Содержание к диссертации
Введение
1 Металлопротеины и методы их исследования 10
1.1 Медьсодержащие пептидные комплексы Cu(II)DAHK и Cu(II)GHK 13
1.2 Бета-амилоид 19
1.3 Спектроскопия рентгеновского поглощения 25
1.4 Экспериментальные методики и установки
1.4.1 Лабораторный спектрометр R-XAS Looper 32
1.4.2 Источники синхротронного излучения 35
1.5 Теоретические методы определения структуры 44
1.5.1 Теория функционала плотности: программный комплекс ADF 44
1.5.2 Метод конечных разностей: программный комплекс FDMNES 47
1.5.3 Метод многомерной интерполяции: программа FitIt 53
2 Локальная атомная и электронная структуры пептидных комплексов Cu(II)DAHK и Cu(II)GHK 56
2.1 Лабораторная диагностика комплекса Cu(II)GHK в растворе 56
2.2 Спектры рентгеновского поглощениявысокого энергетического разрешения 60
2.3 Моделирование геометрической и электронной структуры пептидных комплексов
2.3.1 Пептидный комплекс Cu(II)GHK 65
2.3.2 Пептидный комплекс Cu(II)DAHK 73
3 Локальная атомная и электронная структуры центров связывания меди (I) в пептиде бета-амилоида 80
3.1 Cu(I)A в замороженном состоянии 83
3.2 Cu(I)A в буферном растворе 92
Заключение 100
Список цитируемой литературы 102
Список основных публикаций автора 116
- Спектроскопия рентгеновского поглощения
- Теория функционала плотности: программный комплекс ADF
- Моделирование геометрической и электронной структуры пептидных комплексов
- Cu(I)A в буферном растворе
Введение к работе
Актуальность темы. Металлопротеины в организме человека
выполняют важные функции от переноса электронов и связывания молекул O2
до катализа биохимических процессов. Однако, металлопротеины могут быть
вовлечены и в процессы, приводящие к различным патологиям у человека -
таких как рак, преждевременное старение, болезни Менкеса, Вильсона-
Коновалова, а также развитию нейродегенеративных заболеваний, например,
прионных болезней или болезни Альцгеймера. В настоящее время болезнь
Альцгеймера (БА) считается одним из самых распространённых
прогрессирующих расстройств. Заболеваемость БА растёт пропорционально увеличению продолжительности жизни. Так, учитывая тенденции к старению населения, по прогнозам к 2050 году она затронет около 106 миллионов [1] человек во всём мире. Существует оценка, что в Российской Федерации к 2020 году будет жить около 1,354 млн. человек с болезнью Альцгеймера [2], что составляет около 1% населения страны. Причём, в настоящее время БА является неизлечимым заболеванием.
При болезни Альцгеймера в тканях головного мозга характерно отложение амилоидных бляшек, в которых было обнаружено повышенное содержание ионов металлов Cu, Fe и Zn. Стоит отметить, что для Cu и Fe характерны окислительно-восстановительные реакции типа Фентона [3], которые приводят к образованию активных форм кислорода и повышению окислительного стресса. Поэтому теоретическое и экспериментальное изучение таких физических свойств, как особенности локальной атомной и электронной структуры металлического центра металлопротеинов в твердом и жидком состояниях при различных внешних воздействиях является важной задачей физики конденсированного состояния. Знание локальной атомной структуры металлических центров и понимание их связи с патологическими процессами в организме, в дальнейшем могут служить основой для разработки эффективного метода борьбы с болезнью, проверки механизма влияния лекарственных препаратов и определения функций металлопротеинов.
Другими объектами исследования являются пептидные комплексы Cu(GHK) и Cu(DAHK). Они используются в качестве модельных пептидов для отработки методики определения локального окружения и электронной структуры ионов металлов в бета-амилоиде. Кроме того, они широко применяются в косметологии и представляют большой интерес как перспективные объекты для разработки средств борьбы с болезнью Альцгеймера. Пептид DAHK может удалять медь из бета-амилоида и уменьшать его агрегацию [4]. Более того, данные пептиды могут блокировать образование активных форм кислорода, предотвращать перекисное окисление липидов, влиять на окислительно-восстановительные свойства меди [5].
Для анализа особенностей локальной геометрии и электронной структуры центров связывания меди необходимо применение синхротронных элементно-селективных и неразрушающих методов в условиях, близких к физиологическим, то есть исследовать пептиды в буферных растворах с физиологическими значениями pH. Подходящим методом является рентгеновская спектроскопия поглощения с высоким энергетическим разрешением.
Таким образом, тема диссертации, посвящённая определению параметров локальной атомной и электронной структур центров связывания меди в пептиде бета-амилоида и пептидных комплексах Cu(II)DAHK и Cu(II)GHK с использованием экспериментальных рентгеновских спектров поглощения, полученных на источниках синхротронного излучения, теоретического анализа, и моделирования, является актуальной.
Объекты исследования:
Медьсодержащий пептидный комплекс Cu(II)GHK
Медьсодержащий пептидный комплекс Cu(II)DAHK
Пептид бета-амилоида (1-16) c Cu(I).
Цель работы: определить параметры локальной атомной и электронной структуры центра связывания меди в пептиде бета-амилоида и пептидных комплексах Cu(II)DAHK, Cu(II)GHK в растворе.
Для достижения цели решались следующие задачи:
Выполнить моделирование геометрии ближайшего окружения атомов Cu в растворе для медьсодержащих пептидных комплексов Cu(II)DAHK, Cu(II)GHK, комплекса пептида бета-амилоида (1-16) c Cu(I) методами теории функционала электронной плотности и многомерной интерполяции.
Подготовить и провести эксперимент по получению рентгеновских спектров HERFD XANES на источниках синхротронного излучения.
Обработать и проинтерпретировать полученные экспериментальные спектры с помощью современных программных пакетов для определения координационного окружения центров связывания меди в исследуемых объектах.
Рассчитать теоретические спектры поглощения XANES и HERFD XANES полученных моделей окружения атомов Cu для медьсодержащих пептидных комплексов Cu(II)DAHK, Cu(II)GHK, комплекса пептида бета-амилоида (1-16) c Cu(I) в буферном растворе, отобрать модели, показывающие наилучшее согласие с экспериментом, и уточнить параметры их локальной атомной и электронной структуры.
Научная новизна. В ходе выполнения работы впервые
измерены и проанализированы флуоресцентные спектры поглощения высокого энергетического разрешения HERFD XANES (High Energy Resolution Fluorescence Detected X-ray Absorption Near Edge Structure) для Cu K-края: медьсодержащих пептидных комплексов Cu(II)DAHK, Cu(II)GHK в буферном растворе с pH = 7,4 и концентрацией 20 ммоль/л и Cu(I) A (1-16) в буферном растворе с pH = 8,5 и концентрацией 5 ммоль/л;
установлено, что рентгеновская спектроскопия высокого энергетического разрешения позволяет увидеть на спектрах рентгеновского поглощения новые особенности/пики для медьсодержащих пептидных комплексов Cu(II)DAHK, Cu(II)GHK и Cu(I)A(1-16);
определены параметры локального окружения и электронной структур меди в пептиде бета-амилоида и пептидных комплексов Cu(II)DAHK,
Cu(II)GHK в растворе на основе комплексного анализа данных рентгеновской спектроскопии высокого энергетического разрешения и теоретических расчётов.
Практическая значимость. Знание структуры активного центра в
металлопротеине позволяет определить его функции, а также влияние его
строения на развитие различных патологий у человека. Полученные данные
об атомной структуре и электронной конфигурации центров связывания меди
в пептиде бета-амилоида и пептидных комплексах Cu(II)DAHK, Cu(II)GHK в
буферном растворе позволяют уточнить и дополнить предложенные ранее
координационные схемы центров связывания, а также дают возможность
использования разработанной комплексной методики по определению
локальной атомной и электронной структуры центров связывания, основанной
на теоретическом анализе экспериментальных данных HERFD XANES, для
исследования подобных активных центров широкого круга
металлопротеинов, а также проверки механизма влияния лекарственных препаратов.
Основные научные положения, выносимые на защиту:
-
Локальная атомная структура медного центра пептидного комплекса Cu(II)GHK в фосфатном буферном растворе c pH = 7,4 и концентрацией 20 ммоль/л представляет собой, в отличие от кристалла, мономер, где атом Cu окружают три атома N, лежащих в одной плоскости с ним, а экваториальную и аксиальную позиции атомов O из карбоксилатных групп лизина соседних мономеров в структуре кристалла, замещают две молекулы H2O, одна из которых находится в экваториальном положении с расстоянием Сu – O = 1,97±0,02 , а другая - в аксиальном нижнем положении на расстоянии Сu – O = 2,31±0,02 .
-
Локальная атомная структура медного центра пептидного комплекса Cu(II)DAHK в фосфатном буферном растворе с pH=7,4 и концентрацией 20 ммоль/л, как и в кристалле, имеет четыре атома азота, лежащих в одной плоскости с атомом Cu, и одну молекулу H2O в аксиальном положении, но в
растворе длины связи Cu – N уменьшаются, и молекула H2O с вероятностями 67 и 33 % занимает верхнее или нижнее аксиальные положения с расстояниями Сu – O = 2,43±0,02 и 2,36±0,02 , соответственно.
3. Структура центра связывания Cu(I) в пептиде бета-амилоида в замороженном состоянии и в буферном растворе с pH=8,5 и концентрацией 5 ммоль/л различна: в замороженном пептиде атом Cu линейно связан с двумя гистидинами на расстоянии N – Cu = 1,88±0,02 с углом N(1)–Cu–N(2) = 178,4±0,4, а в растворе – атом Cu дополнительно координируется атомом O на расстоянии Сu – O = 2,71±0,02 , причём расстояние N – Cu = 1,94±0,02 увеличивается, а угол N(1) – Cu – N(2) = 173,2±0,4 уменьшается, по сравнению с замороженным пептидом.
Достоверность основных результатов и выводов диссертации
обеспечивается тем, что все экспериментальные результаты получены на
современном оборудовании, установках мега-класса: синхротронных центров
SOLEIL (Сент-Обен, Франция) и ESRF (Гренобль, Франция), а также центров
коллективного пользования Южного федерального университета.
Полученные данные имеют хорошую воспроизводимость. Достигнутые результаты и используемые подходы не противоречат описанным в литературе теоретическим и экспериментальным данным, известным физическим представлениям и теориям. Теоретические и экспериментальные исследования и обсуждения проводились в сотрудничестве с ведущими международными группами из Университета Тулузы (Universite de Toulouse) и Национального центра научных исследований (НЦНИ) Франции (Centre National de la Recherche Scientifique, CNRS) под руководством Питера Фоллера, а также с группой из Государственного объединения научных и прикладных исследований, Австралия (CSIRO Molecular and Health Technologies and P-Health Flagship) под руководством Виктора Стрельцова.
Личный вклад автора. Выбор темы исследования, постановка цели и задач, обсуждение и обобщение результатов, формулировка научных положений, выносимых на защиту, осуществлялись совместно с научным
руководителем. Лично автором проведена обработка полученных
экспериментальных данных, теоретический анализ спектров поглощения и моделирование структуры. При непосредственном участии автора были проведены измерения спектров рентгеновского поглощения высокого разрешения.
Апробация основных результатов проходила на III-VI Intern. Joint School Smart Nanomaterials and X-ray Optics, Modeling, Synthesis and Diagnostics (Ростов-на-Дону - Калининград, 2014-2017), XVI Всерос. школе-семинаре по проблемам физики конденсированного состояния вещества, (Екатеринбург, 2016), 14-й Курчатовской молодёжной научной школе (Москва, 2016), XXII Всерос. конф. "Рентгеновские и электронные спектры и химическая связь" (Владивосток, 2016); 22 Всерос. науч. конф. студентов-физиков (Таганрог, 2016), 16th Intern. Conf. on X-Ray Absorption Fine Structure (Карлсруэ, Германия, 2015), Нац. молодёж. науч. школе «Син-нано-2015» (Москва, 2015), BRICS Intern. Conf. of Master and PhD Students and Young Researchers (Ростов-на-Дону, 2015), XII Intern. Conf. on Nanostructured Materials (Москва, 2014), RACIRI Summer School “Imaging with X-Rays and Neutrons in Life and Materials Sciences” (Стокгольм, Швеция, 2014), II Балт. школе по физике твердого тела «Методы и инструменты рентгеновских исследований» (Калининград, 2013), IХ-XIII Ежегодная науч. конф. студентов и аспирантов базовых кафедр ЮНЦ РАН (Ростов-на-Дону, 2013 - 2015).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 статей в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ, из которых 3 статьи в журналах, индексируемых в Web of Science и Scopus, а также 14 тезисов докладов на всероссийских и международных конференциях и школах.
Объём и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, 3 разделов, заключения, списка литературы из 114 наименований и публикаций автора 20 наименований, снабженных литерой А, изложенных на 119 страницах, включая 59 рисунков и 8 таблиц.
Спектроскопия рентгеновского поглощения
Вблизи края поглощения для зависимости линейного коэффициента от энергии ц() наблюдается ближняя и дальняя тонкая структура [71]. Ближняя тонкая структура спектра рентгеновского поглощения - XANES (X-Ray Absorption Near Edge Structure) занимает область энергий примерно 50 эВ до края поглощения и до 100 - 150 эВ после края поглощения. Дальняя тонкая структура рентгеновского спектра - EXAFS (Extended X-Ray Absorption Fine Structure) располагается в интервале энергий 100 - 1000 эВ выше края поглощения.
Слабые спектральные особенности в предкраевой области связаны с переходами электронов с остовного уровня на более высокие незаполненные или наполовину заполненные орбитали (например, с s на p или с p на d). В XANES области происходят переходы на близкие по энергии несвязанные уровни. Поскольку вероятность такого перехода очень высока, на спектрах наблюдается скачок поглощения. В XANES области вылетающие фотоэлектроны имеют низкую кинетическую энергию и большую длину свободного пробега (рис. 1.10), что позволяет вовлекать в процесс большое количество атомов окружения и испытывать сильное многократное рассеяние на первой и последующих координационных сферах (рис. 1.11). В EXAFS области фотоэлектроны обладают высокой кинетической энергией и малой длиной свободного пробега (рис. 1.10), поэтому в данной области доминируют процессы однократного рассеяния: фотоэлектрон, вылетевший из поглощающего атома, однократно рассеивается на соседних атомах и возвращается к поглощающему атому (рис. 1.11).
Анализируя спектры XANES можно получить информацию о локальном атомном строении исследуемого вещества, а именно информацию о типе и количестве атомов, длинах связи, углах, зарядовом состоянии. При анализе EXAFS спектров, учитывая, что при формировании данных спектров используется приближение однократного рассеяния, возможно получить информацию о длинах связи, количестве соседей вокруг поглощающего атома.
Схема экспериментальной установки для получения рентгеновских спектров обычно состоит из трех основных элементов источник рентгеновского излучения, кристалл монохроматор и детектор. Для XAFS исследований существует два вида источников рентгеновского излучения: рентгеновские трубки и источники синхротронного излучения (СИ). В данных типах источников природа возникновения излучения одинакова -тормозное излучение, испускаемое заряженной частицей при ее ускоренном движении. В рентгеновской трубке излучение возникает в процессе торможения падающих на анод быстрых электронов, а в синхротронном источнике оно возникает при повороте пучка электронов отклоняющими магнитами, формирующих его орбиту [70].
В нашей работе измерение рентгеновских спектров проводилось с использованием лабораторного спектрометра R-XAS Looper (Rigaku) (рентгеновская трубка) и источников синхротронного излучения (ESRF и SOLEIL). 1.4.1 Лабораторный спектрометр R-XAS Looper
Лабораторный спектрометр рентгеновского поглощения R-XAS Looper (Rigaku) позволяет проводить измерения спектров ближней структуры спектров рентгеновского поглощения (XANES) и протяженной структуры спектров поглощения (EXAFS). R-XAS Looper находится в центре коллективного пользования «Наноразмерная структура вещества» Южного федерального университета.
В спектрометре используется специальная оптическая система, которая проводит спектрометрию и сбор данных одновременно, используя кристалл, изогнутый по типу Иогансона. На рисунке 1.12 представлена оптическая схема: источник рентгеновского излучения, кристалл-монохроматор и принимающая щель расположены на круге Роуланда (фокальном круге) радиуса R (в спектрометре R-XAS Looper R = 320 мм), таким образом, что выполняется соотношение SA = AF. Энергию рентгеновского излучения можно изменить путем изменения данного расстояния. Измерение интенсивности рентгеновского излучения, проходящего через образец, происходит посредством облучения образца монохроматическим рентгеновским излучением, выделенным таким образом. Коэффициент поглощения определяется отношением интенсивности этого излучения и падающего излучения. Для работы данного спектрометра используется рентгеновская трубка в качестве источника рентгеновского излучения. Для варьирования энергии рентгеновского излучения применяются различные наборы кристаллов монохроматоров, которые позволяют исследовать элементы от кальция до урана. Спектрометр позволяет проводить измерения спектров в режимах регистрации рентгеновских фотонов на прохождение и выхода флуоресценции.
Теория функционала плотности: программный комплекс ADF
Для понимания большинства химических свойств ионных растворов необходимо точное знание их координационной структуры и геометрии. В настоящее время по данной тематике опубликовано большое количество работ [94 - 96] и для многих ионов металлов достаточно хорошо изучены структура первой, а в некоторых случаях и второй гидратационных оболочек. Однако, геометрия окружения иона Cu2+ в водных растворах, напротив, является не вполне понятной и служит предметом исследований. Особый интерес к изучению данного объекта объясняется и тем, что медь является одним из наиболее важных и распространенных переходных металлов в биологических системах [97]. Основными типами координации Си2+ являются [98 - 99]: ян-теллеровский искажённый октаэдр с 4 короткими экваториальными и 2 длинными аксиальными межатомными расстояниями; плоская квадратная и тетраэдрическая геометрии. Причем, плоская квадратная геометрия является предельным случаем искаженной октаэдрической с бесконечно длинными аксиальными расстояниями.
Наиболее часто встречающейся геометрией Си2+ является искажённая октаэдрическая, тогда как тетраэдрические соединения наиболее малочисленны. Данный тип окружения меди является её отличительным свойством, которое выделяет её в ряду двухвалентных ионов 3d-металлов, таких как Co, Zn, Ni, для которых характерна регулярная октаэдрическая координация с шестью одинаковыми расстояниями. Для случая Си2+ в регулярном октаэдрическом поле дублет электронных состояний заполняется тремя электронами, двумя возможными способами: два электрона на 3dz2 и один на 3dx2_y2, или наоборот. Тогда энергетический терм вырожденный, и в результате эффекта Яна - Теллера происходит искажение окружения, которое понижает симметрию до D4h и снимает вырождение.
Таким образом, на протяжении многих лет считалось, что ионы меди Сu(II) в водных растворах представлены в качестве шести-координированных комплексов Си(Н20)62+ с октаэдрической симметрией и искажением Яна - Теллера. Вместе с тем данные, полученные с помощью различных методик, таких как спектроскопия рентгеновского поглощения и рентгеновская дифракция свидетельствовали о различных значениях длин связи для аксиальных атомов кислорода в диапазоне от 2,1 до 2,6 [100].
Одним из факторов, осложняющих процедуру определения структурных параметров водных комплексов, является то, что их структура находится в динамике и может иметь несколько различных конфигураций. Поэтому при проведении анализа структуры необходимо учитывать все возможные варианты. Моделирование структуры комплексов Cu(II)DAHK и Cu(II)GHK проводилось нами в работе [А1] на основе данных рентгеновской дифракции на монокристалле [30]. Для обоих комплексов проводили процедуру геометрической оптимизации (нахождения минимума полной энергии) методом теории функционала плотности. Наиболее часто в квантово химических расчётах для биологических металлосодержащих комплексов [101 - 107] используют обменно-корреляционные потенциалы ВР [108] и B3LYP [109, 110]. Причем, ВР функционал даёт результаты с хорошей точностью, и при проведении оценки вычислительных ресурсов, является компромиссным между желаемой точностью и потреблением вычислительных ресурсов, что было протестировано в нашей статье [А2].
После сравнения полученных данных для дальнейшего моделирования структуры мы использовали обменно-корреляционный потенциал BP и базис DZ. Для начальной модели мономера комплекса Cu(II)GHK без окружения молекул растворителя использовались нулевые значения заряда и спина. Для комплекса Cu(II)DAHK значения заряда 1+ и спина 0.
Теоретический анализ спектров рентгеновского поглощения для обоих комплексов проводился на основе метода конечных разностей в программном комплексе FDMNES [A7, А19]. Для проведения сравнения и расчёта R-фактора, теоретические и экспериментальные спектры рентгеновского поглощения были интерполированы в области энергий 8970 - 9050 эВ с использованием шага 0,1 эВ.
Кристаллическая структура комплекса Cu(II)GHK представляет собой димер, в котором присутствуют два медных центра. Каждый из медных центров связан с тремя атомами азота принадлежащих одному мономеру пептида GHK: атомом азота, принадлежащим гистидину, с NH2 группой глицина и амидной группой скелета. Экваториальным и аксиальным лигандом медного центра в кристалле являются атомы кислорода, принадлежащие карбоксилатным группам лизина соседних мономеров на расстоянии 1,97 и 2,51, соответственно.
Как следует из данных масс-спектроскопии, структура комплекса Cu(II)GHK различна в растворе и кристаллическом состоянии. В растворе присутствует около 5% димеров комплекса Cu(II)2GHK2, тогда как остальные 95% комплексов представлены в качестве мономеров [30]. Отсюда следует, что в ближайшем окружении медного центра комплекса Cu(II)GHK в растворе карбоксилатные группы соседних комплексов не участвуют, и на их место могут приходить молекулы растворителя.
Проведено сравнение (рис. 2.33) экспериментального спектра рентгеновского поглощения для Cu(II)GHK в растворе с теоретическим спектром, рассчитанным для структуры димера Cu(II)2GHK2. Показано, что спектр для димера имеет более выраженную и интенсивную предкраевую особенность А, а также два пика В и С, которые не наблюдаются в спектре для раствора. Основной максимум D имеет более низкую интенсивность.
Далее, нами в работах [A1, А14] промоделировано несколько случаев локального атомного окружения медного центра Cu(II)GHK в растворе. Первой рассматриваемой моделью является мономер Cu(II)GHK без молекул растворителя. Таким образом, медь находится в окружении трёх атомов N, то есть трёхкоординированная (Модель 1). Данная модель представляет собой довольно грубое приближение структуры, однако полезна для того, чтобы продемонстрировать чувствительность спектров рентгеновского поглощения к изменению ближайшего окружения медного центра. Далее к данной модели последовательно добавлялись молекулы растворителя в экваториальную и аксиальные позиции.
Моделирование геометрической и электронной структуры пептидных комплексов
Количество атомов, входящих в расчёт спектра увеличивают время расчёта, поэтому важно определить минимальное значение радиуса сетки, при котором будут воспроизводиться все особенности спектра. На рисунке 3.46 представлено сравнение рассчитанных спектров рентгеновского поглощения для Модели DFT с экспериментальным спектром. Сравнения проводились с экспериментальным спектром рентгеновского поглощения для жидкого раствора бета-амилоида с ионами одновалентной меди измеренным на линии SAMBA синхротрона SOLEIL, предоставленным Christelle Hureau [64]. Сходимость теоретических спектров наблюдается при радиусе кластера 5,5 .
В нашей работе [A3] были исследованы образцы пептида бета-амилоида Cu(I)A\l-16) в фосфатном буферном растворе после процедуры быстрой заморозки. Спектры рентгеновского поглощения были получены Виктором Стрельцовым на источнике синхротронного излучения Advanced Photon Source (APS), Чикаго. Для экспериментальных спектров рентгеновского поглощения для -края меди в пептиде бета-амилоида Cu(I)A в замороженном состоянии наблюдается два различных профиля (рис. 3.47), которые возможно соответствуют разным структурам центра связывания. Для сравнения приведён спектр рентгеновского поглощения для Си(П)A
Чтобы объяснить данные профили были промоделированы возможные модели центров связывания меди (I) в пептиде бета-амилоида в зависимости от количества лигандов окружающих медь: два или три гистидина в различной конформации. В естественных условиях ионы меди являются источником активных форм кислорода посредством реакции Фентона и Габера-Вейса. В аэробных условиях ион Cu+ приводит к образованию перекиси водорода H2О2, супероксида O2- и гидроксил-радикала OH [112]. Образование гидроксил групп может вызывать окисление бета-амилоида (процесс окисления бета-амилоида происходит посредством окисления отдельных аминокислот, входящих в его состав, например, метионина и гистидина), а также других молекул находящийся в непосредственной близости [113]. Поэтому, нами были промоделированы структуры центра связывания с учетом процессов окисления для каждой из моделей центра связывания.
Нами было выдвинуто две гипотезы, для объяснения существования двух экспериментальных профилей [А17, А18]. Первая гипотеза предполагает наличие смеси Cu(I) и Cu(II) в экспериментальных спектрах из-за неполного восстановления Cu(II) до Cu(I) аскорбиновой кислотой, а вторая предполагает существование двух различных структур для центра связывания Cu(I) в бета-амилоиде. Рисунок 3.47 - Экспериментальные спектры рентгеновского поглощения для Си -края в Си (1)/Си (II)A. Си(1)A - синяя и розовая линия, Си(П)A - чёрная линия
Линейные комбинации спектров рентгеновского поглощения из трех основных профилей экспериментальных XANES спектров для Cu(I)A (2 спектра) и Cu(II)A: для экспериментального профиля Cu(I)A «Синий» (a), для экспериментального профиля Cu(I)A «Розовый» (б) Для проверки первой гипотезы была построена линейная комбинация (рис. 3.48) двух групп экспериментальных спектров для CuK-краёв в Cu(I)A и Cu(II)A. Данная гипотеза верна в первом случае (см. рис. 3.48, а). По результатам проведения процедуры линейной комбинации спектров рентгеновского поглощения получено, что экспериментальный профиль «Синий» для Cu(I)A содержит возможный 15%-ный вклад ионов Cu(II), R-фактор = 0,014. Для экспериментального профиля «Розовый» для Cu(I)A вклада от Cu(II) не наблюдается (рис. 3.48, б). Таким образом, для описания второго экспериментального профиля требуется подход моделирования центра связывания.
Чтобы проверить вторую гипотезу о существовании двух различных структур центра связывания Cu(I) в пептиде бета-амилоида, было использовано две предложенные геометрии центра связывания Cu(I) в пептиде бета-амилоида [114]: линейную (двухкоординированная структура -His-Сu-His) и трёхкоординированную структуры. Линейная двухкоор-динированная модель состоит из иона меди, координированного двумя имидазольными кольцами. Трёхкоординированная модель центра связывания Cu(I) в пептиде бета-амилоида состоит из меди, координируемой тремя имидазольными кольцами, образующими Т-образную структуру.
Cu(I)A в буферном растворе
В спектрах рентгеновского поглощения высокого разрешения для пептида бета-амилоида с Cu(I) (рис. 3.54) наблюдается три основных спектральных особенности: предкраевая особенность А, плечо В и основной максимум С. Причем в обычных XANES спектрах предкраевой особенности А не наблюдается. Наличие таких пиков в предкраевой области может свидетельствовать об образовании перехода лиганд-металл, что в данном случае может означать появление третьего лиганда координирующего Cu. Особенность спектра В соответствует переходу1s – 4s, основной максимум С – состояниям1s – 4p.
Как уже говорилось, в литературе предложено две схемы возможных схемы центра связывания Cu(I) в пептиде бета-амилоида: линейная и трёхкоординированная. Линейная схема представляет из себя атом меди и два имидазольных кольца гистидина, расположенных линейно и тогда возможно образование следующих пар гистидинов {His13, His14}, {His6, His13}, {His6, His14}. Трёхкоординированная схема обуславливается присоединением к линейной схеме третьего гистидина с образованием Т-образной структуры: {His13, His14} + His6. Мы провели сравнения спектров рентгеновского поглощения, рассчитанных для моделей, полученных для замороженного образца комплекса бета-амилоида с медью (табл. 3.6), и сделали вывод в работе [A8, A11] о том, что предложенные ранее модели (рис. 3.55) не подходят для описания структуры центра связывания Cu(I) в пептиде бета-амилоида в растворе. На теоретических спектрах для данных моделей не наблюдается предпик А, расстояние между спектральными особенностями В и С является меньшим (указаны голубыми стрелками), чем на экспериментальном спектре. Интенсивность пиков В и С теоретического спектра для линейной модели недооценены. Для трёхкоординированной модели интенсивность пика В значительно меньше, чем на экспериментальном спектре, тогда как интенсивность максимума С теоретического спектра практически совпадает с экспериментом.
При сравнении теоретических спектров рентгеновского поглощения для моделей центра связывания в замороженном образце бета-амилоида с экспериментальным спектром для его раствора для линейной модели значение R-фактора = 0,14, а для трёхкоординированной – R-фактор=0,12. Для данных моделей нами была проведена процедура многомерной интерполяции, для которых изменялись расстояния Cu-N и углы между ними, однако эта процедура не дала лучшего согласия экспериментального и теоретических спектров.
Для того чтобы улучшить модели, необходимо учесть влияние молекул растворителя на структуру центра связывания. Для начала было проведено моделирование (рис. 3.56, табл. 3.8) центров связывания методом теории функционала плотности с учётом молекул кислорода. Параметры расчёта использовались те же (BP, DZ), заряд и спин для линейной и Т-образной модели составляли 2/1 и 0/0 соответственно. Далее для полученных моделей протестировано влияние атомов водорода, а именно, получены структуры центра связывания в окружении атомов О, гидроксильных групп ОН и молекул H2O рассчитаны спектры и проведено сравнение теоретических спектров для данных моделей с экспериментальным спектром. В результате был сделан вывод, что в данном случае молекулы водорода не оказывают влияния на спектр поглощения.
Сравнение экспериментального спектра рентгеновского поглощения для Cu(I) в пептиде бета-амилоида с теоретическими спектрами для моделей центра связывания в растворе Линейная+O и Т-образная+O Для Моделей Линейная+O и Т-образная+O рассчитаны теоретические спектры рентгеновского поглощения, из которых следует, что обе модели довольно плохо описывают экспериментальный спектр (рис. 3.57). Спектр поглощения для модели Линейная+O не содержит предпика А, а также наблюдается рост небольшого плеча в предкраевой области, хотя такой особенности не наблюдается на экспериментальном спектре. Интенсивности максимумов В и С меньшие по сравнению с экспериментом, основной максимум является более узким. Однако, по сравнению с предыдущими моделями, наблюдается увеличение расстояния между пиками В и С, что является положительной тенденцией для описания экспериментального спектра при R-фактор = 0,11.
Для Модели Т-образная+O (см. рис. 3.57) наблюдается широкий интенсивный основной максимум С, который, по сравнению с экспериментальным спектром, сдвинут влево. Пик А практически в 3,5 раза меньше по интенсивности, чем в экспериментальном спектре при R-фактор = 0,18.
Поскольку R-фактор для Модели Линейная+O показал меньшее значение, по сравнению со спектром для Модели Т-образная+O и имеется положительная тенденция, проявляющаяся в увеличении расстояний между пиками В и С, для данной модели проведена процедура многомерной интерполяции. Для этого были подготовлены модели с различными значениями расстояний N – Cu и Cu – O, а также угла N(1) – Cu – N(2).
Процедура многомерной интерполяции проводилась варьированием трёх параметров (рис. 3.58). Наилучшее совпадение экспериментального и теоретического спектров (R-фактор = 0,047) (рис. 3.59) после процедуры многомерной интерполяции показала модель со следующими параметрами локальной атомной структуры: N – Cu=1.94±0,02 , Cu – O= 2,71±0,02 , N(1) – Cu – N(2)= 173,2±0,4.