный интерфейс передачи сигнала (давление, растяжение, сокращение, воздействие напряжения сдвига (shear stress) жидкости (Michiels, 2003; Tzima, Irani-Tehrani, Kiosses et al., 2005). Исследования показали, что ЭК очень чувствительны к изменению гравитационного стимула, демонстрируя как ранние, так и отсроченные ответы (Sangha, Han, Purdy, 2001; Buravkova, Romanov, Rykova et al., 2005; Infanger, Ulbrich, Baatout et al., 2007). Было показано, что ранний ответ ЭК на длительное воздействие постоянно изменяющегося направления вектора гравитации проявлялся в ремоделировании актинового цитоскелета и усилении миграционной активности (Романов, Кабаева, Бурав кова 2001). Длительное экспонирование ЭК в условиях измененной гравитации увеличивало уровень белков внеклеточного матрикса, молекул клеточной адгезии и индуцировало высвобождение цитокинов (Grimm, Infanger, Westphal et al., 2009). Эти наблюдения подтвердили ранее выдвинутое предположение, что некоторые из мембранных белков, являются механическими сенсорами клетки. Возможными регуляторными сенсорами могут быть механочувствительные кальциевые каналы, сайты фокальной адгезии, цитоскелет, а также известные рецепторы факторов роста и цитокинов. Вторичные сигналы от сенсоров могут индуцировать различные внутриклеточные сигнальные каскады, в которых участвуют митоген-активируемые протеинкиназы (МАРК), такие как ERK, Р38 и JNK (Hughes-Fulford, 2002). Однако, не стоит забывать, что появление провоспалительных стимулов в корне меняет фенотип, функциональное состояние ЭК и вызывает активацию сигнальных каскадов, опосредуемых МАРК (Schiffrin, 1994). Точные молекулярные механизмы
гравичувствительности ЭК остаются не выясненными в силу наличия у них многоуровневой системы регуляции провоспалительной активности и механочувствительности. В связи с этим, изучение секреторных и адгезивных свойств интактного и активированного эндотелия в условиях моделирования эффектов микрогравитации in vitro (экспозиции на Random Positioning МасЫпе/ИРМУЗБ-клиностате) позволит приблизиться к пониманию процессов, происходящих в условиях реального космического полета.
Цель и задачи исследования
Целью данной работы являлось исследование влияния моделирования эффектов микрогравитации (3D клиностатирования) на архитектонику цитоскелета, синтез молекул адгезии, белков адгезионных межклеточных контактов и растворимых медиаторов воспаления в интактных и TNF-a-активированных эндотелиальных клетках пупочной вены человека.
В соответствии с указанной целью были поставлены следующие экспериментальные задачи:
-
Сравнить эффект провоспалительной активации, 3D клиностатирования и их совместного действия на жизнеспособность первичных эндотелиальных клеток из пупочной вены человека;
-
Исследовать воздействие 3D клиностатирования на организацию и экспрессию генов основных белков актинового и тубулинового цитоскелета ЭК, находящихся в различных функциональных состояниях (в норме и при провоспалительной активации);
-
Провести анализ экспрессии молекул клеточной адгезии (Е-селектин, РЕСАМ-1, ICAM-1, VCAM-1) и основного белка клеточных контактов (VE-кадгерин) на поверхности интактных и TNF-a-активированных ЭК в условиях моделирования эффектов микрогравитации;
-
Изучить влияние 3D клиностатирования на секреторную активность интактных и TNF-a-активированных ЭК;
-
Оценить уровень экспрессии генов основного белка адгезионных контактов, молекул клеточной адгезии и цитокинов ИЛ-6 и ИЛ-8 в условиях провоспалительной активации, экспозиции на RPM и их совместного действия.
Научная новизна
Впервые проанализировано влияние моделирования эффектов
микрогравитации, с помощью уникального устройства для рандомизации положения
объекта относительно вектора гравитации (RPM), на основные характеристики интактных и TNF-a-активированных первичных ЭК.
Впервые показаны различия в функциональной активности первичных культивируемых эндотелиальных клеток человека, характеризующие не только продукцию поверхностных маркеров, но и транскрипцию генов, ответственных за синтез данных маркеров в норме и при провоспалительной активации.
Впервые установлено, что моделирование эффектов микрогравитации вызывает реорганизацию актинового и тубулинового цитоскелета первичных ЭК уже после 1 часа воздействия, а 24-часовая экспозиция на RPM приводит к нарушению сборки микротрубочек и появлению двуядерных клеток в первичной культуре ЭК. Получены новые данные, свидетельствующие о сопутствующем ремоделированию актинового цитоскелета увеличении экспрессии гена АСТВ после 24-часов экспозиции на RPM.
Впервые выявлено потенцирование эффектов провоспалительной активации на транскрипцию генов ICAM1 и IL8 в условиях 3D клиностатирования, что в совокупности с увеличением экспрессии рецептора Е-селектина на поверхности ЭК, может способствовать увеличению адгезионных свойств этих клеток.
Теоретическая и практическая значимость работы
Результаты исследования подтверждают возможность использования эндотелиальных клеток человека в качестве адекватной экспериментальной модели для изучения механизмов гравичувствительности и трансдукции гравитационного стимула во внутриклеточные биохимические сигналы.
Обнаруженные в работе взаимосвязанные изменения архитектоники цитоскелета, экспрессии поверхностных маркеров, белка межклеточных контактов и секреции цитокинов подтверждают существование и значительно дополняют имеющиеся теоретические представления о гравитационно-зависимых внутриклеточных механизмах.
Продемонстрированные в работе функциональные различия между эндотелиальными клетками, полученными от разных доноров, позволяют предполагать необходимость более тщательного подхода к оценке результатов, с учетом индивидуальных особенностей первичных культур.
Полученные в работе результаты могут являться основанием для разработки проекта технического задания на проведение космического эксперимента в Российском сегменте МКС с целью дальнейшего изучения барьерных, адгезивных и секреторных свойств эндотелиальных клеток в условиях реальной микрогравитации.
Положения, выносимые на защиту
-
Реорганизация актиновых микрофиламентов в местах клеточных контактов и нарушение сборки микротрубочек наблюдается уже на ранних этапах культивирования ЭК на RPM (1 час) и сохраняется на протяжении 24 часов, приводя к трехкратному увеличению экспрессии гена АСТВ, а также нарушению пролиферации и накоплению двуядерных клеток.
-
Рандомизации положения культивируемых ЭК относительно вектора гравитации не является сильным воспалительным стимулом, так как не стимулирует транскрипцию генов и экспрессию кодируемых ими индуцибельных молекул Е-селектина и VCAM-1 на поверхности клеток, однако, достаточна для того, чтобы способствовать увеличению экспрессии ICAM-1 интактных и TNF-a-активированных ЭК.
-
3D клиностатирование не влияет на экспрессию генов и секрецию молекул ИЛ-6 и ИЛ-8 в интактных эндотелиальных клетках. Экспозиция на RPM не отменяет TNF-a-индуцированное увеличение экспрессии и секреции данных цитокинов, а в случае с ИЛ-8 даже потенцирует транскрипцию гена этого цитокина.
Апробация работы Основные результаты и положения диссертации доложены и обсуждены на: 10-й, 11-й Конференциях молодых ученых, специалистов и студентов, посвященных Дню космонавтики (Москва, 2011, 2012); 12-й Конференции молодых ученых, специалистов и студентов, посвященной 50-летию ГНЦ РФ - ИМБП РАН (Москва, 2013); 13-й Конференции молодых ученых, специалистов и студентов, посвященной 50-летию полета первого в мире врача-космонавта Егорова Б.Б. (Москва, 2014); 35-х и 37-х Академических чтениях по космонавтике, посвященных памяти академика С.П.Королева «Актуальные проблемы Российской космонавтики» (Москва, 2011, 2013); 14-ой Конференции по космической биологии и авиакосмической медицине с международным участием, посвященной 50-летию создания ИМБП (Москва, 2013); 22-ом Съезде физиологического общества им. И.П. Павлова (Волгоград, 2013); 12-й Объединенной конференции Европейского космического агентства и Международного общества гравитационной физиологии «Life in Space for Life on Earth» (Великобритания, Абердин, 2012); 40-й Научной ассамблее Международного комитета по исследованию космического пространства (COSPAR) «COSMOS» (Москва, 2014); 6-ом Международном конгрессе «Медицина в космосе и экстремальных условиях» (ICMS) (Германия, Берлин, 2014).
По теме диссертации опубликовано 14 печатных работ, в том числе 2 статьи в журналах из перечня ВАК РФ.
Работа выполнена при поддержке РФФИ (грант № 12-04-31763 мола) и гранта «Ведущие научные школы» НШ - 371.2014.4.
Диссертация апробирована на заседании секции Ученого совета ГНЦ РФ - ИМБП РАН "Космическая физиология и биология" 19 мая 2015 г.
Структура и объем диссертации
Диссертация состоит из глав: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение», «Заключение», «Выводы» и «Список литературы». Текст диссертации изложен на 166 страницах машинописного текста, сопровождается 24 рисунками и 5 таблицами. Список литературы содержит 464 источника, из них 37 на русском и 427 на иностранном языке.
Актиновый цитоскелет эндотелиальных клеток
Аминокислотная последовательность белка актина очень консервативна и сходна у эукариотических организмов разных таксономических групп. По-видимому, это связано с тем, что филаменты собираются из глобулярных субъединиц и это накладывает жесткие рамки на их изменчивость. Любое нарушение конформации субъединицы, вызванного изменением заряда при смене той или иной аминокислоты могут нарушить процесс полимеризации. Однако, все же существуют вариабельные участки, одним из которых является N-концевой сегмент молекулы актина, богатый отрицательно заряженными остатками аминокислот. На основании анализа этого сегмента выделяют 3 изотипа актина: а-, Р" и у-актин (Whalen, Butler-Browne, Gros 1976; Rubenstein, Spudich 1977). Оказалось, что изотипы актина экспрессируются в клетке в зависимости от ее функции и степени дифференцировки. Кроме того, изоактины локализованы в различных компартментах клетки и не могут замещать друг друга, так, например, немышечные клетки содержат в своей цитоплазме Р- и у-актин (Rubenstein, Spudich, 1977). В экспериментах, с использованием модели мигрирующего края ЭК и фибробластов, было показано, что локализация Р-актина ограничивалась раффлами и ламеллоподиями. При этом филаменты, меченные фаллоидином не окрашивались антителами к Р-актину, что говорит о наличии у-актина в них. Наличие Р-актина в переднем крае мигрирующих клеток сопровождалось увеличением уровня его мРНК, которая также локализовалась по периферии клетки (Hoock, Newcomb, Herman 1991; Herman 1993; Хайтлина 2007). Таким образом, в эндотелиальных клетках Р-актин локализуется в кортикальном слое в области подвижного переднего края и отвечает за локомоцию, в свою очередь, у-актин является основной составляющей стресс-фибрилл.
Ползающие движения клеток многоклеточных организмов являются результатом координированных и поляризованных изменений формы клеток, в основе которых лежит непрерывное ремоделирование актинового цитоскелета. Сигнальные пути которые ведут к ремоделированию связаны с Rho-семейством малых ГТФаз, которые по отдельности индуцируют ассоциацию актиновых филаментов в различные структуры, такие как ламеллиподии, филоподии, стресс-волокна и арки (дугообразные пучки актиновых филаментов) (Small 1988). Одной из основных функций актинового цитоскелета является обеспечение клеточной подвижности. Будь то нейросекреция, выпячивание ламеллоподии или любой другой клеточный процесс, зависящий от сборки актиновых филаментов, в конечном итоге необходимо понять, точную временную и пространственную координацию реорганизации F-актина. В настоящее время, ламеллоподиальное движение, кажется, наиболее понятным процессом (Svitkina, Borisy 1999). Предполагается, что следующие три функции могут эффективно интегрировать деятельность многочисленных актин-связывающих белков, необходимых для координированного движения клеток: (1) локализация белка, (2) сигнализация, которая модулирует несколько белков, и (3) лимитирующая стадия, которая изменяется при различных клеточных условиях. Молекулы, участвующие в сборке актиновых филаментов строго локализованы или пространственно сегрегированны в переднем крае клетки. Это позволяет актину проходить циклы сборки спереди и разборки в задней части ламеллоподии, что генерирует силу для ее вытягивания (Welch, Mallavarapu, Rosenblatt et. al 1997). Препараты, которые ингибируют полимеризацию актина, блокируют перемещение клетки вперед, так как оперенные концы филаментов, обращены к переднему краю, где преимущественно собирается актин (Schafer, Welch, Machesky et. al 1998).
Электронно-микроскопические исследования ламеллоподии кератиноцитов и фибробластов (Svitkina, Borisy, 1999) показали широко разветвленную сеть нитей актина (так называемые дендритные щетки) на переднем крае клетки. Как и при полимеризации актиновых мономеров, так и для сборки сети актиновых филаментов, была предложена treadmilling модель (Machesky, Way, 1998), включающая в себя следующие этапы: зарождение (нуклеация) на заостренном конце филамента, заблокированном кэп-белком; удлинение (элонгация) свободного оперенного конца на переднем крае; АТФ-гидролиз и высвобождение Pi; блокирование оперенного конца по мере удаления сети филаментов от переднего края; диссоциация кэп-белка с заостренного конца и его дезорганизация. Сборка актина происходит преимущественно на переднем крае, поскольку концентрация свободных оперенных концов высока в этом регионе и может быть ограничением скорости полимеризации. Свободные оперенные концы могут быть получены в ходе нуклеации de novo, разрезания существующих филаментов или диссоциации блокирующих оперенный конец белков. При дальнейшем выпячивании ламеллоподии необходимо поддержание пула мономеров актина на переднем крае клетки. Для этого в задней части ламеллоподии реализуются механизмы, способствующие быстрой деполимеризации и поставке G-актина, необходимого для сборки на переднем крае (Schafer, Cooper, 1995; Bamburg 1999). Для первоначального контакта, мигрирующие клетки также образуют филоподий, часто происходящие из ламеллоподий (Svitkina, Bulanova, Chaga et al., 2003), которые представляют собой пальцевидные выступы, состоящие из тонких пучков длинных актиновых филаментов, уложенных параллельно и ориентированных своими оперенными концами по направлению к переднему краю филоподий (Small 1988). Для описания процесса формирования филоподий из ламеллоподий была предложена следующая модель. Главную роль здесь играют Ena/VASP (вазодилататорно-стимулируемый фосфопротеин) белки, регулирующие полимеризацию актина и локализующиеся в верхних частях филоподий (Bear, Gertler, 2009). Эти белки связываются с оперенными концами филаментов, препятствуя их кэпированию и стимулируя элонгацию (Gupton, Gertler, 2007). Для формирования и поддержания структуры филоподий необходим белок фасцин, который связывает актиновые филаменты в пучки. Благодаря своей функции, фасцин считается ключевым маркером филоподий (Svitkina, Bulanova, Chaga et al., 2003; Adams 2004). Однако, существует и другой механизм формирования филоподий, при котором ламеллоподия не является строительной платформой. Важную роль здесь играют формины, которые участвуют в полимеризации актина, связываясь с оперенным концом актиновых филаментов (Evangelista, Zigmond, Boone, 2003). Гиперэкспрессия белков этого семейства индуцировала формирование филоподий во многих типах клеток. Не вполне ясная роль в формировании филоподий принадлежит миозинам. Гиперэкспрессия миозина индуцировала формирование филоподий, при этом миозин располагался в их верхней части (Berg, Cheney, 2002). Предположительно он служит для транспортировки других белков, таких как Ena/VASP и интегринов, в верхнюю часть филоподий.
В любой из этих моделей, на ранних стадиях формирования адгезионных контактов требуется обширная реорганизация цитоскелета, но специфическая архитектура актинового цитоскелета на этих этапах долгое время оставалась неясной. Лишь недавно проведенные исследования на культуре мигрирующих HUVEC показали, что после первичного контакта двух интердигитирующих ламеллоподий, у самой их кромки, образуются так называемые «мостики», внутри которых происходит слияние филоподиальных пучков актина соседних клеток (Hoelzle, Svitkina, 2012). Стоит отметить, что филаменты выходящие из каждой клетки, четко ориентированы оперенным концом по направлению друг к другу, в результате чего в центральной части «моста» находятся филаменты со смешенной полярностью (Hoelzle, Svitkina 2012). Кроме, характерного для филоподий расположения актиновых филаментов
Приготовление сред для культивирования эндотелиальных клеток
При достижении 80 - 90% монослоя в островках клеток первичной культуры или последующих субкультур их пересевали. Для этого из чашки Петри удаляли среду культивирования и промывали культуру ЭК средой ДМЕМ с низким содержанием глюкозы. Для снятия клеток с поверхности пластика в чашку Петри добавляли раствор трипсина-ЭДТА из расчета 500 мкл на 25 см . Клетки инкубировали с трипсином при 37С, периодически встряхивая чашку в горизонтальной плоскости для перемешивания раствора трипсина и контролируя отлипание клеток от поверхности пластика под микроскопом. После отлипания клеток трипсин инактивировали большим объемом полной среды, производили промывку чашки средой ДМЕМ, медленно ресуспендируя ее содержимое, и отбирали суспензию клеток в пробирку. Затем производили подсчет клеток в гемоцитометре. Аликвоту, содержащую необходимое количество клеток переносили в пробирку с необходимым объемом полной среды, суспензию осторожно ресуспендировали и переносили в культуральный флакон. Флакон перемещали в горизонтальной плоскости для распределения суспензии клеток по поверхности пластика, контролировали прикрепление клеток под микроскопом и помещали в инкубатор. Среду во флаконах с культивируемыми клетками меняли каждые 2 дня. Культивирование проводили при 37С в атмосфере 5% СОг. Плотность посадки клеток составляла 500 -1500 клеток/см .
Для замораживания ЭК промывали средой ДМЕМ с низким содержанием глюкозы, снимали с поверхности пластика раствором трипсина-ЭДТА, инактивировали трипсин полной средой, клетки ресуспендировали, переносили в пробирку, центрифугировали (5 минут, 1500 об/мин), супернатант сливали. Клетки (около 1 млн.) помещали в 1 мл среды для замораживания, осторожно ресуспендировали и переносили в пробирки для криоконсервации. Пробирки с суспензией клеток выдерживали при температуре - 20С в течение часа, затем хранили при - 80С. Длительное хранение клеток осуществляли в дьюарах с жидким азотом. При размораживании клеток криопробирки помещали на водяную баню, оттаивали в течение нескольких минут, среду для замораживания отбирали пипеткой, постепенно помещали в большой объем полной среды, центрифугировали (5 минут, 1500 об/мин), отбирали супернатант. Добавляли к клеточному осадку необходимый объем полной среды, осторожно ресуспендировали и помещали на чашку Петри.
Эксперименты проводили на ЭК 2-4 пассажей. При достижении около 80% монослоя культуры ЭК из флаконов удаляли среду для культивирования. После чего часть флаконов заполняли смесью из среды 199 содержащей только антибиотик и полную среду для культивирования клеток в соотношении 4:1. Вторая часть флаконов заполнялась смесью для провосполительной активации: среда 199, содержащая антибиотик и ФНО-а в концентрации 2 нг/мл и полная среда для культивирования клеток в соотношении 4:1. Для исключения механических повреждений клеток в процессе клиностатирования все флаконы заполнялись средой полностью, без образования пузырьков воздуха. Для экспериментов по оценке жизнеспособности, выявления поверхностных молекул адгезии и анализа экспрессии их генов, а также оценке секреторной активности ЭК культивировали в культуральных флаконах, с площадью поверхности 25 см . Для иммуногистохимического выявления белков цитоскелета и молекул клеточной адгезии ЭК культивировали в слайд-флаконах с площадью поверхности 9 см . Контрольные образцы помещались в СОг - инкубатор, соответствующие им опытные образцы подвергались моделированию эффектов микрогравитации в тех же температурных условиях. Моделирование микрогравитации осуществляли в течение 24 часов на Random Positioning Machine (RPM, Dutch Space, Leiden, Нидерланды) при скорости вращения 100 рад/мин для внешней рамки и 80 - для внутренней (Гершовнч, Гершович, Буравкова, 2009). В процессе работы RPM происходит рандомизация положения объекта относительно вектора гравитации за счет разнонаправленного вращения двух взаимно перпендикулярных рамок, к которым крепится платформа с экспериментальными образцами. Само направление вектора гравитации при этом не изменяется, имитируется только лишь эффект снижения влияния силы тяжести на культуру клеток до 10" g (Van Loon, 2007).
В состав экспериментальной установки для моделирования эффектов микрогравитации на культуру ЭК входили: прибор «Desktop RPM» и персональный компьютер (Pentium D 2.66 ГГц, 1024 Mb оперативной памяти, 320 Gb жесткий диск, видео-ускоритель ATI 9600 256 Mb) под управлением Windows ХР с установленным программным обеспечением «RPM Desktop Controller», поставляемым вместе с RPM. Прибор был установлен в термостат (Рис.) и подключен к программируемому контроллеру (DMC). Контроллер был подключен к блоку питания и соединен с персональным компьютером с помощью кабеля RS232. Управление параметрами симуляции микрогравитации осуществлялось через прилагаемое программное обеспечение. Экспериментальные культуральные флаконы крепились к платформе RPM с помощью резиновых жгутов.
После клиностатирования культуральную среду отбирали из 25 см флаконов, центрифугировали 5 минут при 1500 об/мин., полученный супернатант аликвотили по микропробиркам и хранили при -30С для последующего определения концентрации растворимых факторов. Монослой ЭК промывали и снимали 0,05% раствором трипсина -ЭДТА. Затем оценивали жизнеспособность, экспрессию молекул адгезии на поверхности клеток, образование АФК, разность потенциала на мембранах митохондрий с помощью проточного цитофлуориметра Beckman Coulter EPICS XL, а также экспрессию целевых генов с использованием метода ГЩР в реальном времени.
Устройство для рандомизации положения объекта относительно вектора силы тяжести -Random Positioning Machine 2.4.2 Принцип метода проточной цитофлуориметрии для анализа антигенов и морфологических характеристик клеток
Метод проточной цитофлуориметрии основан на пропускании суспензии клеток по капилляру по одной через зону чувствительности прибора. Скорость прохождения клеток через капилляр высокая (около 1000 клеток/ сек.), однако в зоне чувствительности прибора находится не более одной клетки. При этом клетки поочередно пересекают сфокусированный луч света, который используется для возбуждения флуоресценции. При помощи светочувствительных датчиков (фотодиодов и фотоэлектронных умножителей) регистрируются поглощение и рассеивание света (прямое светорассеяние под углом 0,5-2 и угловое светорассеяние под углом 90) клеткой, а также флуоресценция связанных с клеткой красителей. Собранная информация представляется в виде частотной гистограммы распределения, где по оси абсцисс располагается шкала интенсивности значения измеряемого параметра, по оси ординат располагается число клеток с данным значением измеряемого параметра. Если анализируется два параметра, совместные данные представляются в двумерной системе координат, где по обеим осям располагаются интенсивности значения измеряемых параметров.
При оценке распределения клеток по ряду морфологических характеристик используется детекция рассеянного света. Светорассеяние обусловлено размером, формой, плотностью клетки, а также гранулярностью внутриклеточных структур. Рассеянный свет от клеток и частиц состоит из дифракционных, рефракционных и отражающих компонентов. При малых углах рассеяния преобладает дифракция, и дифракционное изображение используется для измерения размера клеток. С возрастанием угла рассеяния увеличивается значение рефракции, рефракционное изображение используется для оценки внутриклеточной структуры клеток, поскольку рефракционные лучи проходят через внутренность клетки.
Принцип метода проточной цитофлуориметрии для анализа антигенов и морфологических характеристик клеток
Результаты, представленные в нашей работе, согласуются с ранее полученными данными коллектива нашей лаборатории (Romanov, Buravkova, Rikova et al., 2001; Buravkova, Romanov, Rykova et al., 2005) и зарубежных коллег (Grenon, Jeanne, Aguado-Zuniga et al., 2013) относительно экспрессии VCAM-1 на поверхности интактных ЭК в условиях моделируемой микрогравитации. Нами показано отсутствие изменений экспрессии данного рецептора в условиях ЗО-клиностатирования, как на уровне белка, так и на уровне гена. Важно отметить, что в отличие от исследования Grenon и соавт., контрольные образцы характеризовались крайне низкой долей CD 106 -клеток, что согласуется с общепринятой точкой зрения (Osborn, Hession, Tizard et al., 1989; Carlos, Schwartz, Kovach et al., 1990). В нашей работе не было выявлено изменения экспрессии
VCAM-1 на поверхности TNF-a-индуцированных ЭК в условиях моделируемой микрогравитации, что противоречит более ранним данным коллектива нашей лаборатории. Однако, проанализировав результаты экспрессии гена VCAM1, можно попытаться объяснить это противоречие. Мы показали, что ЭК могут отвечать на индукцию TNF-a разной степенью увеличения экспрессии VCAMJ, зависящей, по-видимому, от индивидуальных особенностей донора. В свою очередь, моделируемая микрогравитация потенцирует эффект провоспалительной индукции на «низкоэкспрессирующую» группу и, наоборот, снижает данный эффект у «высокоэкспрессирующей». В связи с этим, в работах Буравковой и соавторов могли быть использованы «высокоэкспрессирующие» ЭК, совместная TNF-a-индукция и клиностатирование которых приводило к снижению экспрессии гена и измеряемой экспрессии самого рецептора.
Сравнивать наши результаты с данными, полученными с использованием моделей in vivo (Zhang, Jia, Bao et al., 2008; Liu, Wang, Yue et al., 2014) весьма затруднительно, так как при использовании последних необходимо учитывать физиологию всего организма животного. В указанных работах, показано увеличение экспрессии VCAM-1 в мозговых и сонных артериях, тогда как целевой в модели антиортостатического вывешивания является бедренная артерия. В этой артерии изменений экспрессии VCAM-1 обнаружено не было. Что указывает на прямую зависимость экспрессии изучаемого рецептора от величины кровотока (Roer, Dillaman, 1985).
Таким образом, суммируя результаты приведенных работ можно сделать вывод, что моделируемая микрогравитация сама по себе не является воспалительным стимулом и не вызывает экспрессию индуцибельных молекул на поверхности ЭК.
Начиная анализ третьей молекулы клеточной адгезии, необходимо отметить, что ICAM-1 является весьма мобильным антигеном, так как уровень его экспрессии на клеточной поверхности повышается уже через 4 - 6 ч после провоспалительной индукции (Leeuwenberg, Smeets, Neefjes et al., 1992; Фрейдлин 2006). Кроме того, было показано, что экспрессия данного рецептора зависит от функционального статуса клеток на ранних и более поздних пассажах ММСК (Гершович, Гершович, Буравкова, 2009). Наряду с мобильностью экспрессии ICAM-1 было известно, что первичные культуры ЭК обладают выраженной морфологической гетерогенностью в зависимости от своего тканевого происхождения (Ribatti, Nico, Vacca et al., 2002). Однако, недавние исследования показали, что эндотелий, полученный от разных доноров, может различаться по функциональной активности, в частности, по уровню синтезируемых цитокинов (Склянкина, Болдырева, Щегловитова, 2011). В нашем исследовании удалось показать достоверное (р = 0,019) различие первичных ЭК, полученных от разных доноров и по уровню экспрессии ICAM-1 (рис. 16). Зная о том, что связывание ICAM-1 с лигандом вызывает активацию сигнального пути, опопсредующего активацию тирозинкиназы p60Src с последующим фосфорилированием ассоциированных с актиновым цитоскелетом белков: кортактином (Durieurautmann, Chaverot, Cazaubon et al., 1994), киназы фокальной адгезии и паксиллином (Etienne-Manneville, Manneville, Adamson et al., 2000), можно предположить, что ответы ЭК от разных доноров на механические стимулы будут различны. Интересно отметить, что увеличение уровня внутриклеточного кальция характерно не только для связывания Е-селектина и VCAM-1 (Cuvelier, Paul, Shariat et al., 2005), но и для молекулы ICAM-1 (Etienne-Manneville, Manneville, Adamson et al., 2000), что говорит об общности пути внутриклеточного каскада, запускаемого этими молекулами.
Единой точки зрения на то, каким образом микрогравитация влияет на экспрессию ICAM-1, как и для молекул, описанных выше, не существует. Целый ряд работ с использованием in vitro моделей, поддерживает мнение об увеличении экспрессии ICAM-1 на поверхности ЭК в условиях микрогравитации (Romanov, Buravkova, Rikova et al., 2001; Buravkova, Romanov, Rykova et al., 2005; Muid, Froemming, Manaf et al., 2010). Наши данные частично подтверждают эти результаты. Нами было показано, что 24-часовая экспозиция на RPM вызывает увеличение экспрессии гена и белка ICAM-1 на поверхности ЭК 2-ой группы (рис. 17 а, 18). Стоит напомнить, что именно эта группа клеток имела низкий базальный уровень экспрессии данного рецептора в нормальных физиологических условиях (Dustin, Springer, 1988). Тогда, как ЭК с изначально высоким базальным уровнем экспрессии отреагировали на ЗО-клиностатирование иначе. В 1-ой группе ЭК, моделируемая микрогравитация снижала экспрессию гена и белка ICAM-1 (рис. 17 а, 18). В связи с этим, можно предположить, что предактивированные ЭК отвечают на микрогравитацию снижением экспрессии данного рецептора. Эти результаты косвенно подтверждают данные Grenon и соавторов, в которых контрольные значения доли CD54 -клеток в среднем составляли 80% от всей популяции после 24 ч культивирования (Grenon, Jeanne, Aguado-Zuniga et al., 2013). Так как в нашей работе за то же время культивирования в контрольных образцах 1 -ой группы насчитывалось примерно 60% CD54 -клеток, то можно предположить, что Grenon и соавторы использовали предактивированные ЭК.
Полученные в нашей работе данные относительно совместного действия моделируемой микрогравитации и активации TNF-a на экспрессию ICAM-1 ЭК, подтвердили более ранние результаты Буравковой и соавт. (Romanov, Buravkova, Rikova et al., 2001; Buravkova, Romanov, Rykova et al., 2005). Результаты анализа экспрессии гена ICAM1 и интенсивности флуоресценции этого рецептора полностью совпали. Оказалось, что моделируемая микрогравитация потенцирует эффект провоспалительной активации, вызывая увеличение анализируемых параметров в ЭК, имеющих изначально низкий уровень базальной экспрессии ICAM-1. В то же время, ЗО-клиностатирование TNF-a-активированных клеток 1-ой группы, оставляет анализируемые параметры без изменений относительно TNF-a-активированных клеток той же группы, находящихся в статических условиях.
Кроме исследований, проведенных на культивируемых ЭК, есть работы, в которых изучение экспрессии ICAM-1 в условиях микрогравитации проводилось in vivo. Так, 7-дневное ортостатическое вывешивание увеличивало экспрессию этой молекулы на поверхности ЭК, выстилающих сонную артерию и грудную аорту (Jung, Chung, Lee et al., 2005). Противоположные результаты были получены при исследовании сыворотки крови 22 космонавтов после 10-дневного космического полета (Mills, Perez, Adler et al., 2002). Уровень sICAM после космического полета снижался по сравнению с предполетными образцами сыворотки.
Таким образом, суммируя результаты представленных работ, следует отметить, что на клеточном уровне микрогравитация способствует увеличению экспрессии ICAM-1 интактных и TNF-a-активированных ЭК. Для остальных молекул клеточной адгезии VCAM-1 и Е-селектина подобные выводы сделать, пока, не удается.
Влияние моделирования эффектов микрогравитации на экспрессию молекул клеточной адгезии
Таким образом, мы показали, что моделируемая микрогравитация не влияет на экспрессию генов и секрецию молекул JL-6 и IL-8 в интактных эндотелиальных клетках. Кроме того, экспозиция на RPM не отменяет TNF-a-инуцированное увеличение экспрессии и секреции данных цитокинов, а в случае с IL-8 даже потенцирует транскрипцию гена этого цитокина.
Уровень продукции JL-6 и IL-8, выявленный в среде культивирования эндотелиальных клеток в нашей работе, сравним с уровнем данных цитокинов, описанных в работе Склянкиной и соавторов (Склянкина, Болдырева, Щегловитова, 2011), также установивших различие в функциональной активности ЭК в зависимости от доноров. В своей работе коллектив авторов не объясняет причину описанных различий. Анализ представленного в нашей работе цитокинового профиля, а также экспрессии молекул адгезии и строению актинового цитоскелета, позволяет предположить, что ЭК 1-ой группы находятся в предактивированном состоянии и/или в состоянии повышенной реактивности. Кроме того, исходное функциональное состояние ЭК и уровень секреции цитокинов IL-6, IL-8 находятся в обратной зависимости: чем ниже исходный уровень секреции цитокина, тем больше его увеличение в ответ на провоспалительную активацию, и наоборот. Однако, на уровне транскрипции генов такой четкой зависимости обнаружить не удалось, что вполне можно объяснить наличием посттрансляционных изменений.
Из литературных данных известно, что JL-6 представляет собой цитокин с плейотропным действием, который участвует в острой и хронической фазе реакции воспаления (Barton 1997). Ранее было показано участие JL-6 в патогенезе поздней фазы аллергических реакций, васкулитов и атерогенеза (Vanden, Berghe, Vermeulen, De Wilde et al., 2000). Наряду с основными источниками этого цитокина: макрофагами и Т-лимфоцитами, транскрипты этого цитокина обнаруживались и в нестимулированных ЭК коронарных артерий. Как отмечалось в более раннем исследовании, провоспалительная активация ЭК TNF-a приводит не только к активации транскрипции гена IL-6, но к его трансляции и секреции (Фрейдлин 2006). Связывание мембранного рецептора с молекулой TNF-a инициирует активацию фактора транскрипции NF-в И нескольких МАР-кенафных путей (р38, ERK и c-Jun N-терминальной киназы) (Heyninck, De Valck, Vanden Berghe et al., 1999), что в конечном итоге способствует активации транскрипции промотора гена IL-6 (Beyaert, Cuenda, Vanden Berghe et al., 1996). Помимо иммунной функции IL-6 является стимулятором пролиферативной активности ЭК, являясь для них аутокринным фактором роста, что способствует прогрессированию сосудистых опухолей (Giraudo, Arese, Toniatti et al., 1996). Кроме того, продукция JL-6 индуцирует экспрессию эндотелиального фактора роста сосудов (VEGF) - мощного ангиогенного агента (Cohen, Nahari, Cerem et al., 1996).
IL-8 также продуцируется ЭК в ответ на воспалительные агенты и является аутокринным фактором роста, который регулирует пролиферацию, жизнеспособность, миграцию и синтез матриксных металлопротеиназ (ММР) в эндотелиальных клетках, что, предположительно, приводит к деградации внеклеточного матрикса, миграции эндотелиальных клеток и образованию сети капилляров in vitro, а также ангиогенезу кровеносных сосудов in vivo (Koch, Polverini, Kunkel et al., 1992; Li, Varney, Valasek et al., 2005). Аутокринное действие данного цитокина обеспечивается благодаря конститутивной экспрессии CXCR1 и CXCR2 на поверхности ЭК (Li, Dubey, Varney et al., 2003). Кроме того, IL-8 играет важную роль в процессах адгезии и трансмиграции лейкоцитов, путем изменения конформации интегринов CD 11 a/CD 18 (Meager 1999; Фрейдлин2001).
Сравнивая полученные нами результаты содержания двух провоспалительных хемокинов (IL-6 и IL-8) в среде культивирования первичных ЭК, с данными, полученными другими исследователями необходимо отметить, что большинство работ указывает на отсутствие провоспалительных эффектов при кратковременном моделировании эффектов микрогравитации (Carlsson, Bertilaccio, Ballabio et al., 2003; Mariotti, Maier, 2008; Griffoni, Di Molfetta, Fantozzi et al., 2011). Так, в ЭК, культивируемых в течение 96 ч в условиях биореактора с вращающимися стенками (Rotating Wall Vessel, RWV), наблюдалось ингибирование синтеза IL-la (Carlsson, Bertilaccio, Ballabio et al., 2003). Авторы объяснили данный эффект увеличением уровня белка теплового шока hsp70, который способен ингибировать экспрессию IL-la (Yokoo, Kitamura, 1997). В нашей работе скрининг цитокинов не выявил изменения уровня секреции этого цитокина в ответ на моделируемую микрогравитацию, потому как его содержание в кондиционированной среде было крайне низким. В другой работе, экспозиция ЭК на RPM в течение 96 ч вызывала снижение не только секреции IL-la, но и IL-8 (Griffoni, Di Molfetta, Fantozzi et al., 2011). Стоит отметить, что концентрация IL-8 в контрольных образцах была порядка 8000 пг/мл. Подобные значения в нашей работе наблюдались только после активации TNF-a, что говорит о возможном использовании предактивированных ЭК в работе Griffoni и соавторов. А отмечаемое авторами небольшое снижение уровня секреции IL-8, может объясняться временной динамикой его секреции, максимум которой приходится на 24 часа культивирования (Склянкина, Болдырева, Щегловитова, 2011).
С другой стороны существует ряд работ, результаты которых говорят о снижении секреции антивоспалительных цитокинов ЭК в условиях микрогравитации. Infanger и сотрудники обнаружили сниженную секрецию провоспалительного цитокина IL-10 в EA.hy926 в условиях экспозиции на RPM, и предположили, что клетки были в состоянии повышенной реактивности (Infanger, Ulbrich, Baatout et al., 2007). Однако, уровни измеряемых цитокинов находились на нижнем пределе чувствительности метода. Подобные выводы, были сделаны также Ulbrich и соавторами (Ulbrich, Westphal, Baatout et al., 2008), обнаружившими повышенную секрецию провоспалительных JL-6 и IL-8 после культивирования клеток EA.hy926 в течение 24 ч на RPM. Известно, что EA.hy926 конститутивно экспрессируют большое количество дополнительных генов, многие из которых связаны с контролем клеточного цикла и апоптоза. В связи с чем, предлагается тщательно проверять экспрессию генов, которым посвящено то или иное исследование, при использовании EA.hy926 (Boerma, Burton, Wang et al., 2006). Для правильной интерпретации результатов, необходимо учитывать особенности изучаемых культур, особенности оборудования, используемого для моделирования микрогравитации и методов детекции, исследуемых параметров.
Полученные нами данные не только подтвердили гипотезу Griffoni и соавторов (Griffoni, Di Molfetta, Fantozzi et al., 2011) о том, что микрогравитация сама по себе не является провоспалительным стимулом для ЭК, и, по крайней мере, не повышает секрецию цитокинов в этих клетках, но при этом и не отменяет TNF-a-индуцированное увеличение секреции этих цитокинов. Однако, моделируемая микрогравитация на фоне провоспалительной активации может способствовать увеличению адгезии и трансмиграции лейкоцитов, тем самым модулируя клеточный иммунитет.
Таким образом, наши результаты показали, что моделируемая микрогравитация не увеличивает секрецию и экспрессию гена JL-6 и не нарушает, тем самым, регуляцию острой фазы воспаления. Показанный нами уровень секреции IL-8 в среде культивирования первичной культуры эндотелиальных клеток, после 24 часовой экспозиции на RPM сохранялся как в 1-ой группе, так и во 2-ой. Однако, необходимо отметить, что моделируемая микрогравитация потенцировала TNF-a-индуцированную экспрессию гена IL-8. В совокупности с полученными ранее данными об увеличении экспрессии молекулы ICAM-1 в этих условиях, можно предположить микрогравитация на фоне воспалительной реакции может приводить к усиленной инфильтрации лейкоцитами подлежащих тканей.