Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Литературный обзор. Структура и физико-химические свойства гуминовых кислот
1.1. Структура и свойства гуминовых кислот
1.2. Полидисперсность гуминовых кислот
1.3. Проявление структурных свойств гуминовых кислот во флуоресцентной и абсорбционной спектроскопии
1.4. Взаимодействие гуминовых кислот с ионами тяжелых металлов
1.5. Взаимодействие модельных молекул с ионами тяжелых металлов 7
1.6. Заключение к главе 1 53 53 54
Постановка задачи
Глава 2. Объекты и методы исследования
2.1. Исследуемые объекты и методика приготовления растворов
2.2. Экспериментальные установки и их характеристики
2.3. Методика обработки экспериментальных данных
2.4. Эффект внутреннего фильтра в спектрах флуоресценции
2.5. Заключение к главе 2 66 73 73
Глава 3. Исследование концентрационной зависимости структурных свойств гуминовых кислот в водных растворах
3.1. Концентрационная зависимость спектров флуоресценции гуминовых кислот
3.1.1. Эксперимент
3.1.2. Обсуждение
3.1.2.1. Образование эксимеров
3.1.2.2. Образование жестких сфероколлоидов в результате скручивания мономеров
3.1.2.3. Образование ассоциатов.
3.1.3. Природа сдвига спектров флуоресценции фракций
гуминовых кислот. 75
3.1.3.1. Конформационные изменения флуорофора 76
3.1.3.2. Влияние изменения полярности микроокружения хромофора на величину первого момента спектров
флуоресценции гуминовых кислот 77
3.2. Исследование влияния ассоциации на структуру гуминовых кислот методом флуоресценции 81
3.2.1. Эксперимент 82
3.2.1.1. Спектры поглощения и флуоресценции гуминовых кислот 82
3.2.1.2. Концентрационные зависимости тушения флуоресценции гуминовых кислот ионами Cd2+ 83
3.2.2. Обсуждение 86
3.2.2.1. Структура гуминовых кислот при ассоциации 86
3.2.2.2. Делокализация флуорофоров при ассоциации 87
3.2.2.3. Природа интенсивности флуоресценции фракций гуминовых кислот 87
3.3. Заключение к главе 3 89
Глава 4. Изучение полидисперсности гуминовых кислот методом флуоресценции 91
4.1. Изучение полидисперсности гуминовых кислот по эффективности тушения флуоресценции гуминовых кислот ионами тяжелых металлов 91
4.1.1. Спектральная зависимость констант тушения флуоресценции гуминовых кислот ионами Cu2+ 91
4.1.1.1. Влияние рН на интенсивность флуоресценции гуминовых кислот в присутствии ионов Cu2+ 93
4.1.1.2. Спектральные зависимости констант тушения Штерна Фольмера 93
4.1.2. Спектральные зависимости тушения флуоресценции гумино вых кислот и модельных молекул ионами металлов 98
4.1.3. Сравнение спектральных зависимостей эффективности тушения флуоресценции гуминовых кислот ионами Cd2+ и Cu2+ 101
4.2. Заключение к главе 4 106
Глава 5. Спектральная зависимость эффективности самотушения флуоресценции гуминовых кислот 108
5.1. Концентрационная зависимость интенсивности флуоресценции гуминовых кислот 108
5.2. Спектральная зависимость констант самотушения гуминовых кислот 117
5.3. Заключение к главе 5 127
Глава 6. Возможности метода абсорбции для изучения взаимодействия молекул гуминовой кислоты с ионами тяжелых металлов 129
6.1. Влияние гуминовых кислот на структуру водных растворов 129
6.2. Проявление взаимодействия гуминовых кислот с ионами тяжелых металлов в спектрах поглощения 133
6.3. Заключение к главе 6 135
Глава 7. Изучение межмолекулярного взаимодействия производных салициловой кислоты как модельных молекул для гумино вых кислот с ионами тяжелых металлов методами абсорбции и флуоресценции 136
7.1. Исследование самоассоциации производных салициловой кислоты в водных растворах методами абсорбции и флуоресценции 136
7.1.1. Спектры поглощения 137
7.1.2. Спектры флуоресценции 141
7.2. Межмолекулярное взаимодействие производных салициловой кислоты с ионами тяжелых металлов 148
7.2.1. Исследование межмолекулярного взаимодействия производных салициловой кислоты с ионами Cu2+ в водных растворах методом тушения флуоресценции 148
7.2.2. Оценка коэффициента молярного поглощения спектра салицилата меди в ультрафиолетовой области 153
7.2.3. Особенности взаимодействия производных салициловой кислоты с ионами тяжелых металлов по данным
УФ-спектроскопии 158
7.3. Влияние кислотно-щелочного равновесия на взаимодействие производных салициловой кислоты с ионами Cd2+ 161
7.3.1. Предварительные замечания 161
7.3.2. Изучение эффективности взаимодействия производных салициловой кислоты с ионами Cd2+ в зависимости от водородного показателя методом абсорбции 162
7.3.3. Изучение эффективности взаимодействия производных салициловой кислоты с ионами Cd2+ в зависимости от водородного показателя методом флуоресценции 167
7.4. Заключение к главе 7 172
Основные результаты и общие выводы 175
Литература
- Проявление структурных свойств гуминовых кислот во флуоресцентной и абсорбционной спектроскопии
- Экспериментальные установки и их характеристики
- Исследование влияния ассоциации на структуру гуминовых кислот методом флуоресценции
- Влияние рН на интенсивность флуоресценции гуминовых кислот в присутствии ионов Cu2+
Введение к работе
Актуальность темы. Гуминовые вещества (ГВ), в частности, гумино-вые кислоты (ГК) представляют собой наиболее обширный и реакционно-способный класс природных соединений, входящих в состав органического вещества почв, природных вод и воздуха (в форме аэрозолей).
Наличие в макромолекулах гуминовых кислот многочисленных функциональных групп (катехины, хиноны, фталаты, феноламины, салицилаты и т.д.) обуславливает их способность вступать в ионные и донорно-акцепторные взаимодействия, образовывать водородные связи и определяет их высокую реакционную способность по отношению к металлам. Благодаря этому свойству ГК сохраняют и накапливают элементы питания живых организмов, связывают токсичные и радиоактивные элементы в малоподвижные соединения, играют важную роль в процессах миграции тяжелых металлов, контролируя их потоки в окружающей среде и снижая токсичность тяжелых металлов [1,2].
Гуминовая кислота в различных ситуациях может себя вести как акцептор электронов, так и как донор. Это делает ГК мощным антиоксидантом, ловушкой свободных радикалов. Гуминовые препараты благодаря своей натуральности абсолютно безвредны, их применение не вызывает аллергии, или других побочных эффектов. При этом препарат не всасывается в кровь и понижает уровень холестерина. В связи с этим создание различные лекарственные препараты на основе ГК представляется очень перспективным.
В связи с нерегулярностью структурных элементов в периферических цепях ГК обладают уникальным свойством – полидисперсностью. Свойство полидисперсности макромолекул гуминовых кислот является их принципиально фундаментальным свойством, которое может позволить идентифицировать различные образцы ГК.
Для получения информации о структурных свойствах ГК применяются многочисленные физические методы [1] , и, в частности, такой метод молекулярной спектроскопии, как флуоресценция. В настоящее время флуорес-3
центная спектроскопия является одним из наиболее информативных и наиболее распространнных методов молекулярной спектроскопии для получения информации о структурных свойств ГК [3-9].
В молекулярной спектроскопии свойство полидисперсности наджно установлено. Оно проявляется в неоднородной природе контура спектров поглощения, флуоресценции и возбуждения. Тем не менее развитие новых подходов для изучения спектральных проявлений степени неоднородности является актуальным, и может служить инструментом исследования не только ГК, но и любых объектов, имеющих неоднородную природу контура спектров флуоресценции.
До последнего времени отсутствовал прямой экспериментальный подход, с помощью которого методом флуоресценции можно было бы наглядно оценить степень полидисперсности макромолекул ГК и определить число компонент в спектре флуоресценции, используя источник возбуждения спектра флуоресценции с одной длиной волны.
Кроме того из-за ряда систематических физических погрешностей, которые могут иметь место при записи спектров флуоресценции ГК, получение наджных результатов о макроструктуре гуминовых кислот становится зачастую затруднительным. Эти погрешности прежде всего связаны с наличием такого физического фактора как эффекты внутреннего фильтра (ЭВФ) [10, 11]. Эффекты внутреннего фильтра заключаются в том, что величина оптической плотности на длинах волн возбуждения и наблюдения флуоресценции зависит от концентрации. В результате этого происходит искажение истинных значений интенсивностей и формы контуров спектров флуоресценции.
Исследования в рамках вышеперечисленных физических задач представляет интерес, поскольку их решение позволит получать наджную информацию о таких физико-химических свойствах макромолекул ГК, как их степень полидисперсности, эффективность их взаимодействия при самоассоциации и при взаимодействии с ионами металлов.
Цель работы заключалась в развитии и применении новых молекулярно-спектроскопических подходов к изучению структурных свойств макромолекул ГК и, в частности, изучению свойств полидисперсности ГК при возбуждении е спектра флуоресценции монохроматическим светом.
Задачи исследования.
Для выполнения поставленной цели необходимо было решить следующие физико-математические и физико-химические задачи:
-
Разработка и создание методики наблюдения флуоресценции ГК с максимальным светосбором при возбуждении монохроматическим светом на базе монохроматора ДФС-12 с максимальным соотношением сигнал/шум.
-
Расчет и экспериментальная проверка геометрических параметров возбуждающего света для получения корректных спектров флуоресценции при лазерном возбуждении.
-
Систематическое изучение концентрационной зависимости спектров флуоресценции для разных по молекулярному весу фракций ГК.
-
Определение возможности метода спектральной зависимости эффективности тушения флуоресценции (СЗЭТФ) ГК ионами металлов для получения информации о степени полидисперсности образцов ГК.
-
Изучение процессов самоассоциации макролекул ГК с использованием метода СЗЭТФ.
-
Сравнение полидисперсных свойств и эффективности процессов взаимодействия макромолекул ГК и производных салициловой кислоты, как модельных молекул, с ионами тяжелых металлов.
-
Сравнение влияния процессов самоассоциации на спектры поглощения и флуоресценции ГК и их модельных аналогов.
Научная новизна работы:
1. Разработан математический подход, позволяющий по величине поглощения и геометрии возбуждающего света определять условия получения корректных спектров флуоресценции.
-
Впервые корректно изучена концентрационная зависимость спектров флуоресценции разных по молекулярному весу фракций гуминовых кислот (ГК) в водных растворах.
-
Впервые применен метод Штерна-Фольмера для изучения особенностей изменения структуры макромолекул ГК при их ассоциации.
-
Предложен новый метод для изучения дисперсных свойств ГК, заключающийся в изучении спектральной зависимости констант тушения флуоресценции. Предложенный метод позволяет без специального математического аппарата выявить полидисперсные свойства макромолекул ГК при возбуждении ее спектра флуоресценции монохроматическом светом.
-
С использованием метода СЗЭТФ получена информация об изменении состояния флуорофоров, входящих в состав ядерных и периферийных сайтов ГК в процессе самоассоциации.
-
На молекулах производных салициловой кислоты ПСК (модельные аналоги ГК) с помощью методов абсорбции и флуоресценции продемонстрировано проявление эффективности межмолекулярного взаимодействия как при самоассоциации, так и при взаимодействии их с ионами металлов. Показана зависимость этого взаимодействия от величины рН.
Практическая значимость результатов: 1. Установленное соотношение между расстоянием от центра лазерного луча до выходной стенки рабочей кюветы, диаметром лазерного луча и оптической плотности, при которых исключаются погрешности от эффекта внутреннего фильтра, является методической разработкой, зачастую обязательной для практики флуоресцентной спектроскопии.
2. Для решения задач в области фундаментальной науки предложенный
метод СЗЭТФ может получить дальнейшее развитие не только для изучения
полидисперсных свойств ГК, но и для изучения неоднородной природы спек
тров флуоресценции любых молекул (белков, компонентов крови и т.д.).
3. При решении прикладных задач дальнейшее развитие метода СЗЭТФ
позволит получать новую информацию о физико-химических свойствах мак-6
ромолекул ГК и их производных. Это представляется чрезвычайно важным в связи с развитием производства солей ГК – гуматов, которые в настоящее время широко применяются в медицине (лекарства), сельском хозяйстве (удобрения) и т.д.
Выносимые на защиту положения:
-
Соотношение для учта внутреннего фильтра, позволяющее вычислять зависимость интенсивности флуоресценции в поглощающей среде от диаметра лазерного луча, от расстояния центра лазерного луча до выходной стенки кюветы и величины оптической плотности.
-
Метод определения степени полидисперсности образцов гуминовых кислот по спектральной зависимости эффективности тушения флуоресценции.
-
Различие природы взаимодействия ядерных и периферических сайтов ГК при самоассоциации и зависимость этого взаимодействия от величины молекулярной массы.
4. Эффективности взаимодействия ядерных и периферических частей
ГК при самоассоциации зависят от величины молекулярной массы.
5. Отсутствие спектрального проявления полидисперсности образцов
производных салициловой кислоты (ПСК) как модельных молекул ГК.
Достоверность результатов подтверждается использованием стандартных методик, общепринятой калибровкой измерительной аппаратуры, воспроизводимостью результатов в широком диапазоне внешних условий, совпадением экспериментальных результатов контрольных экспериментов с данными других авторов.
Личный вклад автора является определяющим в постановке задач, планировании экспериментов, проведении измерений и расчтов, анализе и интерпретации результатов, подготовке и написании публикаций.
Апробация работы. Основные результаты работы докладывались на:
Республиканской научно-технической конференции «Проблемы физики
прочности и пластичности и физики жидкого состояния» (Душанбе,1995);
Международной научной конференции «Координационные соединения и ас-7
пекты их применения» (Душанбе, 1997); III Всероссийской конференции «Гуминовые вещества в биосфере» (Россия, Санкт - Петербург, 2005); Международной конференции по химической физике (Армения, Ереван, 2008); Международной конференции по химической биологии и фундаментальным проблемам бионанотехнологии (Россия, Новосибирск, 2009); International Conference “Organic nanophotonics”(Russia,Sankt-Peterburg, 2009); XXII Симпозиум «Современная химическая физика» (Россия, Туапсе, 2010); XXV In-ternationalen Сonference on Photochemistry.China, 2011); Международной конференции «Современные вопросы молекулярной спектроскопии конденсированных сред» (Таджикистан, Душанбе, 2011); Russian-Chinese Workshop on Environmental Photochemistry (Russia, Novosibirsk, 2012); 5th International conference ecological chemistry (Moldova, Chisinau, 2012); Второй международной конференции по гуминовым инновационным технологиям «Природные и синтетические наночастицы в технологиях очистки вод и почв» (Россия, Москва, 2012); VIII Voevodsky Conference "Physics and Chemistry of Elementary Chemical Processes" (Russia, Novosibirsk, 2012); VIII Международной научно-технической конференции (Россия, Тула, 2013); VI Всероссийской научной конференции с международным участием «Гуминовые вещества в биосфере» (Россия, Сыктывкар, Республика Коми, 2014); XIV Всероссийской научно-технической конференции (Россия, Тула, 2014); XXVI Симпозиуме «Современная химическая физика» (Россия, Туапсе, 2014); Third International Conference of CIS IHSS on Humic Innovative Technologies.Tenth International Conference daRostim.«Humic Substances and Other Biologically Active Compounds in Agriculture» HIT-daRostim-2014 (Russia, Moscow, 2014); V съезде биофизиков России (Россия, Ростов-на Дону, 2015); XXVIII Симпозиуме «Современная химическая физика» (Россия, Туапсе, 2016); научных семинарах ИХКиГ СО РАН, ФТИ им. С.У.Умарова АН РТ, физического факультета Таджикского национального ниверситета и ежегодных научных апрельских конференциях Таджикского национального университета.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 43 научных труда, в том числе 22 статьи, 19 из которых в рецензируемых журналах из Перечня ВАК РФ, 3 в сборниках и 21 статья в сборниках трудов конференций.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, 7 глав, выводов и списка литературы, включающего 285 работ. Диссертация изложена на 209 страницах, проиллюстрирована 56 рисунками и 5 таблицами.
Ключевые слова: гумины, флюоресценция, абсорбция, спектр, тушение, интеркомбинационный переход, спектральная зависимость, полидисперсность, тяжлые металлы, эффект внутреннего фильтра.
Проявление структурных свойств гуминовых кислот во флуоресцентной и абсорбционной спектроскопии
Для всех ГК существует единый, вне зависимости от источников происхождения, принцип строения. Имеется ядро (негидролизуемое)-ароматический углеродный скелет, замещенный функциональными группами. Среди заместителей преобладают карбоксильные, гидроксильные, метоксиль-ные и алкильные группы. Ядро окружено периферическими (гидролизуе-мыми) цепями, обогащенными полисахаридными и полипептидными фрагментами [1]. Молекулярные фрагменты ядра и периферии одной молекулы ГВ связаны химическими связами. Носителями специфических свойств ГВ являются конденсированные ароматические ядра, соединенные между собой ковалентными связами. Периферические нерегулярные структурные элементы (периферические цепи) являются переменными компонентами, следовательно, ГК представляет собой заряженный полимер (полианион). По этой причине ГВ одни из самых сложных по строению природных орга нических соединений.
Наличие таких групп как карбоксильная, гидроксильная, карбонильная в сочетании с присутствием ароматических структур обеспечивает способность гумусовых кислот вступать в ионные и донорно-акцепторные взаимодействия, образовывать водородные связи, участвовать в сорбционных процессах. Гумусовые кислоты хорошо связывают воду, способны к ионному обмену, образуют комплексы с ионами тяжелых металлов и с различными органическими соединениями [2]. Обладая указанными свойствами, гумусовые кислоты выполняют в биосфере множество важных функций. К их числу относятся структурирование почвы [1,18], накопление химических элементов и микроэлементов в доступной для растений форме [19], регулирование геохимических потоков металлов в водных и почвенных экосистемах [17, 19-22].
По элементному составу можно получить только общее представление о типе строения ГК или о соотношении линейных алифатических и циклических компонентов. В определении конкретных структур, лежащих в основе молекул ГК, основным приемом остается метод деструкции. Этот метод позволяет выявить набор структурных фрагментов, из которых состоят гуминовые кислоты. Применяется два метода: относительно мягкий- гидролиз растворами кислот или щелочей; жесткий-окисление ГК перманганатом калия или оксидом меди в щелочной среде. Методом гидролиза изучают периферическую или гидролизуемую часть ГК. Методом окисления- не-гидролизуемую часть (ядро) гуминовой кислоты. При гидролизе в раствор переходят, отделившись от ГК, низкомолекулярные фрагменты, аминосаха-ра и моносахариды. Выход аминокислот при гидролизе ГК почв составляет 6-10% от их общей массы, при этом наиболее высоким содержанием аминокислот характеризуются черноземы [1, 3]. В составе аминокислот чаще всего встречаются аспарагиновая (HOOC-CH2-CHNH2-COOH), глютаминовая (HOOC-CH2-CH2-CHNH2-COOH) кислоты, глицин (HOOC-CH2NH2) и ала-нин (H3C-CH-NH2-COOH). Значительная часть аминокислот присутствует в составе благодаря пептидным связям [1, 3]. Продуктом окисления ГК являются бензолполикарбоновые кислоты. Главным компонентом продуктов деструкции являются три -,тетра- и пентакарбоновые кислоты и некоторые ок-сибензойные кислоты [23,24]. Получение новой информации о составе ядра и периферической части ГК с помощью деструктивного метода является важным инструментом для глубокого понимания принципов строения ГК Кроме этого, для получения информации о структуре ГК используется спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР) на ядрах 1H и 13С Спектроскопия ЯМР позволяет получать более полную корректную структурную информацию как в качественном, так и в количественном аспектах [2, 23].
Один из основных способов использования данных об элементном, структурно-групповом и молекулярно-массовом составе для описания строения ГК является расчет средних структурных формул на их основе. Но решение вопроса о структуре ГК оказалось очень трудным вследствие полидисперсности ГК и их переменного состава.
В общих схемах строения обычно рассматриваются две важные составные части молекул ГК. Специфическое строение периферической и не-гидролизуемой частей молекул гуминовых кислот выражается в описании их структуры при помощи блок-схем. Одна из первых блок-схем была предложена в [25]. Согласно этой схеме, молекула ГК содержит ядро, в которое входят ароматическое кольца, хиноны, кислород и азотсодержащие гетеро-циклы, гидроксильные, карбоксильные и карбонильные группы Ядро окружено периферическими алифатическими цепями, в том числе углеводного и полипептидного характера. За счет комплексообразования и сорбции гуми-новая кислота содержит также минеральные компоненты, в первую очередь оксиды кремния, железа, алюминия, кальция, фосфаты. Эта схема удобна для общей характеристики, но не позволяет объяснить способность гумино-вых кислот участвовать в химических реакциях [3].Схема строения структурной ячейки гуминовых кислот, предложенная в [15], может рассматривать как оптимальный вариант. Данная структурная ячейка представляет собой минимальную по размеру молекулу, которая содержит все важные структурные фрагменты. Подробно приводятся характерные фрагменты не-гидролизуемой части молекулы и типичные способы их соединения, а гид-ролизуемая периферия дана в виде набора структурных компонентов. Состав и строение структурных ячеек, из которых сложена вся молекула, могут варьировать. Схема хорошо объясняет конформационные особенности молекул и другие свойства ГК (рис.1.2).
Экспериментальные установки и их характеристики
В качестве эталона EXAFS были использованы образцовые системы (Cu2- вода и комплексы эфира салициловой кислоты). На основе несходства спектров EXAFS для комплексов {Cu2+ + тетрагидрофурантетракар-боксиловая кислота} с комплексами {Cu2 + + гуминовое вещество} сделано заключение, что сайты комплексообразования гуминовых веществ не содержат карбоксильные группы, связанные с кольцом фурана. Расстояние Сu-O во всех комплексах {Cu2 +-гуминовое вещество} было более коротким, чем то же расстояние в комплексах с эфиром салициловой кислоты или водой. Сокращение расстояния Сu-O было особенно видно для осевого направления. Среднеквадратические значения для осевых пар Сu-O в комплексах {Cu2 + - гуминовое вещество} указывают на то, что осевые атомы кислорода связаны с центральным катионом более сильно, чем в комплексах с водой или салициловой кислотой, образуя шестизубчатую координационную связь Cu2 + - гуминовое вещество.
Комплексообразование Al3+ и некоторых тяжелых металлов с гумусовыми веществами различного происхождения с помощью методов гель-хроматографии, спектрофотомерии и флуоресцентного анализа изучено в [116, 117]. Показано, что ионы Al3+ активно связываются в комплексы с ГВ. Установлено образование двух типов комплексных соединений, отличающихся между собой устойчивостью: более слабые и достаточно прочные комплексы. Комплексообразование Al3+, как и других металлов, зависит от водородного показателя pH системы. В работах [53, 118, 119] исследовано образование комплексов гуминовых кислот с ионами Cu2 + и Pb2 + при разных pH. Показано, что гуминовая кислота проявляет большую способность к комплексообразованию с ионами Pb2 + и меньшую с ионами Cu2 +. В [113, 120] методом спектроскопии синхронной флуоресценции изучено взаимодействие Fe3+ с фульвокислотой при разных pH. Вычисленые значения константы устойчивости (при pH=3, LogKcs=4,9; pH=4, LogKcs=4,7; pH=5, LogKcs=5.1; pH=6, LogKcs=5.1) показывают, что фульвокислоты образуют более устойчивые комплексы с Al3+ в кислотном диапазоне pH.
Для определения константа связывания комплексов гумусовых кислот с ионами металлов используются методы гель-хроматографии [121, 122], ультрафильтрации [121, 123], тонкослойной хроматографии [121], обращено-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ-ВЭЖХ) [124, 125], диализа [126, 127], жидкостной экстракции [128-130], тушения [46,59], поляризации флуоресценции [131], методы, основанные на изменении водной растворимости [75]. Наиболее часто используемыми методами определения коэффициента связывания являются диализ, тушение флуоресценции и ОФ-ВЭЖХ. Большинство из этих методов предполагает разделение свободной и связанной форм металлов, что может вносить погрешности в определение констант связывания. Более предпочтительными для определения коэффициента связывания являются методы, позволяющие определять концентрацию свободных и связанных ионов металлов без их предварительного разделения.
Одним из широко применяющихся для этой цели методов является метод тушения флуоресценции. Метод тушения флуоресценции основан на измерении спада интенсивности флуоресценции ГК в присутствии тушителя (ионов тяжелых металлов). При этом механизм тушения флуоресценции может быть динамическим и статическим. Динамическое тушение обусловлено столкновением тушителя и флуорофора в результате диффузии в течение времени жизни возбужденного состояния. В результате контакта флуо-рофор возвращается в исходное состояние без излучения фотона. При статическом тушении между флуорофором и тушителем в основном состоянии образуется не флуоресцирующий комплекс [58]. На основе информации о типе тушения можно сделать предположение о механизме взаимодействия между флуорофором и тушителем. Для идентификации механизмов тушения можно использовать зависимость тушения флуоресценции от температуры и вязкости растворов, изменение спектров поглощения флуорофоров и времени затухания флуоресценции в отсутствие и в присутствие тушителя. Статическое тушение флуоресценции обусловлено только несвязанными в комплекс флуорофорами и, следовательно, о / = 1. Для динамического тушения наблюдается пропорциональное уменьшение интенсивности (I) и времени затухания флуоресценции I= [58].
Для количественной оценки константы связывания гумусовых кислот ионами тяжелых металлов с использованием метода тушения флуоресценции используют уравнение Штерна-Фольмера [55, 58, 73]. В работах [136, 137] методами флюоресценцной и инфракрасной спектроскопии исследована способность гуминовой кислоты образовывать комплексы с различными металлическими ионами (Cu2 +, Al3+, Mg2 +, и Mn2+). Используя уравнение Штерна-Фольмера, авторы вычислили константы комплексообразования гуминовой кислоты с металлами. Спектроскопические данные показывает, что металлы связываются с гуминовыми кислотами посредством карбоксильных кислотных сайтов и группы ОН. Показано, что ионы Cu2 +, А13+ и Mn2+ тушат, а ионы Mg2 + не тушат флуоресценцию. Для ионов Cu2 +, А13+ и Мп2+ коэффициент тушения Kq составляет 1904 литр/моль, 426 литр/моль и 227 литр/моль соответственно. Видно, что ионы Си2 + имеют белее высокую чем ионы Al3+ и Mn2+ способность образовывать комплексы с гуминовой кислотой.
Исследование влияния ассоциации на структуру гуминовых кислот методом флуоресценции
Как видно из сравнения спектров флуоресценции, точный учёт поправки на ЭВФ приводит к заметному уменьшению интенсивности спектра флуоресценции. Это объясняется тем, что положение центра активной зоны при наличии поглощения находится не на расстоянии a, а на расстоянии aэфф = a - ( 0), т.е. флуоресцирующий объём для наблюдателя эффективно оказывается на меньшем расстоянии и поэтому величина корректирующей поправки, учитывающей ЭВФ, становится меньше, чем вычисленная с помощью закона БЛБ. Таким образом, учёт ЭВФ с помощью закона БЛБ для данного образца и в данных экспериментальных условиях приво дит к завышению величины интегральной интенсивности (6.7 %). Не учёт корректирующей поправки на ЭВФ приводит, соответственно, к некорректным значениям и других параметров спектра флуоресценции. В частности, для изученного образца ГК различие в величинах первого момента экспериментально измеренного спектра и спектра с учётом поправки на ЭВФ по формуле (2.10) составляет 7 нм.
Корректность предлагаемого расчёта поправки на ЭВФ можно проверить, сравнивая величины оптической плотности С, полученной на стандартной абсорбционной аппаратуре и с помощью флуоресцентного эксперимента. Для определения величин оптических плотностей С, используя метод флуоресценции, можно воспользоваться следствием проведённых расчётов. Оказалось, что отношение р-отношение регистрируемых интен-сивностей флуоресценции при возбуждении светом лазера на расстояниях at = R+Ai и cij = R+ Aj соответственно, не зависит от і? и хорошо совпадает (с точностью 10 9) с величиной Д вычисленной с помощью простейшей модели бесконечно тонкого луча P = I/ Ii = 10 -sC (AjA)i, (2.11) т.е. эффекты внутреннего фильтра не влияют на величину Д. Следует заметить, что выражение (2.11) получается аналитически, если гипотетически представить, что возбуждающий луч в сечении имеет форму квадрата. Из (2.11) можно получить IgP = lg((I (aj) / I (at)) = -sCAa (2.12)
Отсюда, экспериментально измерив зависимость lg3 от величины а, из тангенса угла наклона этой зависимости определяем значения С. При необходимости можно вычислить значения коэффициентов экстинкции Є, зная величину С.
Возможность использования формулы (2.12) для получения данных о величинах экстинкции и, соответственно, корректность предлагаемого подхода для расчёта поправки на ЭВФ были проверены на образце гуминовой кислоты. Были изучены зависимости величины lg/З от Аа для длин волн флуоресценции 440 и 490 нм. Полученные величины С составили 0.084 ± 0.002 см-1 и 0.06 ± 0.002 см-1 для 440 и 490 нм соответственно.Эти значения практически совпали с данными, полученными на спектрофометре «Хью-летт Паккард» - (0.082 ± 0.001) см-1 и (0.056 ± 0.001) см-1. Однако наблюдается небольшое систематическое различие в сравниваемых дан-ных:величины С, полученные с помощью флуоресцентного метода, имеют большие значения, чем полученные спектрофотометрически. Это различие (от 2 до 7%), по-видимому, может быть связано со следующим: 1. сечение возбуждающего луча лазера по плотности света было не однородным, а представляло собой сечение тора; 2. переизлучение флуоресценции, от которого невозможно избавиться, если оно имеет место.
Наличие второго фактора всегда будет давать меньшие значения оптической плотности, чем значения, полученные с помощью абсорбционной спектроскопии, поскольку за счёт переизлучения эффективная длина пассивной зоны уменьшается. Тем не менее, величины оптических плотностей, полученные различными методами достаточно близки, что может свидетельствовать о правильности предлагаемого подхода для вычисления поправок на ЭВФ.
Достоверность результатов и сделанных на их основе физических выводов определяется точностью экспериментально измеряемых величин, характеризующих конденсированные среды и происходящие в них процессы. В работе использованы высококачественные и чувствительные спектральные приборы и хорошо апробированная методика измерения спектров. Определены спектральные характеристики полос, оценена точность измеряемых величин. В результате получено большое количество экспериментальных данных и произведён расчет параметров на их основе Точность и достоверность данных ограничена лишь пределами незначительных ошибок измерений.
Разработан математический подход, позволяющий определять условия получения корректных спектров флуоресценции по величине поглощения и геометрии возбуждающего света. Показано, что для учёта эффектов внутреннего фильтра в испускании флуоресценции необходимо учитывать размер диаметра лазерного луча, расстояние от центра лазерного луча до выходной стенки кюветы и величины оптической плотности. Для учёта внутреннего фильтра в испускании флуоресценции получено соотношение, позволяющее вычислять зависимость интенсивности флуоресценции в поглощающей среде от диаметра лазерного луча, расстояния центра лазерного луча до выходной стенки кюветы и величины оптической плотности. С её помощью вычислены поправки, позволяющие учесть эффект внутреннего фильтра для испускания флуоресценции в условиях конкретного эксперимента. Проведено сравнение этих результатов с расчётами, полученными в предположении бесконечно узкого возбуждающего луча, когда учёт ЭВФ можно строго проводить, используя закон Бугера-Ламберта-Бера. Сравнение полученных данных показало, что в условиях высокой оптической плотности образца размер возбуждающего луча может вносить заметные искажения в наблюдаемый контур флуоресценции.
Влияние рН на интенсивность флуоресценции гуминовых кислот в присутствии ионов Cu2+
Полярность микроокружения (среды) влияет на положение спектра флуоресценции [58, 72]. Это связано с тем, что уровни энергии основного и возбуждённого состояний, между которыми происходит радиационный переход, в зависимости от поведения полярности микроокружения претерпевают разные сдвиги. Изменение положения спектра флуоресценции в зависимости от полярности среды зависит от типа электронного перехода: при росте полярности окружения флуорофора его спектр флуоресценции претерпевает батохромный сдвиг, если он определяется переходом 71 - л типа. Гипсохромный сдвиг происходит в том случае, если спектр определяется флуорофорами с переходом и-ти типа [58, 72]. Следует заметить, что специфическое донорно-акцепторное и электростатическое взаимодействия и образование Н-связей флуорофора одной молекулы с полярной группой другой молекулы также приводят к батохромному сдвигу спектров флуоресценции ГК, если он имеет место переход ти - ти типа и к гипсохромному сдвигу, если он имеет место переход п - ти типа [58]. Конкретных указаний на тип флуорофоров, которые обусловливают флуоресценцию макромолекул ГК, в литературе нет. На этот счёт имеются лишь общие соображения о том, что флуоресценция ГК в видимой области может быть обусловлена как ти - ти , так и п - ти типами электронных переходов [4, 50].
Таким образом, в рамках модели образования ассоциатов факторы конформационного изменения структуры гуминовых кислот и изменения полярности микроокружения флуорофора можно объяснить наблюдаемые концентрационные зависимости величин М\. Наличие двух факторов не позволяет делать однозначные выводы о характере конкретных структурных изменений в водных растворах ГК. Например, если изменения интенсивности флуоресценции ГК определялись бы только изменениями полярности микроокружения, то при правильности выбранной нами модели агрегации ГК и учёте того, что квантовые выходы флуоресценции флуорофоров, имеющих переходы - типа значительно выше, чем квантовые выходы флуорофоров, имеющих переходы п- типа [58, 72], из батохромного сдвига спектра флуоресценции при росте концентрации ГК можно было бы сделать вывод, что большая часть флуорофоров в структуре ГК находится в полярном окружении. Действительно в этом случае флуорофор, находившийся в полярной части молекулы, окажется в ещё более полярном микроокружении, а флуорофор, находящийся в неполярной части, попадёт в ещё более неполярное микроокружение. Соответственно спектр флуоресценции «первых» будет претерпевать батохромные сдвиги, а спектр «вторых»- гип-сохромные сдвиги. Поскольку экспериментально наблюдается суммарное изменение спектра флуоресценции при изменении состояния всех флуоро-форов, то общее изменение спектра будет обусловлено компонентой с большей интенсивностью, т.е. компонентой, претерпевающей батохромный сдвиг или находящейся в полярной части макромолекулы ГК.
Однако такое важное заключение не может считаться корректным, поскольку исходная предпосылка не принимала во внимание возможное влияние структурного фактора. Действительно, знак влияния каждого из факторов может быть противоположным, а поскольку оба имеют место одновременно, то в результате влияние каждого из них может вуалироваться, а общее влияние даже может быть вообще не регистрируемым. В связи с этим наблюдение заметного батохромного сдвига спектра флуоресценции в диапазоне концентраций 0–5 мг/л для всех фракций может являться лишь одним из возможных частных случаев наблюдения концентрационного изменения спектра флуоресценции ГК (например, только конформационные изменения). Другой частный случай (независимость величины М1 от концентрации ГК при СГК 10мг/л) реализуется для не фракционированного образца ГК и фракции B+С. Для этих образцов, кроме предложенной ранее интерпретации независимости М1 от концентрации, возможна и такая, согласно которой, суммарное действие обоих факторов в этой области концентраций отсутствует.
Можно полагать, что в случае, когда фактор изменения структуры ГК с ростом концентрации будет превалирующим во влиянии на спектр флуоресценции, то будут наблюдаться и гипсохромные сдвиги. Гипсохромных сдвигов возможны и в случае, если флуорофоры находятся преимущественно в неполярной части ГК, а фактор влияния деформации структуры ГК на флуорофор либо мал, либо приводит к гипсохромному сдвигу спектра флуоресценции. Наконец, возможна ситуация, когда зависимость величины М 1 от концентрации ГК будет не монотонна. Например, это будет в случае, если влияние первого фактора «положительно» и уменьшается с ростом концентрации, а влияние второго «отрицательно» и растет при увеличении концентрации.
Ввиду указанной неопределённости влияния указанных факторов на спектр флуоресценции ГК однозначная интерпретация данных, представленных на рис.3.5 в рамках даже одной модели ассоциации также не представляется возможной. Например в качестве одного из возможных объяснений большего изменения величины М1 для малых по массе фракций относительно больших в предположении, что сп ектр определяется типом электронных переходов и флуорофор находится в полярном микродомене, может заключаться в том, что малые макромолекулы ГК при образовании ассоциатов претерпевают либо большие структурные изменения самой макромолекулы, которые приводят к батохромному сдвигу спектра флуоресценции, либо большее увеличение полярности микроокружения исходного состояния флуорофоров, либо одновременно имеют место обе причины. Другое возможное объяснение - структурные изменения при увеличении концентрации отсутствуют, а меняется только микроокружение флуорофора (например, образование сендвичевых, пластинчатых структур), которое у малых по массе фракций претерпевает большие изменения.