Мессбауэровская спектроскопия с высоким скоростным разрешением наноразмерных «железных ядер» в макромолекулах ферритина и его аналогов Аленькина Ирина Владимировна

Содержание к диссертации

Введение

Глава 1 Особенности структуры и некоторых физических параметров наноразмерных «железных ядер» макромолекул ферритина и их фармацевтических аналогов .12

1.1 Структура и функции макромолекул ферритина и их фармацевтических аналогов .12

1.2 Мессбауэровская спектроскопия наноразмерных «железных ядер» макромолекул ферритина и его аналогов .

1.2.1 Суперпарамагнитная релаксация (поведение) и другие особенности мессбауэровских спектров ферритина и его аналогов .32

1.2.2 Параметры сверхтонкой структуры ядер 57Fe выделенных макромолекул железодепонирующих белков .41

1.2.3 Параметры сверхтонкой структуры ядер 57Fe фармацевтических аналогов ферритина .46

1.3 Особенности структуры и параметров мессбауэровских спектров макромолекул

железодепонирующих белков в различных тканях в норме и при молекулярных

болезнях .53

1.3.1 Мессбауэровская спектроскопия тканей, содержащих железодепонирующие белки .53

1.3.2 Параметры мессбауэровских спектров наноразмерных «железных ядер» макромолекул ферритина в норме и при молекулярных болезнях .58

1.4 Постановка задачи исследования .68

Глава 2 Объекты и методы исследования .71

2.1 Приготовление образцов .71

2.1.1 Выделенный ферритин печени человека .71

2.1.2 Фармацевтические аналоги ферритина 71

2.1.3 Ткани, содержащие железодепонирующие белки, в норме и при некоторых патологиях . 71

2.1.4 Бактерии, содержащие ферритин .72

2.2 Методы исследования образцов .73

2.2.1 Рентгеновский фазовый анализ .73

2.2.2 Сканирующая электронная и трансмиссионная микроскопия .73

2.2.3 Гистохимический анализ тканей .73

2.2.4 Термогравиметрия .74

2.2.5 Электронный парамагнитный резонанс 74

2.2.6 Измерение магнитных свойств .74

2.2.7 Мессбауэровская спектроскопия .75

2.3 Выводы 82

Глава 3 Мессбауэровская спектроскопия наноразмерных «железных ядер» макромолекул ферритина и их фармацевтических аналогов .83

3.1 TEM, SEM, XRD и термогравиметрия наноразмерных «железных ядер» макромолекул ферритина и его аналогов – фармацевтических препаратов Мальтофер и Феррум Лек .83

3.2 ЭПР и магнитометрия наноразмерных «железных ядер» макромолекул ферритина и его аналогов – фармацевтических препаратов Мальтофер и Феррум Лек .87

3.3 Особенности структуры наноразмерных «железных ядер» ферритина и его аналогов по данным мессбауэровской спектроскопии с высоким скоростным разрешением при 295 и 90 К 3.3.1 Аппроксимация мессбауэровских спектров на основе гомогенной модели «железного ядра» .91

3.3.2 Аппроксимация мессбауэровских спектров на основе модели гетерогенного «железного ядра» 3.4 Отличие в величине барьера энергии магнитной анизотропии для наноразмерных «железных ядер» ферритина и его аналогов 100

3.5 Выводы 106

Глава 4 Аномальное поведение параметров мессбауэровских спектров макромолекул ферритина и его аналогов в температурном диапазоне 295–90 к и особенности гетерогенной структуры «железных ядер»

4.1 Мессбауэровские спектры ферритина и его аналогов в диапазоне температур 295–90 К 107

4.2 Оценка температуры Дебая для «железных ядер» выделенного ферритна печени человека и препарата Феррум Лек. 108

4.3 Аномальные температурные зависимости параметров мессбауэровских спектров ферритина и его аналогов в диапазоне температур 295–90 К.

4.3.1 Модель гомогенного «железного ядра» 110

4.3.2 Модель гетерогенного «железного ядра» 114

4.4 Применение нового подхода к аппроксимации мессбауэровских спектров ферритина в бактериях A. brasilense (штамм Sp245) при 295 К в рамках модели гетерогенного «железного ядра» 122

4.5 Выводы 124

Глава 5 Мессбауэровская спектроскопия тканей, содержащих железодепонирующие белки, в норме и при некоторых злокачественных заболеваниях системы крови 126

5.1 Параметры сверхтонкой структуры мессбауэровских спектров тканей куриной печени и селезенки в норме и при лимфоидном лейкозе 126

5.2 Особенности наноразмерных «железных ядер» в железодепонирующих белках тканей селезенки и печени здорового человека и больных злокачественными заболеваниями системы крови 131

5.3 Выводы 146

Заключение 148

Список сокращений и условных обозначений 151

Список литературы

• Мессбауэровская спектроскопия наноразмерных «железных ядер» макромолекул ферритина и его аналогов
• Ткани, содержащие железодепонирующие белки, в норме и при некоторых патологиях
• ЭПР и магнитометрия наноразмерных «железных ядер» макромолекул ферритина и его аналогов – фармацевтических препаратов Мальтофер и Феррум Лек
• Применение нового подхода к аппроксимации мессбауэровских спектров ферритина в бактериях A. brasilense (штамм Sp245) при 295 К в рамках модели гетерогенного «железного ядра»

Введение к работе

Актуальность

Особенности структуры наноразмерных частиц представляют большой интерес для понимания их физических и функциональных свойств. В частности одним из важных и перспективных направлений является изучение наночастиц, синтезированных в живых организмах, а также их искусственных аналогов. Примером таких наночастиц служат наноразмерные «железные ядра» в макромолекулах железодепонирующих белков – ферритинов. Эти белки обеспечивают живые организмы железом, необходимым для биосинтеза жизненно важных железосодержащих белков. При этом структура «железных ядер» в ферритинах, как синтезированных в разных органах одного организма, так и в различных организмах, отличается. С другой стороны, в случае недостатка железа в организме и возникающей в результате этого железодефицитной анемии для лечения последней применяются различные железосодержащие препараты, включая железо-полисахаридные комплексы, являющиеся синтетическими аналогами макромолекулы ферритина. В этом случае особенности структуры «железных ядер» аналогов ферритина могут определять эффективность этих препаратов.

Одним из наиболее чувствительных методов диагностики состояния ионов железа в различных объектах является мессбауэровская спектроскопия на ядрах ⁵⁷Fe. В частности, с помощью мессбауэровской спектроскопии можно исследовать связь структуры локального окружения и параметров сверхтонкой структуры ядер ⁵⁷Fe. Возможности этого метода существенно возрастают при использовании мессбауэровской спектроскопии с высоким скоростным разрешением, т.е. с дискретизацией опорного сигнала скорости допплеровской модуляции на 4096 шагов (см. Oshtrakh M.I., Semionkin V.A. // Spectrochimica Acta, Part A. – 2013. – V. 100. – P. 78–87). Поэтому данный метод впервые применен для более детального изучения особенностей структуры наноразмерных «железных ядер» в макромолекулах ферритина и его аналогов.

Степень разработанности

Физические свойства макромолекул ферритина и его аналогов изучаются более сорока лет во многих лабораториях мира. Тем не менее, эти макромолекулы все еще остаются объектами различных исследований. В частности, это связано с тем, что структура наноразмерных «железных ядер» и особенности их формирования в различных макромолекулах ферритинов, а также их аналогов до сих пор недостаточно изучены ввиду чрезвычайной сложности этих объектов. До настоящего времени ведутся научные дискуссии по поводу особенностей формирования «железных ядер», в результате чего отсутствует общепринятое представление о модели структуры «железного ядра» как в различных ферритинах, так и в их аналогах. Поэтому дальнейшее изучение «железных ядер» в макромолекулах ферритина и его аналогов различными физическими методами с целью разработки новых подходов к формированию представлений о структуре наноразмерного «железного ядра» остается актуальным.

Цель работы:

Изучение особенностей структуры наноразмерных «железных ядер» в макромолекулах ферритина и его фармацевтически важных аналогов, а также в железодепонирующих белках в тканях печени и селезенки в норме и при злокачественных заболеваниях системы крови методом мессбауэровской спектроскопии с высоким скоростным разрешением.

Задачи работы:

1. Характеризация исследуемых объектов (ферритина печени человека, тканей печени и селезенки и фармацевтических препаратов Мальтофер и Феррум Лек) методами трансмиссионной и сканирующей электронной микроскопии с энергодисперсионной спектроскопией, рентгеновской дифракции, электронного парамагнитного резонанса, термогравиметрии и магнитных измерений.

2. Измерение в температурном диапазоне 295–90 К мессбауэровских спектров с высоким скоростным разрешением наноразмерных «железных ядер» в выделенном ферритине печени человека и его фармацевтически важных аналогах

5 – препаратах Имферон, Мальтофер и Феррум Лек.

3. Измерение при 295 К мессбауэровских спектров с высоким скоростным
разрешением наноразмерных «железных ядер» в ферритине бактерий Azospirillum
brasilense (штамм Sp245) и в железодепонирующих белках в тканях печени и
селезенки человека и куриц в норме и при злокачественных заболеваниях
системы крови.

4. Измерение в температурном диапазоне 80–20 К мессбауэровских
спектров с низким скоростным разрешением наноразмерных «железных ядер» в
выделенном ферритине печени человека и его фармацевтически важных аналогах
– препаратах Мальтофер и Феррум Лек.

5. Измерение при 40 и 20 К мессбауэровских спектров с низким скоростным разрешением наноразмерных «железных ядер» в железодепонирующих белках в тканях печени и селезенки человека в норме и при злокачественных заболеваниях системы крови.

6. Аппроксимация измеренных мессбауэровских спектров с использованием моделей гомогенного и гетерогенного «железного ядра» и получение оценок мессбауэровских параметров.

7. Анализ и интерпретация полученных мессбауэровских параметров во
взаимосвязи со структурными особенностями наноразмерных «железных ядер» в
исследуемых объектах.

Методология и методы

Основным методом диссертационного исследования является мессбауэровская спектроскопия с высоким скоростным разрешением. В качестве дополнительных методов использовались мессбауэровская спектроскопия с низким скоростным разрешением, сканирующая и трансмиссионная электронная микроскопия, рентгеновская дифракция, термогравиметрия, магнитометрия, электронный парамагнитный резонанс и гистохимический анализ. Методология и методы исследования подробно описаны в Главе 2.

Научная новизна

Выявлены структурные отличия «железных ядер» выделенного ферритина

6 печени человека, ферритина бактерий Azospirillum brasilense (штамм Sp245), фармацевтических препаратов Имферон, Мальтофер и Феррум Лек в результате оценки параметров сверхтонкой структуры ядер ⁵⁷Fe мессбауэровских спектров этих объектов, измеренных с высоким скоростным разрешением с высоким скоростным разрешением.

Показано, что барьер энергии магнитной анизотропии наноразмерных «железных ядер» в макромолекулах ферритина печени человека ниже, чем в его аналогах – препаратах Мальтофер и Феррум Лек.

Впервые обнаружены аномальные температурные зависимости некоторых мессбауэровских параметров спектров макромолекул ферритина печени человека и его аналога – препарата Феррум Лек, которые могут быть связаны с низкотемпературными структурными перестройками в соответствующих слоях/областях/нанодоменах «железных ядер».

Предложена новая модель гетерогенного «железного ядра» для аппроксимации мессбауэровских спектров ферритина печени человека, ферритина бактерий Azospirillum brasilense (штамм Sp245), фармацевтических препаратов Мальтофер и Феррум Лек, позволяющая связать выявленные компоненты спектров с соответствующими слоями/областями/нанодоменами «железных ядер» и оценить их структурные особенности.

Выявлены отличия в содержании ферритиноподобного железа, а также в долях более и менее плотно упакованных областей наноразмерных «железных ядер», характеризующихся соответственно меньшим или большим значением градиента электрического поля на ядрах ⁵⁷Fe, в нескольких образцах тканей печени и селезенки здоровых людей и больных злокачественными заболеваниями системы крови.

Защищаемые положения:

1. Величина барьера энергии магнитной анизотропии для наноразмерных «железных ядер» в ферритине печени человека ниже, чем в его аналогах – препаратах Феррум Лек и Мальтофер.

2. Температура Дебая для атомов железа, оцененная в модели гомогенного

7 «железного ядра», составляет 461±16 К для ферритина печени человека и 502±24 К для его аналога – препарата Феррум Лек.

3. Аномальное поведение мессбауэровских параметров спектров
наноразмерных «железных ядер» ферритина печени человека и его аналога –
препарата Феррум Лек, обнаруженное в температурном диапазоне 295–90 К,
может быть обусловлено низкотемпературными структурными перестройками.

4. Соотношение более плотно упакованных и менее плотно упакованных
областей наноразмерных «железных ядер», характеризующихся соответственно
меньшим и большим значением градиента электрического поля на ядрах ⁵⁷Fe,
различно в ферритине исследованных образцов тканей селезенки и печени
здоровых людей и больных злокачественными заболеваниями системы крови.

Научная и практическая значимость работы

Показаны преимущества применения прецизионного высокостабильного мессбауэровского спектрометрического комплекса с высоким скоростным разрешением для получения новой более детальной информации об особенностях структуры наноразмерных «железных ядер» в различных макромолекулах ферритина и его аналогов – препаратов Феррум Лек и Мальтофер.

Разработан новый подход к аппроксимации мессбауэровских спектров различных ферритинов и их аналогов на основе гетерогенной модели «железного ядра», который может быть использован в дальнейших исследованиях методом мессбауэровской спектроскопии аналогичных объектов, а также других железосодержащих наночастиц в парамагнитном состоянии.

Полученные данные об особенностях структуры и подходы к исследованию наноразмерных «железных ядер» в аналогах макромолекул ферритина могут быть использованы для разработки и контроля новых, более эффективных фармацевтических препаратов для лечения железодефицитной анемии.

Результаты проведенных исследований могут быть использованы в учебных курсах для бакалавров и магистров специальностей «Нанотехнологии» и «Биомедицинская инженерия».

Данная работа выполнена в рамках проекта РФФИ 09-02-00055-а

8 «Диагностические тесты для молекулярных болезней на основе данных мессбауэровской спектроскопии с высоким скоростным разрешением» (2009– 2011 гг.), госбюджетных тем «Мессбауэровская спектроскопия с высоким скоростным разрешением микро- и наноразмерных железосодержащих структур в объектах живой и неживой природы» (2009–2011 гг.), «Сверхтонкие взаимодействия ядер ⁵⁷Fe в микро- и наноразмерных железосодержащих объектах живой и неживой природы по данным мессбауэровской спектроскопии с высоким скоростным разрешением» (2012–2013 гг.), «Спектроскопия микро- и наноразмерных материалов и биообъектов» (2014–2016 гг.).

Достоверность полученных в работе результатов

Достоверность результатов обеспечена использованием современного аттестованного оборудования и соответствующих методов исследований, включая прецизионный высокостабильный мессбауэровский спектрометрический комплекс с высоким скоростным разрешением и малой инструментальной ошибкой по шкале скоростей, приходящейся на одну точку спектра, а также азотный криостат с движущимся поглотителем с ошибкой поддержания температуры менее ±1 К.

Личный вклад автора

Формулирование цели и задач исследования, выбор изучаемых объектов и методов исследования проведены автором совместно с научным руководителем д.ф.-м.н. М.И. Оштрахом. Автором подготовлены различные образцы для исследований, проведено планирование и проведение экспериментов. Автором проведена аппроксимация измеренных мессбауэровских спектров, анализ и интерпретация результатов проведены совместно с научным руководителем. Обобщение результатов, формулирование выводов и защищаемых положений выполнены автором. В получении ряда результатов, их анализе и интерпретации помимо автора также участвовали E. Kuzmann, Z. Klencsr, S. Dubiel и I. Felner.

Апробация работы

Основные результаты диссертационной работы были представлены на международных конференциях: The XIII European Conference on Spectroscopy of

9 Biological Molecules (Italy, Palermo, 2009), Colloquium Spectroscopicum Internationale (Hungary, Budapest, 2009; Brazil, Buzios, 2011; Portugal, Coimbra, 2015), International Conference on Molecular Spectroscopy (Poland, Krakw – Biaka Tatrzaska, 2009; Poland, Wroclaw – Kudowa Zdroj, 2011; Poland, Krakw – Bialka Tatrzaska, 2013), The 21st International Symposium on Pharmaceutical and Biomedical Analysis (USA, Orlando, 2009), European Congress on Molecular Spectroscopy (Italy, Florence, 2010; Romania, Cluj-Napoca, 2012; Germany, Dsseldorf, 2014), International Biometals Symposium (USA, Tucson, 2010; Belgium, Brussels, 2012), The 5^th Central European Conference “Chemistry towards Biology”(Croatia, Primoten, 2010), The 7^th Seeheim Workshop on Mssbauer Spectroscopy (Germany, Frankfurt, 2011), European Biophysics Congress (Hungary, Budapest, 2011, Germany, Dresden, 2015), The Joint Meeting of the International Conference on Hyperfine Interactions and the International Symposium on Nuclear Quadrupole Interactions (China, Beijing, 2012; Australia, Canberra, 2014), Международной конференции «Мессбауэровская спектроскопия и ее применения» (Россия, Суздаль, 2012; Россия, Суздаль, 2014), The 3^rd International Conference on Analytical Proteomics (Brazil, San Pedro, 2013), International Conference on the Applications of the Mssbauer Effect (Croatia, Opatija, 2013), International Turkish Congress on Molecular Spectroscopy (Turkey, Istanbul, 2013; Turkey, Antalya, 2015), Mssbauer Spectroscopy in Materials Science (Czech Republic, Hlochovec u Beclavi, 2014; Slovakia, Liptovsky Jan, 2016), The 14^th International Conference on Modern Trends in Activation Analysis and The 11^th international Conference on Nuclear Analytical Methods in the Life Sciences (The Netherlands, Delft, 2015), 2nd Mediterranean Conference on the Applications of the Mssbauer Effect (Croatia, Cavtat, 2016).

Публикации

Основные результаты опубликованы в 50 работах, в том числе 17 статей в рецензируемых журналах из перечня ВАК, 31 тезис докладов на международных конференциях, 1 книжная глава в коллективной монографии по мессбауэровской спектроскопии, вышедшей в издательстве Wiley, 1 статья в межвузовском сборнике.

Объем и структура диссертационной работы

Мессбауэровская спектроскопия наноразмерных «железных ядер» макромолекул ферритина и его аналогов

В работе [96] были измерены ЭПР-спектры ферритина селезенки лошади при температурах от 290 до 9 К и получено два характерных пика около g=2 и g=4. Отличие в интенсивности пиков по сравнению с ЭПР-спектрами, измеренными в работах других авторов [5, 62, 95, 98], было связано с изменением распределения ионов железа в «железных ядрах» ферритина, присутствием кислорода, содержанием фосфатов, старением. В области температур около 80 К был обнаружен новый сигнал при g=9, интенсивность которого увеличивалась при повышении температуры, а расположение смещалось к g=4. Так как форма линии ЭПР-спектров зависит от времени релаксации магнитного момента частиц, то можно оценить суперпарамагнитные свойства этих частиц. Поэтому по зависимости расстояния между двумя экстремумами ЭПР-линии оттемпературы была проведена оценка суперпарамагнитных свойств «железных ядер» ферритина. Для расчета магнитных параметров авторами [96] были использованы две теоретические модели: 1) система состоит из малых невзаимодействующих частиц, внедренных в диамагнитную матрицу, при этом все частицы обладают одинаковыми магнитным моментом, константой анизотропии и объемом (модель [99, 100]) и 2) произвольно ориентированная одноосная система ферромагнитных частиц (модель авторов [101]). Оценки магнитных параметров, полученные в первой модели составили 2K/M = 2,7103 Э и MV = 1,910–17 эме, во второй модели – K/M = 1,3103 Э и MV = 2,010–17 эме, где K – константа магнитной анизотропии, M – намагниченность, V – объем суперпарамагнитного «железного ядра». Рассмотрение ЭПР-спектра ферритина в упрощенном виде как композиции из двух компонент: изотропной, возникающей благодаря неблокированным малым частицам (температура выше блокирующей TB), и анизотропной, возникающей из-за блокированной магнитной фазы (температура ниже TB), позволило оценить TB по температурной зависимости относительных долей этих компонент. При этом TB оценивалась как температура, при которой доля магнитной компоненты F составляет 0,5 согласно [102, 103]. Согласно этому подходу авторы работы [96] получили значение TB=116±9 К, а также по температуре исчезновения сигнала ЭПР оценили температуру магнитного упорядочения для поверхностного более аморфного слоя «железных ядер» Tord=14±5 K (это происходит вследствие нулевого суммарного магнитного момента, обусловленного антиферромагнитным упорядочением при данной температуре). Следует отметить, что по спектрам ЭПР не удалось отличить между собой макромолекулы различных ферритинов и гемосидеринов [62], а также ферритины селезенки лошади с различным содержанием железа [95].

Pan и соавторы по результатам изображений кольцевого темного поля при больших углах, полученных с помощью сканирующей трансмиссионной электронной микроскопии (HAADF STEM), и результатам спектроскопии потерь энергии электронов (EEL) модифицировали модель макромолекулы ферритина [104], предложенную ранее Levin и соавторами по данным EXAFS, рентгеноструктурного анализа, ЭПР и рамановской спектроскопии в работе [16], которая учитывала процессы накопления железа. В модифицированной модели [104] предполагается, что «железное ядро» ферритина имеет поликристаллическую структуру и состоит из 8 субъединиц из ферригидрита размером 2 нм с разупорядоченной поверхностью, которые находятся вблизи каналов накопления и отдачи ионов железа в белковой оболочке (см. рисунок 1.18). Однако, авторам не удалось установить взаимосвязь кристаллографической ориентации ферригидритных субъединиц между собой. Также данная модель не учитывает магнитных свойств «железных ядер» макромолекул ферритина.

Пример изображения «железного ядра» макромолекулы ферритина, полученного методом HAADF (а) и модель структуры «железного ядра» из восьми ферригидритных субъединиц (показано только четыре субъединицы) (б) [ 104]. При исследовании магнитных свойств макромолекул ферритина были определены значения температуры блокирования по температурной зависимости намагниченности при охлаждении в нулевом поле (ZFC) и в поле (FC) (см., например, рисунок 1.19). Так как «железные ядра» ферритина обладают разным размером, имеется разброс по энергии анизотропии и, как следствие, диапазон значений Тв. Поэтому максимум кривой ZFC соответствует среднему значению Тв=12 К, а точка бифуркации кривых ZFC и FC соответствует максимальной величине Тв=20 К, характерной для самых крупных частиц [105]. Данные, полученные для среднего значения Тв в работе [105] согласуются с данными, полученными другими авторами для ферритина селезенки лошади, где среднее значение температуры блокирования, определенное по температурным зависимостям ZFC и FC, варьируется от 11 до 15 К [97, 103, 106].

Особенностью «железных ядер» макромолекул ферритина является отсутствие магнитного момента насыщения при изотермическом измерении магнитной восприимчивости, что объясняется вкладом дополнительной компоненты, имеющей характер линейной зависимости магнитного момента от поля (см., например, рисунок 1.20 а) [107-114].

В работе [115] авторы предположили, что дополнительная линейная компонента появляется из-за того, что в «железном ядре» доминирует антиферромагнитное упорядочение с неполной компенсацией спинов двух подрешеток, вследствие которой возникает остаточный магнитный момент. В работах [105, 109] было предположено суперантиферромагнитное упорядочение «железного ядра», для которого собственная магнитная восприимчивость значительно больше, вследствие чего возникает дополнительная линейная компонента Н, незначительно меняющаяся при изменении температуры. Согласно этому подходу, описание зависимости магнитного момента от поля для «железного ядра» являлась модифицированная модель Ланжевена: M(MS,Li,x) = Ms[coth(iiH/kBT) - kBT/ііН] + %Н, (1) где Мs - намагниченность насыщения, \х - среднее значение магнитного момента наночастицы и х _ линейная магнитная восприимчивость. Gilles и соавторы [116] предположили модель случайной ориентации магнитных моментов «железного ядра», которая учитывает флуктуации спинов между антипараллельными направлениями вдоль антиферромагнитной оси: M(MS,\i(T),x)=MS\ 0,5 sin9cos9tanh {[i(T)H/kBT ] cos9} d9 +хн (2) где д(Т) - магнитный момент от некомпенсированных спинов в каждом ядре, 9 - угол между случайной ориентацией антиферромагнитной оси и направлением поля. Следует отметить, что оба подхода предполагают, что «железное ядро» ферритина состоит из одной фазы.

Ткани, содержащие железодепонирующие белки, в норме и при некоторых патологиях

Термогравиметрические измерения были проведены для образцов выделенного ферритина печени человека и его фармацевтических аналогов Мальтофер и Феррум Лек на оборудовании SETSYS Evolution (Setaram) совместно с Р.Ф. Самигуллиной в Институте химии твердого тела УрО РАН, Екатеринбург. Измерения проводились в диапазоне температур от 300 до 1900 К в тиглях из корунда с шагом 10 К/мин, точность весов 10–9 кг.

Спектры электронного парамагнитного резонанса были измерены на порошках образцов выделенного ферритина печени человека и его фармацевтических аналогов Мальтофер и Феррум Лек при комнатной температуре и частоте модуляции 100 кГц на спектрометре Bruker ElexSys E500 X-band EPR совместно с д-ром З. Кленчаром (Z. Klencsr) в Research Centre for Natural Sciences, Hungarian Academy of Science, Budapest, Hungary. Аппроксимация измеренных спектров была проведена д-ром З. Кленчаром. Для образца выделенного ферритина амплитуда модуляции составила 10 Г, микроволновая мощность составила 20 мВт. Для образцов Феррум Лек и Мальтофер значения этих величины составили 5 Г и 10 мВт. Также было проведено измерение без образца в тех же самых условиях для определения фонового уровня интенсивностей как функции постоянного магнитного поля. Далее этот фоновый уровень вычитался из спектров измеренных образцов до проведения аппроксимации. Для определения сигнала от неагрегированных парамагнитных частиц железа ферритина были проведены измерения при температурах 150–290 K с амплитудой модуляции 10 Г и микроволновой мощностью 10 мВт. Для того, чтобы исключить влияние текстуры на вид ЭПР спектра, порошок образца препарата Мальтофер был смешан с порошком оксида MgO. Значения частоты измерения составили 9,8604 ГГц для образца ферритина, 9,3235 ГГц для образца препарата Мальтофер и 9,8658 ГГц для образца препарата Феррум Лек.

Измерение магнитных свойств образцов выделенного ферритина печени человека и его фармацевтических аналогов Мальтофер и Феррум Лек, а также образцов тканей печени и селезенки в норме и при некоторых злокачественных заболеваниях системы крови было проведено на SQUID-магнетометре MPMS-5S (Quantum Design) совместно с профессором И. Фелнером (Prof. I. Felner) в the Hebrew University, Jerusalem, Israel. Дифференциальная чувствительность магнетометра составила 10–7 эме. До измерения каждой кривой ZFC магнетометр настраивался таким образом, чтобы значение поля действительно было нулевым. Образцы весом 6–14 мг помещались в желатиновые капсулы и измерялись в диапазоне температур от 5 до 300 К при различных значениях магнитного поля. После охлаждения образцов до необходимой температуры включалось магнитное поле для измерения различных кривых ZFC. Кривые FC измерялись при нагревании. Также проводились измерения при постоянной температуре в переменном магнитном поле в диапазоне от 0 до 16 кЭ.

Мессбауэровские спектры исследуемых образцов были измерены с высоким и низким скоростным разрешением в зависимости от поставленных задач. Мессбауэровские спектры с низким скоростным разрешением измерялись на мессбауэровском спектрометре типа KFKI с APD криостатом замкнутого цикла при 40 и 20 К, а также на спектрометре Wissel MDU-1200 с наливным азотным криостатом при 83 К совместно с профессором Э. Кузманном (E. Kuzmann) в Etvs Lornd University, Budapest. В обоих спектрометрах использовался опорный сигнал скорости треугольной формы, сформированный цифроаналоговым преобразователем (ЦАП) с дискретизацией на 1024 шага (по 512 шагов на прямой и обратный ход движения). Измерения проводились в геометрии пропускания с движущимся источником. Каждый спектр регистрировался многоканальным анализатором с увеличенным в 2 раза временным окном по сравнению с временем, приходящимся на 1 шаг скорости, формируемым ЦАП. В результате происходило накопление спектра в 256 каналов памяти анализатора, как для прямого, так и для обратного хода движения. Для исключения искажения линии поглощения в результате процедуры фолдинга (сложения с инверсией двух частей спектра, измеренных на прямом и обратном ходе) аппроксимация проводилась только на спектрах, измеренных на прямом ходе движения (учитывалось только 250 каналов). Источник излучения – 57Со мощностью 1,8109 Бк в родиевой матрице (Ritverc GmbH, Санкт-Петербург) – находился при комнатной температуре. Статистический набор в спектрах выделенного ферритина и его фармацевтических аналогов, измеренных на спектрометре KFKI составил 1,6105 – 1,6106 импульсов в канале, соотношение сигнал-шум составило от 31 до 55. Статистический набор в спектрах, измеренных на спектрометре Wissel MDU-1200, составил 9,3106 импульсов в канале, соотношение сигнал-шум – 93 для выделенного ферритина и 8,8105 импульсов в канале, соотношение сигнал-шум – 300 для препарата Феррум Лек.

Измерения спектров с высоким скоростным разрешением проводились на автоматизированном прецизионном мессбауэровском спектрометрическом комплексе с высоким скоростным разрешением, созданном на базе высокоточного мессбауэровского спектрометра СМ–2201 (совместная разработка сотрудников УрФУ, Екатеринбург и Института аналитического приборостроения РАН, Санкт-Петербург) и модернизированного криостата с движущимся поглотителем с диапазоном температур 295–90 К (криостат – разработка НИИ физики Южного федерального университета, Ростов-на-Дону). В спектрометре СМ-2201 реализована принципиально новая система доплеровской модуляции с опорным сигналом скорости пилообразной формы, который формируется двенадцатиразрядным ЦАП (дискретизация скоростной шкалы на 4096 шагов, т.е. с рекордно высоким скоростным разрешением) путем 11-кратного интегрирования функций Уолша на периодическом временном интервале в 64 мс. Также отличительной особенностью такой системы доплеровской модуляции является использование цифро-аналоговой системы автоматического регулирования скорости движения комбинированного типа. В результате были достигнуты следующие характеристики системы доплеровской модуляции при измерении спектров стандартного поглотителя -Fe на 4096 каналов: шум сигнала скорости спектрометра составлял 1,510–3 мм/с, дрейф положения нулевой скорости был ±2,610–3 мм/с, нелинейность сигнала скорости составляла 0,01 %, систематическая ошибка установки скорости 0,025 %, температурный дрейф сигнала скорости 2,510–6 мм/с/С (при измерении спектров в меньшем скоростном диапазоне значения этих ошибок существенно меньше). Наилучший контроль изменения температуры в криостате составил ±0,2 К (см. рисунок 2.1). Новая система доплеровской модуляции позволяет делать меньший шаг приращения скорости (V в мм/с на канал) по сравнению с большинством известных спектрометров с низким скоростным разрешением, позволяющим регистрировать спектры в 256 и 512 каналов, что позволяет производить более точную настройку в резонанс и проводить более корректную аппроксимацию многокомпонентных спектров. Более детальное описание мессбауэровского спектрометрического комплекса приведено в [209, 210, 214]. Спектры измерялись в режиме постоянного ускорения с движущимся поглотителем в криостате. Данная геометрия эксперимента исключала параболическое искажение базовой линии спектра и вклад в спектр от ядер 57Fe в бериллиевом окне сцинтилляционного детектора при пилообразной форме опорного сигнала скорости. В качестве источников мессбауэровского излучения использовались источники фирмы Ritverc Gmbh (Санкт-Петербург) 57Со в матрицах хрома или родия начальной активностью 1,8109 Бк, которые находились при комнатной температуре. Амплитудные спектры источника 57Со(Rh) без поглотителя, с поглотителем – препаратом Мальтофер, с криостатом и образцом ферритина в криостате приведены на рисунке 2.2. Видно, что как ферритин, так и его аналоги являются естественным фильтром рентгеновского излучения с энергией 6,4 кэВ, что улучшает качество регистрации резонансного -излучения с энергией 14,4 кэВ.

ЭПР и магнитометрия наноразмерных «железных ядер» макромолекул ферритина и его аналогов – фармацевтических препаратов Мальтофер и Феррум Лек

Мессбауэровские спектры всех исследованных образцов были аппроксимированы суперпозицией парамагнитных компонент при Т=295 К и Т=90 К. Однако, при исследовании препарата Мальтофер (приготовлен производителем в виде раствора) в работе [70] было обнаружено, что при 87 К в мессбауэровском спектре этого препарата помимо парамагнитной компоненты присутствует магнитная компонента (см. рисунок 3.18 в) [70], характеризующая суперпарамагнитное поведение наноразмерных «железных ядер» в этом препарате. Поэтому дополнительно было проведено измерение спектров железо-полимальтозных комплексов с высоким скоростным разрешением при 90 К в скоростном диапазоне ±12 мм/с для проверки наличия магнитной компоненты [215, 230]. Результаты показали, что «железное ядро» находится в парамагнитном состоянии при этой температуре (см. рисунок 3.18 а, б). Несмотря на то, что «железные ядра» содержат ферригидрит, для которого температура Нееля близка к комнатной, в мессбауэровских спектрах при 295 и 90 К не наблюдается магнитных компонент. Поэтому появление магнитной компоненты в мессбауэровском спектре железо-полимальтозного комплекса, измеренном ранее в работе [70] при Т=87 К, может свидетельствовать о более высоком барьере энергии магнитной анизотропии «железных ядер» в этом образце препарата Мальтофер вследствие большего объема «железного ядра» (см. формулу (4) в главе 1) из-за различия технологии приготовления препаратов Мальтофер в таблетках или в растворе, либо старения препарата, приводящего к агломерации «железных ядер» в исходном растворе. Возможность влияния старения раствора железо-полисахаридного комплекса на энергию магнитной анизотропии была проверена на примере препарата Имферон (промышленное приготовление в форме раствора для инъекций) с истекшим сроком годности. На рисунке 3.19 приведены мессбауэровские спектры замороженного раствора препарата Имферон до истечения срока годности из работы [170] и после хранения в течение десяти лет в ампуле производителя при комнатной температуре, полученный в настоящей работе [231]. Появление интенсивных магнитных компонент во втором спектре свидетельствует об увеличении энергии магнитной анизотропии для «железных ядер» в препарате Имферон в результате агломерации «железных ядер» в растворе после десяти лет хранения. Наилучшая аппроксимация мессбауэровского спектра замороженного раствора препарата Имферон была достигнута при использовании суперпозиции трех дублетов (1–3), трех секстетов (4–6) и дублета (7), соответствующего примеси соединения Fe(II) (см. рисунок 3.19 б). Можно предположить, что в спектре препарата Имферон, измеренном при 90 К через десять лет, наличие трех магнитных секстетов может быть связано с по меньшей мере тремя разными

Для сравнения барьера энергии магнитной анизотропии «железных ядер» ферритина печени человека и препаратов Мальтофер и Феррум Лек были измерены мессбауэровские спектры с низким скоростным разрешением при 20 и 40 К [215, 234]. На рисунке 3.20 показаны мессбауэровские спектры этих образцов, измеренные при 20 К на прямом ходе движения. Ясно видно отличие формы спектра ферритина (преобладание парамагнитного дублета) от спектров его аналогов (преобладание магнитных секстетов). Необходимо отметить, что, поскольку измерение мессбауэровских спектров с низким скоростным разрешением проводилось в геометрии с движущимся источником, из-за разности телесного угла источник-детектор возникает параболическое искажение базовой линии спектра. Обычно с помощью фолдинга (сложение с инверсией спектров, измеренных на прямом и обратном ходе движения) это искажение частично устраняется. Однако, было показано, что процедура фолдинга не позволяет устранить такое искажение, более того характер искажения базовой линии изменяется [214, 235]. Поэтому были использованы только спектры, измеренные на прямом ходе движения с параболическим искажением базовой линии спектра, которое учитывалось при их аппроксимации. Результаты наилучшей аппроксимации мессбауэровских спектров ферритина и его аналогов приведены в таблице 3.5. Оказалось, что относительная площадь магнитной компоненты в мессбауэровском спектре ферритина при 20 К составляет 10 %, в то время как в мессбауэровских спектрах препаратов Феррум Лек и Мальтофер при 20 К суммарная относительная площадь магнитных компонент составила 86 %. Этот факт указывает на то, что барьер энергии магнитной анизотропии (KV из формулы (4) главы 1) для «железных ядер» препаратов Феррум Лек и Мальтофер выше, чем для «железных ядер» ферритина. Поэтому вероятность переориентации магнитного момента ядер 57Fe при 20 К существенно выше для ферритина, чем для его аналогов. Возможно, это отличие связано с тем, что для ферритина и его аналогов могут быть разные объемы «железных ядер» и/или различные значения константы магнитной анизотропии для ферригидрита и акагенита.

При 40 К мессбауэровские спектры препаратов Феррум Лек и Мальтофер были аппроксимированы суперпозицией пяти магнитных секстетов и двух квадрупольных дублетов, параметры которых приведены в таблице 3.5. Доля парамагнитной компоненты в обоих спектрах составила 37 %. Оценки параметров сверхтонкой структуры мессбауэровских спектров препаратов Феррум Лек и Мальтофер оказались одинаковыми в пределах ошибки. Однако значения относительных площадей соответствующих компонент спектров оказались несколько различающимися для двух препаратов. Поэтому на основании полученных результатов можно рассматривать разброс по объемам «железных ядер» в исследованных препаратах Феррум Лек и Мальтофер как схожий, что согласуется с результатами анализа мессбауэровских спектров, измеренных при 20 К.

Применение нового подхода к аппроксимации мессбауэровских спектров ферритина в бактериях A. brasilense (штамм Sp245) при 295 К в рамках модели гетерогенного «железного ядра»

Кривые намагниченности ZFC и FC для ткани печени больного лимфомой мантийной зоны, измеренные в поле Н=1 кЭ, показаны на рисунке 5.16. На кривой ZFC наблюдается отчетливый пик при Т=53 К. Интересно отметить факт пересечения кривых FC и ZFC при Т=48 К и Т=68 К, что оказалось неожиданным, поскольку в обычных условиях ZFC FC. Таким образом, в температурном диапазоне 48-68 К наблюдалось весьма редкое уникальное явление, когда ZFOFC. Для того, чтобы проверить воспроизводимость этого результата, на следующий день были проведены повторные измерения (2) при Н=1 кЭ от температуры 20 К, чтобы исключить вклад парамагнитной компоненты. В этом случае было обнаружено, что при 48 К наблюдается небольшой подъем вместо четкого пика. Также следует отметить, что ZFC(2) не пересекает кривую FC(2). Однако, обе кривые FC совпадают в пределах ошибки, из чего следует, что образец за это время не был поврежден и в нем нет остаточной намагниченности. Бифуркации кривых ZFC и FC вблизи 120 К для обоих измерений подтверждают существование очень малого количества магнетита в этом образце. При измерении кривых намагниченности при Н=2,5 кЭ оказалось, что небольшой подъем на кривой ZFC полностью исчезает. Таким образом, можно отметить две особенности: ZFOFC в определенном температурном диапазоне (очень редкое явление) и исчезновение пика при Т=53 К на кривой ZFC(2). Подобные особенности наблюдались ранее лишь в нескольких случаях для легированных (серой или бором) промышленных и синтетических аморфных углеродных материалов [267, 268], для пучков двуслойных нанотрубок [269]. Также появление области ZFOFC наблюдалось и в отсутствии углерода для мульти слоев Ni/Al на подложке БіО2 [270]. Выявленные особенности не наблюдаются при повторном измерении одного и того же образца. Появление пика при Т=53 К на кривой ZFC может быть связано с присутствием связанного кислорода на поверхности образца. Однако, пик, обусловленный влиянием кислорода, должен появляться на обеих кривых ZFC и FC [268]. Если предположить, что появление этого пика обусловлено присутствием Рез04, то этот пик также должен присутствовать и на кривой FC. Можно предположить, что данный пик является артефактом, вызванным неполадками SQUID магнетометра или нарушением оптимальных условий эксперимента. Однако все образцы измерялись в одинаковых условиях и, как видно из рисунков 5.15 и 5.17, подобный пик отсутствует. Вероятно, выявленные особенности взаимосвязаны. Если образец ткани печени больного лимфомой мантийной зоны можно представить в виде системы двух состояний, которые могут быть описаны двумя потенциальными ямами, разделенными энергетическим барьером, то существует конечная вероятность обнаружить систему в одном из состояний. Поскольку образец ткани печени больного лимфомой является негомогенным, то при первом измерении ZFC он может находиться в одном из двух магнитных состояний, приводящем к возникновению на кривой ZFC отчетливого пика при 53 К. При последующих измерениях система переходит в другое магнитное состояние, и пик не наблюдается при измерении FC и последующих повторных измерениях ZFC и FC. Однако, данные особенности требуют специального исследования, выходящего за рамки данной работы.

Чтобы проверить наличие двух обсуждаемых аномалий в образце ткани печени больного острым миелолейкозом, были проведены измерения кривых ZFC и FC, показанные на рисунке 5.17. На кривой ZFC наблюдается отчетливый пик при Т=54 К. Кривые ZFC и FC фактически сливаются при Т=120 К и выше. Однако, для образца ткани печени при остром миелолейкозе наблюдалось обычное расположение кривых намагниченности, при котором всегда FC ZFC. Оказалось, что для ткани печени при остром миелолейкозе пик на кривой ZFC при Т=54 К является воспроизводимым, в отличие от образца ткани печени больного лимфомой мантийной зоны. Очевидно, что причины появления данного пика для исследованных тканей печени больных острым миелолейкозом и лимфомой мантийной зоны имеют различную природу, которая требует дополнительных исследований

Кривые намагниченности ZFC и FC ткани печени больного острым миелолейкозом, измеренные в поле Н=1 кЭ [265]. Изотермические кривые намагниченности М(Н) образца нормальной печени человека, измеренные при 25 и 255 К, приведены на рисунке 5.18 и могут быть описаны по формуле: М(Н) = Ms + XdH, (10) где Ms - магнитный момент насыщения, обусловленный спонтанной ферромагнитной намагниченностью, XdH=-2,5xlCT эме/г - линейная диамагнитная восприимчивость. При 25 К значение Ms=0,017±0,001, а при 255 К Ms=0,012±0,001 эме/г. Полученные значения Ms можно связать с присутствием очень малого количества ферримагнитной фазы с температурой магнитного упорядочения выше комнатной. Если предположить, что такой фазой является магнетит РезС 4, для которого Тс=853 К, Ms=96 эме/г [271], то доля этой фазы в образце нормальной ткани печени составит —1,5x10 %, что ниже пределов чувствительности мессбауэровской спектроскопии.

Изотермические кривые намагниченности М(Н), измеренные при 25 К, для ткани печени больного лимфомой мантийной зоны схожи с кривой намагниченности для образца ткани печени в норме и отличаются от кривой намагниченности М(Н) для образца ткани печени больного острым миелолейкозом (рисунок 5.19). Используя формулы (9) для зависимости М(Т) и (10) для М(Н) образца ткани печени больного лимфомой мантийной зоны, можно получить следующие значения: хо=3,Зх10 эме/(гхЭ), С=4,44(1)х10 эмехКУ(гхЭ) и 0=-6,7(3) К, Ms=0,033(l) эме/г при Т=25 К и Ms=0,021(l) эме/г при Т=255 К (что соответствует доле предполагаемого магнетита Зх10 %). Полученные величины С и Ms для образца ткани печени больного лимфомой мантийной зоны оказались больше, чем для ткани печени в норме, что может быть связано с большим содержанием ионов железа в парамагнитной фазе/фазах, а также с более высокой концентрацией магнетита.