Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы 14
2.1. Понятие здоровье и проблема нормы в космической медицине 14
2.2. Изучение белковой композиции плазмы крови здорового человека при воздействии факторов космического полета 15
2.2.1. Изменения белков сыворотки и плазмы крови после космических полетов разной продолжительности 19
2 2 2 Изменения белков сыворотки и плазмы в экспериментах по моделированию факторов космического полета 25
2 2 2 1 Изменения белков сыворотки и плазмы крови в условиях антиортостатической гипокинезии 26
2 2 2 2 Изменения белков сыворотки и плазмы крови в условиях«сухой» иммерсии 29
2.2.2.3. Изменения белков сыворотки и плазмы крови в условиях длительной изоляции в гермообъеме 30
2.3. Протеомные методы исследования 36
2.3.1. Прямое масс-спектрометрическое профилирование 37
2.3.1.1. Технология белковых чипов SELDI-TOF 37
2.3.1.2. Технология префракционирования образцов на магнитных частицах перед MALDI-TOF масс-спектрометрией 39
2.3.1.3. Использование микрохроматографических насадок ZipTip перед прямым масс-спектрометрическим профилированием 41
2.3.1.4. Воспроизводимость технологий прямого профилирования 41
2.3.1.5. Сыворотка крови как объект для прямого протеомного профилирования 43
2.3.1.6. Идентифицированные белки масс-спектрометрических профилей сыворотки и плазмы крови 45
2.4. Пластичность протеомного профиля сыворотки крови здорового человека 50
2.5. Преимущества и недостатки прямого масс-спектрометрического профилирования 53
2.6. Возможность использования метода прямого масс-спектрометрического профилирования в оценке адаптации организма к экстремальным факторам среды 54
3. Материалы и методы исследования 57
3.1. Материалы исследования 57
3.2. Объекты исследования 57
3.3. Циклограмма получения образцов крови и описание экспериментов по моделированию факторов космического полета 59
3.3.1. Длительные космические полеты 59
3.3.2. 1-суточная антиортостатическая гипокинезия (-15) суточная «сухая» иммерсия 59
3.3.4. 105-суточная изоляция в гермообъеме 60
3.3.5. 9-суточная изоляция в условиях гипербарической кислородно-азотно-аргоновой среды 61
3.3.6 Исследование групповой вариабельности протеомного профиля сыворотки крови 61
3.3.7. Исследование индивидуальной вариабельности протеомного профиля сыворотки крови 61
3.4. Методы исследования 63
3.4.1. Получение проб сыворотки крови 63
3.4.2. Получение проб плазмы крови 63
3.4.3. Предобработка образцов сыворотки с использованием магнитных частиц ClinProt MB IMAC Си («Bruker Daltonics») 63
3.4.4. Предобработка образцов сыворотки с использованием магнитных частиц ClinProt MB WCX («Bruker Daltonics») 64
3.4.5. Предобработка образцов сыворотки с использованием магнитных частиц ClinProt MB WAX («Bruker Daltonics») 64
3.4.6. Префракционирование образцов сыворотки с использованием микронаконечников ZipTip С-18 65
3.4.7. Масс-спектрометрические измерения 65
3.4.8. Анализ масс-спектров 66
3.4.9. Контроль качества масс-спектров 66
3.4.10. Статистический анализ 66
3.4.11. Тандемная масс-спектрометрия и идентификация отличающихся пиков 67
4. Результаты и обсуждение 69
4.1. Оптимизация метода профилирования сыворотки крови здорового человека 69
4.1.1. Выбор объекта для прямого профилирования 69
4.1.2. Выбор воспроизводимой технологии для прямого протеомного профилирования сыворотки 72
4.2. Характеристика вариабельности низкомолекулярного субпротеома сыворотки крови здорового человека в привычных условиях жизнедеятельности 83
4.2.1. Групповая вариабельность протеомного профиля сыворотки крови 83
4.2.2 Индивидуальная вариабельность протеомного профиля сыворотки крови 89
4.3. Характеристика протеомного профиля сыворотки крови при воздействии факторов космического полета 100
4.3.1. Изменения протеомного профиля после длительных космических полетов (169-199 суток) 100
4.3.2. Изменения протеомного профиля сыворотки крови в эксперименте с 24-часовой антиортостатической гипокинезией (-15) 106
4.3.3. Изменения протеомного профиля сыворотки крови в эксперименте с 7-суточной «сухой» иммерсией 112
4.3.4. Изменения протеомного профиля сыворотки крови в эксперименте со 105-суточной изоляцией в гермообъеме 116
4.4. Изменения протеомного профиля сыворотки крови в условиях гипербарической кислородно-азотно-аргоновой среды (13,53%, 28,26%, 58,21%) 123
5. Заключение 130
6. Выводы 134
7. Практические рекомендации 135
8. Список литературы 136
- Изучение белковой композиции плазмы крови здорового человека при воздействии факторов космического полета
- Изменения белков сыворотки и плазмы крови в условиях длительной изоляции в гермообъеме
- Циклограмма получения образцов крови и описание экспериментов по моделированию факторов космического полета
- Характеристика вариабельности низкомолекулярного субпротеома сыворотки крови здорового человека в привычных условиях жизнедеятельности
Введение к работе
Актуальность работы.
В настоящее время протеомика активно развивается во многих странах мира и занимает ведущие позиции в научных программах современной прикладной и фундаментальной биологии, а также фармацевтики и смежных с ней дисциплин. С развитием протеомики связывают большие надежды по внедрению новых подходов в диагностике различных заболеваний и создании новых лекарственных соединений [Говорун В.М., Арчаков А.И., 2002]. Однако, несмотря на ведущиеся во всем мире исследования по направленному поиску биомаркеров различных патологических состояний, систематическое изучение протеома здорового человека только начинается. Отдельные попытки охарактеризовать вариабельность белков печени [Zhang X. et al., 2006], панкреатического сока [Chen R. et al., 2005] и плазмы крови [Nelsestuen G.L. et al., 2005], предпринятые в недавних исследованиях, не дают представления о групповой вариабельности белков в большой выборке обследуемых и об изменениях белковой композиции за длительный период времени. Кроме того, большой интерес представляет характеристика вариабельности белковой композиции у специально отобранной группы здоровых людей для определения интервала физиологической нормы различных белков внутри человеческой популяции.
Очевидно, что протеом здорового человека в состоянии сохранения организмом его функциональных резервов чрезвычайно пластичен. Помимо значительных различий протеомного профиля у разных индивидуумов и естественных колебаний индивидуального протеома во времени, существуют вариации количественного содержания и качественного состава белков, связанные с адаптивным ответом на изменение внешних условий. Так, на протеом сыворотки крови могут оказать влияние различные факторы: питание (содержание в пище жиров и белков), курение, занятия спортом, длительный постельный режим [Anderson N.L. and Anderson N.G., 2002] и циркадианные ритмы [Linkowski P. et al., 1998].
При выполнении космических полетов, а также при участии в модельных экспериментах, имитирующих отдельные стороны космической экспедиции, человек сталкивается с непривычными для него условиями. Изменения, происходящие в организме, затрагивают все системы органов, в том числе модифицируется и белковый состав крови. С помощью различных биохимических методов (например, радиоиммуннологического анализа, иммунодиффузии, электрофореза в ацетатцеллюлозном геле) были проанализированы изменения многих гормонов белковой природы (инсулина, соматотропина, ренина и других) [Ларина И.М. 2000; 2003; Григорьев А.И. с соавт., 1999], компонентов иммунной системы (иммуноглобулинов, факторов комплемента) [Гусева Е.В., Ташпулатов Р.Ю, 1979, 1980: Герцик Ю.Г., 2004], белков системы свертывания крови [Фомин, А.Н., 1981] и «острой» фазы [Ларина О.Н., 1992; 2006], ферментов [Маркин А.А., 2001], в т.ч. протеолитических [Тигранян с соавт., 1987]. Протеомные методы для анализа изменений белков в космических полетах и наземных экспериментах ранее не использовались.
Сыворотка крови человека является удобным объектом для исследований, поскольку содержит белки практически всех тканей организма, и изучение ее протеомного состава может дать достаточно полную информацию о физиологическом состоянии организма. Однако присутствие в ней солей и высококопийных белков, среди которых содержание альбумина и глобулинов составляет более 90%, и большой динамический диапазон концентраций белков (10-11 порядков) [Anderson N.L. et al., 2004] значительно затрудняет анализ белковой композиции при использовании одного конкретного методического подхода. Поэтому для комплексной оценки протеома сыворотки необходимо сочетание различных технологических платформ (как разделения сложных белковых смесей, так и детектирования белков). Технология прямого протеомного масс-спектрометрического профилирования сочетает предварительное фракционирование образцов сыворотки на магнитных частицах или других носителях, которые связывают белки с определенными свойствами, и масс-спектрометрический анализ смеси пептидов и белков, ионизированных с помощью матрицы. Данная технология является высокопроизводительной, позволяет анализировать одновременно несколько десятков пептидов, белков (до 17000 Да) и белковых фрагментов, составляющих так называемый низкомолекулярный субпротеом, а также посттрансляционные модификации (PTMs) белков. Оценка изменений многих компонентов низкомолекулярного субпротеома и PTMs белков в космических полетах и наземных экспериментах ранее не проводилась. Таким образом, использование протеомных подходов дает возможность уточнить и дополнить картину изменений композиции белков сыворотки при воздействии факторов космического полета, что приведет к пониманию молекулярных механизмов сохранения гомеостаза в экстремальных условиях среды и позволит в будущем разработать принципиально новые средства профилактики неблагоприятных последствий действия микрогравитации. Характеристика состояния здоровья человека в гипоксической аргоносодержащей среде представляет интерес в плане ее возможного использования в замкнутых объектах различного назначения (возможно, и на космической станции) для обеспечения пожаробезопасности.
Цель работы: характеристика протеомного профиля сыворотки крови здорового человека при воздействии на организм факторов космического полета и в условиях гипербарической кислородно-азотно-аргоновой среды.
Задачи исследования:
1) выбор наиболее воспроизводимого метода прямого протеомного профилирования сыворотки крови;
2) изучение групповой и индивидуальной вариабельности протеома сыворотки крови здорового человека;
3) оценка изменений протеомного профиля сыворотки после длительных космических полетов и при воздействии условий модельных экспериментов (антиортостатической гипокинезии, «сухой» иммерсии, изоляции в гермообъеме);
4) характеристика изменений белковой композиции сыворотки крови в условиях гипербарической кислородно-азотно-аргоновой среды.
Научная новизна работы
Впервые была проанализирована индивидуальная и групповая вариабельность низкомолекулярного субпротеома сыворотки крови здорового человека за длительный период времени (до 12 месяцев). Были выявлены наиболее пластичные и стабильные компоненты протеомного профиля. Охарактеризованы изменения белковой композиции сыворотки крови, включая пептиды, полноразмерные белки и их изоформы, фрагменты и метаболиты после длительных космических полетов и в ходе различных наземных экспериментов (1-суточная антиортостатическая гипокинезия, 7-суточная «сухая» иммерсия, 105-суточная изоляция в гермообъеме, 9-суточная изоляция в гипербарической кислородно-азотно-аргоновой среде) с помощью технологии прямого масс-спектрометрического профилирования.
Теоретическая и практическая значимость работы
В ходе данной работы были обнаружены белковые компоненты, характеризующиеся высокой индивидуальной и групповой вариабельностью внутри группы здоровых лиц, что ограничивает использование данных белков как потенциальных биомаркеров различных дизрегуляторных состояний и дисфункций в физиологии, а также патогенетических маркеров в клинической протеомике. Белки и пептиды, обладающие незначительной дисперсией в группе здоровых лиц, напротив, могут представить важную информацию о состоянии здоровья при резком изменении их уровня.
Положения диссертации, выносимые на защиту
-
Технологическая платформа, включающая прямое масс-спектрометрическое профилирование после префракционирования сыворотки крови на магнитных частицах MB WCX является информативным и воспроизводимым методом анализа ее белковой композиции;
-
Низкомолекулярный субпротеом сыворотки крови здоровых лиц в условиях обычной жизнедеятельности характеризуется значительной групповой и индивидуальной вариабельностью;
-
Длительные космические экспедиции и эксперименты с моделированием воздействия факторов космического полета вызывают функциональную перестройку белковой композиции сыворотки крови, проявляющуюся в изменении пиков белков «острой фазы» и липидного обмена, а также протеолитических ферментов.
-
9-суточная изоляция в условиях гипербарической кислородно-азотно-аргоновой среды приводит к уменьшению площадей пиков большинства изученных пептидов, белков и белковых фрагментов, что связано с нарушением их синтеза вследствие развития обратимой дисфункции печени в условиях гипоксии и повышенного давления.
Апробация работы
Основные положения работы были представлены на следующих конференциях: VII, VIII, IX конференциях молодых ученых специалистов и студентов, посвященных Дню космонавтики (Москва, 9 апреля, 2008 г., 14 апреля, 2009 г., 14 апреля, 2010 г.); 17-ом международном симпозиуме «Человек в космосе» (Москва, 7-11 июня, 2009 г.); 30-ом и 31-ом международных симпозиумах по гравитационной физиологии (Сиань, Китай, 24-29 мая, 2009 г., Триест, Италия, 13-18 июня, 2010 г.); IV Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Казань, 23-27 июня, 2009 г.); 3-ей протеомной конференции стран Центральной и Восточной Европы (Будапешт, Венгрия, 6-9 октября, 2009 г.); итоговой конференции по результатам выполнения мероприятий за 2009 год в рамках приоритетного направления «Живые системы» ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы» (Москва, 25-27 ноября 2009 г.); Российско-французско-белорусской конференции «Нейрососудистые изменения, вызванные воздействием условий внешней среды: молекулярно-клеточные и функциональные подходы» (Анже, Франция, 10-12 марта 2010 г.).
Список публикаций по материалам диссертации
По теме диссертации опубликовано 14 печатных работ, в том числе 4 статьи в журналах из перечня Высшей аттестационной комиссии Российской Федерации.
Работа выполнена в лаборатории «Метаболизм и иммунитет» ГНЦ РФ – ИМБП РАН в рамках ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы», при поддержке программы ОБН РАН, грантов Президента РФ «Ведущие научные школы» № НШ-3402.2008.4 и РФФИ № 08-04-01533-а.
Структура и объём диссертации. Диссертация изложена на 154 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследований с обсуждением, заключения, выводов и списка литературы. В диссертации приведены 17 таблиц и 28 рисунков. Список использованной литературы содержит 93 отечественных и 161 зарубежных источника.
Изучение белковой композиции плазмы крови здорового человека при воздействии факторов космического полета
Гомеостаз как система поддержания постоянства параметров внутренней среды организма для обеспечения его независимости от различных отклонений в условиях жизнедеятельности играет важнейшую роль в адаптации организма, являющейся результатом активной работы множества регуляторных систем. Приспособление к изменяющимся факторам внешней среды тесно связано с перестройкой ряда показателей гомеостаза под «руководством» соответствующих нейроэндокринных механизмов. Наличие высоких адаптационных возможностей, обеспечивающих устойчивость основных физиологических функций организма в изменяющихся условиях, обычно отождествляется со здоровьем (Григорьев А.И., Баевский P.M., 2007). Переход от здоровья к болезни связан со снижением адаптационных возможностей живой системы, с уменьшением способности адекватно реагировать даже на обычные повседневные нагрузки. При этом на границе между здоровьем и болезнью имеется целый ряд переходных состояний, получивших название донозологических. Донозологические состояния - это такие функциональные состояния организма, когда его адаптационные возможности сохраняются на уровне, адекватном условиям окружающей среды только благодаря определенному напряжению регуляторных систем.
Геофизические условия жизни на Земле характеризуются наличием и составом атмосферы, присутствием магнитосферы и гравитационного поля величиной 1 g, которое оказывает постоянное воздействие на живые организмы. За миллионы лет эволюционного развития живые организмы в совершенстве адаптировались к условиям жизни на Земле, причем человек (как биологический вид) смог занять все экологические ниши, кроме глубин океана, что свидетельствует о чрезвычайной адаптационной пластичности его организма. Естественно ожидать, что при освоении космического пространства, связанном со сменой привычных условий жизнедеятельности, в функционировании всех систем организма могут происходить серьезные изменения.
Во время, космического полета по околоземной орбите на организм человека действуют такие факторы как нервно-психическое напряжение, повышенные физические нагрузки при выполнении внекорабельных операций, шумовое и радиационное воздействие, искусственная атмосфера и микроклимат, ускорения (на этапе вывода космического корабля на орбиту и при посадке), гиподинамия и собственно микрогравитация. Комплексное действие этих факторов может привести к развитию как неспецифических (общий адаптационный синдром), так и специфических изменений. К специфическим изменениям относятся: детренированность сердечно-сосудистой системы, вестибуло-вегетативная дисфункция, деминерализация костной ткани, атрофия мышц, утомление и другие (Газенко О.Г., Григорьев А.И., Наточин Ю.В., 1980; Gazenko O.G., Shulzhenko Е.В., Egorov A.D., 1986; Gazenko O.G., Egorov A.D., Ioseliani K.K. et al., 1987; Grigoriev A.T. & Egorov A.D., 1991; 1992; Моруков Б.В., Ларина И.М.. Григорьев А.И.. 1998; Корнилова Л.Н., Темникова В.В., Алехина М.И. с соавт., 2006). Таким образом, космические полеты требуют от организма человека не только высокой устойчивости к экстремальным воздействиям, но и развитой способности приспосабливаться к новым условиям существования.
Исследование особенностей процесса адаптации организма к длительному действию микрогравитации представляет одно из фундаментальных направлений космической биологии и медицины. В ходе такой адаптации происходит формирование новой функциональной системы, которая направлена на сохранение жизненно важных физико-химических констант в допустимых пределах и обеспечение гомеостаза основных систем. При этом степень адаптации каждого организма, несомненно, имеет индивидуальные особенности, зависящие от исходного функционального состояния и типа реагирования (Григорьев А.И., Баевский P.M., 2007).
Несомненно, что любые адаптивные изменения физиологических систем организма отражаются на качественном и количественном составе белков крови. А так как кровь содержит белки практически всех тканей, при изучении плазменной белковой композиции можно получить достаточно полную информацию о функционировании всех тканей и органов. Поэтому исследование протеома крови имеет большую теоретическую и практическую значимость для выяснения особенностей адаптационных перестроек, оценки их влияния на состояние здоровья и возможностей сохранения гомеостаза на молекулярном уровне.
Характеристика изменений белковой композиции плазмы крови при воздействии экстремальных условий среды обитания - предмет длительного изучения. Для решения данной задачи были использованы различные биохимические методы: фотометрические, иммунологические, клоттинговые, сатурационный анализ и др:, в соответствии с уровнем развития приборной базы. Суть фотометрических методов, заключается в измерении поглощения лучистой энергии растворами анализируемых веществ (Бабко А.К., Пилипенко А.Т., 1968). Данные методы доступны и просты; погрешности определения составляют около 5% (Булатов М.И., Калинкин И.П.. 1976). С помощью фотометрических. хроматографических и иммунологических методов определяют активность ферментов. оценивая скорость специфической химической реакции. Чувствительность измерения составляет от 2 до 5 Е/л, коэффициент вариации результатов определения не превышает 10-15% (Ройтберг Г.Е., Струтынский А.Е., 1999). Для определения концентрации иммуноглобулинов и белков системы комплемента СЗ и С4 используют метод радиальной иммунодиффузии, который основан на реакции преципитации (Mancini G., Carbonara А.О.. Heremans J.F.. 1965). Его преимущество заключается в том. что технически он очень прост, не требует дорогостоящего оборудования и отличается неплохой воспроизводимостью. Кроме того, можно одновременно анализировать несколько систем антиген-антитело, изучать иммунологические и электрофоретические свойства белков и сравнивать между собой разные белковые антигены. Данный метод позволяет анализировать растворы с низкой концентрацией белка, однако проведение реакции занимает длительное время (от 24 часов до нескольких суток), которое зависит от молекулярных размеров антигена.
Концентрации различных гормонов в плазме крови определяют с помощью радиоиммунологического анализа (РИА) (Yalow R.S.. 1973; 1978; 1980), являющегося подвидом сатурационного микроанализа или метода радиоактивных индикаторов in vitro. основанного на реакции антиген-антитело, в которой один из агентов метится радиоизотопом. Чувствительность РИА, определяемая физическим методом детектирования скорости распада радиоактивных изотопов, очень высока (до 10"14 моль/л), что особенно важно при измерении базальных концентраций пептидных гормонов (эти концентрации обычно находятся в пределах от 10 ь до 10 10 моль/л) и ферментов (Yalow R.S., 1980). Однако для получения надежных результатов РИА необходимо учитывать различные факторы и оптимизировать методику измерений для каждой системы. Кроме того, при анализе необходимо принимать во внимание перекрестную иммунореактивность веществ со сходным строением.
Изменения белков сыворотки и плазмы крови в условиях длительной изоляции в гермообъеме
Наземные экспериментальные исследования с участием испытателей-добровольцев в замкнутых гермообъектах, аналогичных орбитальным модулям пилотируемых космических станций, обеспечивают получение крайне важной информации о здоровье и работоспособности. Эти данные позволяют разработать комплекс медицинских, технических и организационных мероприятий с целью создания нормальных условий жизнедеятельности и сохранения физического и психического здоровья на всех этапах космической миссии (Баранов В.М., Демин Е.П., Степанов В.А. с соавт.. 2001). Изоляция экипажа в гермообъекте ограниченного объема не воспроизводит такие факторы орбитального полета, как невесомость и повышенный уровень радиации, но формирующиеся при этом искусственная атмосфера и микроклимат, а также возможные сложности психологического взаимодействия между членами экипажа в процессе совместной деятельности помогут раскрыть многие трудности реальной космической экспедиции.
Исследование электрофоретических фракций белков плазмы крови после 135 суточной изоляции показало значительное уменьшение содержания интер-а-трипсинового ингибитора, а-2-микроглобулина, гаптоглобина и а-2-глобулиновой фракции, что может быть следствием подавления синтеза белков в печени. Причем в некоторых точках наблюдения концентрации интер-а-трипсинового ингибитора и а-2-микроглобулшга вышли за нижние границы нормы. На 2-ой и 7-ой дни после окончания эксперимента наблюдали слабую острофазную реакцию, вероятно, связанную с эмоциональным стрессом (Ларина О.Н., 1997). В динамике 240-суточной изоляции наблюдали понижені е содержания общего белка в крови, кроме того, отмечалась тенденция к сниженио альбумина (Маркин А.А., Журавлева О.А., Вострикова Л.В: с соавт., 2001).
Изучение показателей иммунной системы в ходе длительной изоляции (110 суток — 8 человек; 240 суток - 4 человека) выявило периодические колебания уровней иммуноглобулинов G. М. и А в крови (Поликарпов Н.А., Рыкова М.П.. Антропова Е.П. с соавт., 2001; Рыкова М.П.. Герцик Ю.Г.. Антропова Е.Н. с соавт.. 2004; Герцик Ю.Г.. 2004). Однако после окончания эксперимента было продемонстрировано снижение содержания в крови данных типов иммуноглобулинов (Константинова И.В., Антропова Е.Н., Мешков Д.О. с соавт., 1997).
При длительной изоляции в гермообъеме были отмечены изменения отдельных параметров обмена веществ, характерные для длительных космических полетов и экспериментов с гипокинезией. Уровень основного обмена снижался на четверть, наблюдались сдвиги холестеринового метаболизма; наряду с признаками гиперхолестеринемии отмечалось изменение фракций холестерина в сторону преобладания его атерогенных форм. В белковом метаболизме отмечались признаки усиления катаболических реакций (Каландаров С.К., Коршунова В.А., Проскурова Г.И.. 1986). В эксперименте со 135-суточной изоляцией в гермообъеме детектировали увеличение активности трансаминаз, характерное для космических полетов. Однако значительных сдвигов белкового, энергетического, углеводного метаболизма обнаружено не было, что свидетельствует о компенсации организмом всего комплекса факторов гермообъема (Маркин А.А., Строганова Л.Б., Вострикова Л.В., 1997).
В ходе 240-суточной изоляции (по программе SFINCSS) в период с 39-ые по 95-ые сутки отмечено снижение активности щелочной фосфатазы и тенденция к снижению креатинфосфокиназы вследствие уменьшения двигательной активности испытателей. Однако в период с 123-их по 150-ые сутки и вплоть до конца эксперимента обменные процессы стабилизировались, что свидетельствует о формировании нового, измененного уровня гомеостаза, обеспечивающего адаптацию к условиям гермообъема (Маркин А.А.. Журавлева О.А., Вострикова Л.В. с соавт., 2001). Кроме того, в ходе эксперимента отсутствовал ряд метаболических сдвигов, встречавшихся в реальных космических полетах, а также в экспериментах с антиортостатической гипокинезией: не увеличивалось содержание холестерина, не происходило перераспределение его фракций в сторону преобладания атерогенных форм, а активность трансаминаз и амилазы оставалась, как правило, на уровне фона. Кроме того, во все сроки обследования не обнаружено признаков генерализованной активации перекисного окисления липидов. В группе испытателей, регулярно занимавшихся физическими тренировками, метаболические изменения, связанные со снижением двигательной активности, были минимальны (Маркин А.А. с соавт., 2001).
Исследование состояния пищеварительной системы в динамике длительной изоляции показало изменение толерантности к глюкозе, характеризующееся замедленным восстановлением концентрации глюкозы после приема глюкозной нагрузки, что сопровождалось активацией секреции С-пептида, инсулина и гастрина (Афонин Б.В., Ничипорук И.А., Зякун A.M. с соавт., 2001).
Таким образом, факторы космического полета оказывают влияние на различные системы организма - сердечно-сосудистую, эндокринную, пищеварительную и другие. Реакция организма в непривычных условиях существования сопряжена с перестройкой белковой композиции крови, а также с экспрессией определенных генов и синтезом de novo специфических белков, отдельные из которых обнаруживаются в плазме и сыворотке крови. Обобщенные данные об изменении белков сыворотки или плазмы крови после космических полетов и в наземных экспериментах, полученные с помощью различных биохимических методов, приведены в табл. I. Для характеристики белковой композиции крови использовались фотометрические методы, радиальная иммунодиффузия, РИА, электрофорез в ацетатцеллюлозе и другие. В обнаруженных сдвигах белковой композиции крови можно выделить некоторые общие черты. Так, в условиях моделируемой микрогравитации обнаружено снижение уровня гормонов ренин-ангиотензин альдостероновой системы. Данная гормональная перестройка направлена, прежде всего, на "сброс" лишней жидкости. Послеполетное обследование космонавтов, напротив, показало повышение содержания основных волюморегулирующих гормонов, что объясняется реадаптацией организма к земным условиям после окончания экспедиции. Снижение активности МДГ как в полетах, так и в экспериментах, связано с уменьшением скорости энергетического обмена. Изменения белков иммунной системы и острой фа?ы были, главным образом, разнонаправлены, что определялось типом применяемого воздействия. Таким образом, все выявленные изменения способствуют адаптацій организма человека к различным факторам космического полета
Несмотря на разнообразие подходов, применяемых для анализа изменений белкового состава крови при воздействии факторов космического полета, протеомнме методы ранее не использовались. На сегодняшний день отсутствует скринингоняя технология, позволяющая одновременно охарактеризовать изменения сразу нескольких белков. Плазма крови содержит тысячи различных белковых продуктов, тогда как к настоящему времени известен характер изменений лишь некоторых пептидов и белке в. Именно по этой причине необходимо расширить наши представления о сдвигах белков ш композиции крови при воздействии факторов космического полета. Исследование изменений как можно большего числа белков позволит раскрыть молекулярные механизмы адаптации организма и в дальнейшем способствовать совершенствованию существующих средств профилактики. Важность изучения этих вопросов требует углубленных исследований в этом направлении.
Циклограмма получения образцов крови и описание экспериментов по моделированию факторов космического полета
Эксперимент с 7-суточной «сухой» иммерсией проходил в ГНЦ РФ ИМБП РАН в 2008 г. Для имитации физиологических эффектов микрогравитации испытуемые погружались в воду (t воды = 33-34С), поверхность которой была покрыта водонепроницаемой свободно плавающей тканью. Эксперимент состоял из трех групп: 1) контрольная группа (5 человек) - участники эксперимента обследуемой группы не подвергались никаким дополнительным воздействиям, направленным на предупреждение развивающихся адаптивных сдвигов в физиологических системах; 2) группа с применением в качестве средства профилактики низкочастотной миостимуляции с использованием миостимулятора «Стимул-01 НЧ». разработанного совместно сотрудниками ГНЦ РФ ИМБП РАН и СКТБ «Биофизприбор».
Для стимуляции использовались поверхностные накожные электроды, накладывающиеся биполярно на проекции m. femoris, т. hamstring, т. tibialis arterior и т. triceps surae. Миостимуляцию проводили один раз в день в течение 30-60 минут с частотой 25 Гц (5 человек); 3) Группа с применением механической стимуляции опорных зон стопы (компенсатор опорной разгрузки - КОР, НПП «Звезда») (6 человек). КОР представляет собой ботинок с двумя пневматическими стельками, при нагнетании воздуха в которые происходит стимуляция плюсневой и пяточной зон стопы. Давление в стельках составляет 19 кПа, возможны два режима стимуляции - ходьба и бег. Механическую стимуляцию проводили в течение 20 минут каждый час в течение 6 часов каждый день (10 минут - в режиме медленной ходьбы, 10 минут - в режиме быстрой ходьбы). Пробы крови были получены венопункцией утром натощак в одно и тоже время суток. Отбор проб крови в каждой серии осуществляли за 7 суток до начала эксперимента, на 7 ые сутки «сухой» иммерсии и через 7 суток после окончания воздействия. J Данный эксперимент был проведен на базе Наземно-Экспериментального Комплекса ГНЦ РФ ИМБП РАН в 2009 г. Пробы крови 6 здоровых добровольцев отбирали за 11-13 дней (фон 1) и за 7-8 дней до начала эксперимента (фон 2), на 16-17, 51-52, 85-86 сутки изоляции и через 7-8 и 14-15 суток после ее окончания. Рацион питания испытателей в среднем содержал: белков -101,7 г. (14,7%), жиров -83,2 г. (27,5%), углеводов - 376,8 г. (55,1%) при калорийности 2750 ккал. Данный рацион обеспечивал физиологическое соотношение основных пищевых веществ, минеральных элементов и витаминов и отвечал рекомендациям Всемирной организации здравоохранения, а также согласованным российско-американским нормам по пищевому составу рационов питания для экипажей МКС. В течение эксперимента изменялось количество потребляемого NaCT. с 1 по 35 сутки изоляции каждый испытатель потреблял в среднем 11,55 г. поваренной соли/день, с 36 по 70 сутки - 8,73 г/день, с 71 по 75 сутки - 11,85 г/день. 75 по 104 сутки - 7,38 г/день. Также в ходе изоляции менялся характер физических тренировок. Так, в течение эксперимента все испытатели тренировались по полчаса в день на велоэргометре.
Кроме того, проводили дополнительные тренировки с использованием низкочастотной электромиостимуляции (3 часа/день), высокочастотной электромиостимуляции (40 минут/день) и силового тренажера «MDS» (40 минут/день). Вид дополнительных тренировок у испытателей изменяли каждые 30 суток эксперимента. 4 здоровых добровольца находились 9 суток в глубоководном водолазном комплексе ГВК 250 Института медико-биологических проблем при давлении 5 м.вод.ст. Первые шесть суток среда была нормоксической (13,53% кислорода, 58,21% аргона и 28,26% азота), затем заменялась на гипоксическую (9,66% 58,21% 32,13% азота). Такой состав среды поддерживался 3 суток. Затем производилась декомпрессия и выход. Отбор проб крови осуществляли за 2 суток до начала эксперимента, в день начала эксперимента за 3 часа до начала «погружения», на 6-ые и 9-ые сутки изоляции и на следующий день после её окончания. Для определения индивидуальных особенностей протеома здоровых людей сравнивали масс-спектры сыворотки крови здоровых добровольцев трех возрастных групп - 30-40 лет; 40-50 лет; 50-60 лет.
Во всех когортах вычисляли значение коэффициента вариации для каждого пика. Для определения естественной вариабельности протеомного профиля в привычных условиях жизнедеятельности у 5 здоровых мужчин отбирали пробы крови на 1-ые, 2-ые, 6-ые. 9-ые, 14-ые, 21-ые, 28-ые, 45-ые и 60-ые сутки. Также у 5 человек были проанализированы изменения масс-спектров сыворотки через 6-7 месяцев, и у 10 человек - через 11-12 месяцев. Отбор проб проводили утром, натощак. Для каждого пика вычисляли значение коэффициента вариации (СУ=стандартное отклонение/среднее). Таким образом, появилась возможность оценить изменчивость протеома без воздействия экстремальных факторов для верификации возможных адаптивных сдвигов уровня белков в наземных экспериментах и после космических полетов (табл. 5).
Характеристика вариабельности низкомолекулярного субпротеома сыворотки крови здорового человека в привычных условиях жизнедеятельности
Для определения межиндивидуальных различий низкомолекулярного протеома были получены протеомные профили сыворотки крови здоровых мужчин трех возрастных групп: от 20 до 30 лет (36 человек), от 30 до 40 лет (11 человек), от 40 до 50 лет (11 человек). В каждом масс-спектре сыворотки было получено 174 MS-пика. Некоторые пики были идентифицированы с помощью прямого MS/MS анализа; результаты идентификации представлены в табл. 8. После составления таблицы масс всех пиков с указанием их площадей, были рассчитаны коэффициенты вариации для каждого пика во всех возрастных группах. Оказалось, что средний коэффициент вариации в возрастной группе от 20 до 30 лет был равен 37 %, от 30 до 40 лет - 40,2 %, от 40 до 50 лет - 50,6% (общее CV по всем группам = 42,6%). Данные значения намного превышают ошибку метода профилирования (15,9%), что свидетельствует о достаточно высокой групповой вариабельности протеомного профиля. Пики с коэффициентами вариации 50% составляют 21% от всех пиков протеомного профиля, а пики с небольшой дисперсией среди изученных групп здоровых лиц (CV 30%) - 29%. Таким образом, большую часть пиков протеомного профиля составляют пики с умеренной групповой вариабельностью (CV от 30 до 50%). Коэффициенты вариации некоторых пиков с высокой групповой вариабельностью приведены в табл. 9. кининогена. Вновь синтезированный брадикинин быстро разрушается на неактивные метаболиты (время полужизни данного пептида in vivo составляет всего 17 секунд (Ferreira S.H. & Vane J.R., 1967)), поэтому его концентрация в плазме крови и тканях изменяется в очень больших пределах (Murphey L.J., Hachey D.L., Oates J.A. et al., 2000). По этой причине определить взаимосвязь между каким-либо заболеванием и содержанием брадикинина практически невозможно. Кроме того, низкое содержание данного пептида в присутствии достаточных количеств кининогена, кинин-образующих, кинин-разрушающих ферментов может привести к его ex vivo образованию или разрушению при отборе проб крови. Таким образом, обнаруженные нами высокие межиндивидуальные различия площади пика брадикинина среди здоровых людей, скорее всего, объясняются высокой скоростью его образования и разрушения и возможными артефактами. связанными с процедурой получения образцов.
Также нами были обнаружены пики, которые имели высокие коэффициенты вариации внутри каждой возрастной группы здоровых мужчин, но при этом аналитическая ошибка данных пиков оказалась невелика (до 20%) (см. табл. 9). Например, пики с m/z = 996; 2272; 3956; 3973; 4282 Да, являющиеся фрагментами интер-а-трипсинового ингибитора1 (Villanueva J., Shaffer D.R., Philip J. et al., 2006) имели достаточно высокую вариабельность во всех возрастных группах, при этом наибольшие значения коэффициентов вариации были в группе мужчин от 40 до 50 лет. Данный белок является специфическим ингибитором протеолитических каскадных систем, комплемента, коагуляции и фибринолиза и регулирует изменение активности этих важнейших биохимических путей в условиях воспаления (Пак С.Г., 2005).
Кроме того, высокие значения коэффициентов вариации в трех возрастных группах имели пики с m/z=1865 и 2022 Да, которые были идентифицированы как фрагменты комплемента СЗ (см. табл. 9). Результаты идентификации данных компонентов протеомного профиля совпадают с результатами, полученными другими авторами (Villanueva J., Shaffer D.R., Philip J. et al., 2006; Lopez M.F., Mikulskis A., Kuzdzal S. et al.. 2007). Площади других пиков этого белка (m/z-1450; 1692; 1779; 8931 Да) также имели высокую групповую вариабельность. Фрагменты С4а белка системы комплемента (m/z=1740; 1897; 3208 Да) также сильно варьировали в данных группах здоровых людей (CV до 69%). Белки системы комплемента являются важным компонентом как врождённого, так и приобретённого иммунитета. Это каскадная система протеолитических ферментов, предназначенная для гуморальной защиты организма от действия чужеродных агентов. СЗ фактор составляет около 70% всех белков системы комплемента, он образуется в печени, макрофагах, фибробластах, лимфоидн ой ткани и коже. Данный белок участвует в активации комплемента по классическому и альтернативному путям, он задействован в развитии иммунного ответа, повышающего сопротивляемость организма инфекциям. Белок С4а обладает слабой анафилатоксической активностью (Воронин Е.С., Петров A.M., Серых М.М. с соавт., 2002).
Также нами была обнаружена значительная групповая вариабельность фрагментов высокомолекулярного кининогена (m/z=1945; 2082; 2210 Да) во всех группах здоровых мужчин. Высокомолекулярный кининоген (ВМК, фактор XV или фактор Фитцджеральда) относится к важнейшим белкам системы гемостаза. ВМК участвует в активации контактной фазы плазменного протеолиза, контролирует адгезию и активность тромбоцитов и эндотелиоцитов; подавляет активность цистеиновьгх протеиназ, препятствуя их деградирующему действию на плазменные белки при повреждении различных тканей. Также ВМК модулирует воспалительные и антитромботические реакции, создает важную регуляторную систему во взаимодействии плазменных белков с клетками крови и клетками сосудистой стенки, принимает участие в процессе свертывания крови - активирует фактор XI, ускоряя действие фактора ХПа (Яровая Г.А., 2001).
Высокие различия между индивидуумами имели также другие компоненты системы гемостаза - фрагменты фибриногена (m/z=1077; 1206; 1617; 2863 Да) и антитромбина III (m/z=4475 Да). Вероятно, что появление отличий в содержании фрагментов различных белков связано с индивидуальными особенностями протеолитической активности у здорового человека.
Пики р2-микроглобулина (m/z=11730 Да) и цистатина С (m/z=13300 Да) также имели высокий разброс внутри всех групп здоровых мужчин. Уровень в крови Р2-микроглобулина отражает главным образом клеточный оборот и пролиферацию лимфоцитов, в которых он представлен в большом количестве. У взрослых людей скорость продукции этого белка относительно постоянна. Цистатин С ингибирует и регулирует активность цистеиновьгх протеаз. Его концентрация в крови коррелирует со скоростью клубочковой фильтрации (Короленко Т.А., Филатова Т.Г., Юзько Ю.В. с соавт., 2007).
Все вышеупомянутые белки относятся к "белкам острой фазы", которые выявляются в сыворотке крови и других биологических жидкостях в острую фазу воспаления любой этиологии и обладают различными физиологическими свойствами. Общей характеристикой белков данной группы является их выраженная опсонизирующая, антипротеолитическая и бактериостатическая активность, а также способность к связьшанию свободных радикалов, усилению коагуляции крови и активации системы комплемента (Алешкин В.А.. Новикова Л.И., Лютов А.Г. с соавт., 1988). Таким образом. белки, характеризующиеся наибольшим разбросом у разных людей, относятся к белкам. связанным с реакцией на стресс - воспалительный процесс, повреждение ткани, и задействованным в системе иммунного ответа. Возможно, что эти белки являются наиболее пластичной частью протеома сыворотки крови, поскольку их активация или дезактивация является неотъемлемой составляющей жизни клетки, что обеспечивает адекватную реакцию на воспалительные процессы различной этиологии.
