Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Современные представления о возможностях фармакологической коррекции проявлений системного сосудистого ремоделирования при длительном табакокурении (обзор литературы) 12
1.1 Курение как фактор риска сердечно-сосудистых заболеваний 12
1.1.1 Биологические эффекты табачного дыма и его компонентов 14
1.2 Моделирование негативного воздействия табачного дыма у лабораторных животных 19
1.3 Воздействие компонентов табачного дыма на сосудистую функцию 21
1.4 Современные представления о сосудистом ремоделировании при длительном табакокурении 23
1.4.1Соединительнотканный дисметаболизм как патогенетическая основа ремоделирования 27
1.5 Возможности и перспективы фармакологической коррекции сосудистой дисфункции при длительном табакокурении 31
ГЛАВА 2. Материалы и методы .38
2.1 Воспроизведение модели длительного табакокурения у экспериментальных животных 38
2.2 Характеристика аутопсийного материала 40
2.3 Проведение и режимы экспериментальной фармакологической коррекции...43
2.4 Методы исследования гистологического материала 45
2.5 Статистический анализ результатов 47
ГЛАВА 3. Системное сосудистое ремоделирование при длительном табакокурении . 48
3.1 Морфологические изменения аорты и церебральных сосудов у экспериментальных животных с моделью длительного табакокурения 48
3.2 Содержание матриксных металлопротеиназ ММП-2 и ММП-9 и их тканевых ингибиторов в аорте и церебральных артериях у лабораторных животных с экспериментальной моделью длительного табакокурения 53
3.3 Морфологические изменения и характер ремоделирования артерий головного мозга у лиц с длительным анамнезом табакокурения .61
3.4 Содержание матриксных металлопротеиназ ММП-2 и ММП-9 и их тканевых ингибиторов в церебральных артериях у лиц с длительным анамнезом табакокурения 64
ГЛАВА 4. Фармакологическая коррекция проявлений системного сосудистого ремоделирования придлительном табакокурении 69
4.1 Морфологические особенности аорты, церебральных артерий и динамика содержания матриксных металлопротеиназ и их ингибиторов после применения симвастатина 69
4.2 Морфологические особенности аорты, церебральных артерий и динамика содержания матриксных металлопротеиназ и их ингибиторов после применения -3ПНЖК 78
4.3 Морфологические особенности аорты, церебральных артерий и динамика содержания матриксных металлопротеиназ и их ингибиторов после сочетанного применения симвастатина и -3ПНЖК 85
4.4 Сравнительная эффективность использованных режимов фармакологической коррекции проявлений системного сосудистого ремоделирования при длительном табакокурении .91
Обсуждение результатов 100
Выводы 119
Практические рекомендации 121
Список литературы
- Моделирование негативного воздействия табачного дыма у лабораторных животных
- Характеристика аутопсийного материала
- Содержание матриксных металлопротеиназ ММП-2 и ММП-9 и их тканевых ингибиторов в аорте и церебральных артериях у лабораторных животных с экспериментальной моделью длительного табакокурения
- Морфологические особенности аорты, церебральных артерий и динамика содержания матриксных металлопротеиназ и их ингибиторов после сочетанного применения симвастатина и -3ПНЖК
Введение к работе
Актуальность темы. Никотина-ассоциированные болезни занимают лидирующие позиции в структуре смертности цивилизованного общества. Установлено, что курение является независимым фактором риска развития ишеми-ческого инсульта, инфаркта, и аневризмы брюшного отдела аорты (Wilson K. et al., 2000; Stolle K. et al, 2010; Оганов Р.Г. и соавт., 2011; Cosci F. et al, 2013;). В то же время, механизмы и особенности длительного воздействия табачного дыма на сосудистую стенку до сих пор находятся в зоне дискуссии.
Существует достаточное количество шкал и калькуляторов для оценки суммарного сердечно-сосудистого риска, но вопросы оценки индивидуального сердечно-сосудистого риска после прекращения курения остаются открытыми. Известно, что вероятность развития повторных индексных сердечнососудистых событий выше у бывших курильщиков, при сравнении с некурящими, но значимо меньше, чем у активных курильщиков (Goldenberg I. et al., 2003; Yusuf S. et al., 2004). Для более эффективной оценки индивидуального риска поднимается вопрос о необходимости учета статуса бывшего курильщика для реклассификации сердечно-сосудистого риска при использовании традиционных шкал оценки.
Принимая во внимание развитие системного сосудистого ремоделирова-ния под влиянием табачного дыма, возникает вопрос о поисках возможных методов коррекции развивающейся ангиопатии. Наиболее изученными препаратами, действие которых направлено на снижение сердечно-сосудистого риска еще на доклинических стадиях сердечно-сосудистых заболеваний являются статины (Briel M. et al. 2006; Sadowiz B.et al., 2010; Sakurai K. et al., 2011; Фе-сенко Э.В., 2012). В большинстве случаев их действие связано с коррекцией дислипидемии и лишь единичные сведения касаются возможностей участия в регуляции соединительнотканного сосудистого дисметаболизма (Jacob-Ferreira A.L. et al., 2010; Salame J. et al., 2016), иницируемого матриксными металлопро-теиназами (ММП). Несмотря на длительную историю использования -3 полиненасыщенных жирных кислот (-3ПНЖК) с целью коррекции липидного обмена и снижения сердечно-сосудистого риска, их возможности также активно обсуждаются (Calder P.C et al., 2006; Buhr G., 2009; Nozue T. et al., 2013).
Борьба с табакокурением и его последствиями признана одним из ведущих направлений в организации популяционной и персонифицированной стратегии в борьбе с преждевременной смертностью населения и увеличением продолжительности жизни. Необходимость выявления механизмов развития системной сосудистой дисфункции при хроническом табакокурении с целью прицельного изучения последствий воздействия табачного дыма и поиска возможностей фармакологической коррекции возникающей системной ангиопатии обуславливает актуальность нашего исследования.
Цель исследования. Анализ эффективности симвастатина, -3ПНЖК и их комбинации на проявления системного сосудистого ремоделирования при длительном табакокурении.
Задачи исследования
-
Выяснить особенности морфологических изменений и характер ремодели-рования аорты и церебральных сосудов у экспериментальных животных с воспроизведенной моделью длительного табакокурения по протоколу H. Zheng и колл. (2009 г.), а также морфологические особенности ремоделирования церебральных сосудов у лиц с длительным анамнезом табакокурения (аутопсийный материал).
-
Оценить оптическую плотность преципитата иммуногистохимической реакции к ММП 2 и 9 типа, а также к их ТИМП 1 и 2 типа в аорте и церебральных артериях у лабораторных животных с экспериментальной моделью длительного табакокурения, и в сосудах головного мозга у лиц с длительным табакокурением в анамнезе (аутопсийный материал).
-
Изучить состояние сосудистой стенки, определить тип ремоделирова-ния и динамику содержания ММП и их ТИМП в аорте и церебральных артериях у лабораторных животных, после прекращения курения и применения сим-вастатина, высококонцентрированных -3ПНЖК, а также их комбинации.
-
Провести сравнительный анализ эффективности различных режимов фармакологической коррекции на основании мониторинга морфометрических характеристик, содержания ММП и их ТИМП в аорте и церебральных артериях у экспериментальных животных.
Научная новизна исследования. Изучено сосудистое ремоделирование различных артериальных бассейнов при табакокурении. Установлен гипертро-
фический тип ремоделирования церебральных артерий и утолщение стенки восходящего отдела аорты у животных с экспериментальной моделью длительного табакокурения, а также подтверждено гипертрофическое ремоделирование церебральных сосудов у лиц с длительным анамнезом курения.
Обнаружено, что системная ангиопатия у курильщиков ассоциирована с развитием соединительнотканного дисметаболизма артериальной стенки. Выявлено, что после прекращения экспериментального табакокурения у животных сохраняется соединительнотканный дисметаболизм как в церебральных сосудах, так и в аорте.
В эксперименте установлено, что симвастатин и высококонцентрированные -3ПНЖК при изолированном применении частично нормализуют содержание ММП и ТИМП в артериальной стенке. Сочетанное использование сим-вастатина и -3ПНЖК оказывает максимально эффективное влияние на систему ММП/ТИПМ в церебральных артериях и в аорте у животных после длительного экспериментального табакокурения.
Практическая значимость. Установлена необходимость учета статуса «бывшего курильщика» для оценки индивидуального сердечно-сосудистого риска в связи со стойким ремоделированием артерий мышечного и эластического типов, ассоциированного с соединительнотканным дисметаболизмом, сохраняющимся не менее 4-х лет после прекращения табакокурения в пересчете на продолжительность человеческой жизни.
Выявлено, что применение симвастатина и высококонцентрированных -3ПНЖК в монорежимах способствует снижению интенсивности протеолиза и деградации соединительнотканного матрикса церебральных артерий и аорты у экспериментальных животных, обусловленное частичной нормализацией содержания ММП и ТИМП.
Комбинированное применение симвастатина и концентрированных до 95% -3ПНЖК на протяжении 8 недель в эксперименте, что соответствует не менее 4-м годам в пересчете на продолжительность жизни человека, максимально корригирует дисбаланс в системе ММП/ТИМП в стенке артерий мышечного и эластического типов, тем самым нивелируя негативные последствия системного воздействия табачного дыма.
Полученные экспериментальные данные о длительном сохранении специфической системной ангиопатии после прекращения табакокурения, а также влияние симвастатина, высококонцентрированных -3ПНЖК, и их комбинации на проявления соединительнотканного дисбаланса в артериальной стенке требуют дальнейшего изучения с целью эффективной экстраполяции полученных данных для человека.
Связь с планом НИР. Тема диссертации является составной частью научно-исследовательской работы Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего образования «Тихоокеанский государственный медицинский университет» Минздрава России (№01201350006 от 20.12.2012 г.).
Апробация диссертации. Результаты диссертационной работы были представлены и обсуждены на научных конференциях регионального, российского и международного уровней: V конкурсе молодых ученых IX Дальневосточного Конгресса «Человек и Лекарство» с международным участием, Владивосток, 2012; Международном конгрессе Европейского Респираторного Общества, Вена, 2012; Международном конгрессе Европейского Респираторного Общества, Барселона, 2013; XXIII Национальном конгрессе по болезням органов дыхания, Казань, 2013; Всероссийской конференции молодых ученых «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной кардиологии», Томск, 2013; XV Тихоокеанской научно-практической конференции студентов и молодых ученых медиков с международным участием, Владивосток, 2014; Международном конгрессе Европейского Кардиологического Общества, Барселона, 2014; XXV Национальном конгрессе по болезням органов дыхания, Москва, 2015; Международном конгрессе Европейского Респираторного Общества, Амстердам, 2015; VI Дальневосточном Творческом Фестивале Медицинских ВУЗов «Во имя ЖИЗНИ», Владивосток, 2015; Международном конгрессе Европейского Респираторного Общества, Лондон, 2016; Международном конгрессе по атеросклерозу, посвященный памяти Аничкова Н.Н. «Дни Аничкова», Санкт-Петербург, 2016; Второй Российско-Китайской конференции молодых ученых по заболеваниям сердца, Харбин, 2016 г.
Личный вклад автора. Автором выполнено планирование диссертации, выбор и обоснование методик исследования, сбор, обработка и интерпретация данных, подготовка выводов и рекомендаций, а также выполнен анализ мате-
риала, представленного в работе, с применением современных методов статистической обработки, обсуждение полученных результатов исследования и написание диссертации. Исследования проведены на базе ЦНИЛ ФГБОУ ВО ТГМУ Минздрава России.
Публикация материалов исследования. По материалам исследования опубликовано 23 научные работы, из них 5 статей в рецензируемых медицинских журналах, рекомендованных ВАК. Тезисов докладов на международных конференциях-10, тезисов докладов на всероссийских конференциях и национальных конгрессах- 8.
Финансовая поддержка. Работа выполнена при поддержке государственного контракта № 14.740.11.0186 в рамках федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы.
Основные положения, выносимые на защиту
-
Хроническое воздействие табачного дыма ассоциировано с развитием специфической системной ангиопатии, затрагивающей сосуды мышечного и эластического типов, и связанной с развитием соединительнотканного дисме-таболизма в сосудистой стенке.
-
Системное сосудистое ремоделирование носит стойкий характер и сохраняется после прекращения воздействия табачного дыма. Выявлено, что проведенные варианты фармакологической коррекции в течение не менее 4-х лет, в пересчете на продолжительность человеческой жизни, не оказывает достоверного влияния на морфометрические параметры ремоделирования церебральных артерий и аорты в эксперименте.
-
Комбинированное применение симвастатина и -3ПНЖК имеет максимальную эффективность для коррекции соединительнотканного дисбаланса артериальной стенки различных сосудистых бассейнов у экспериментальных животных. Симвастатин и -3ПНЖК в монорежимах частично нормализуют содержание ММП и ТИМП в сосудистой стенке артерий мышечного и эластического типов.
Степень достоверности. Все научные положения и выводы диссертации аргументированы, обоснованы и достоверны. Фактические материалы, представленные в диссертации, полностью соответствуют первичной документации -
протоколам исследований. Достоверность полученных результатов и выводов основывается на достаточном объеме выборки, использовании современных методов исследования, корректном анализе полученных данных, адекватной статистической обработке.
Работа одобрена независимым Междисциплинарным этическим комитетом при ГБОУ ВПО ТГМУ Минздрава России, протокол № 7 от 23.06.2014. Зарегистрировано 1 рационализаторское предложение, №2848 от 23.11.2015 г.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, 4 глав собственных исследований, обсуждения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы. Текст изложен на 144 страницах машинописного текса, иллюстрирован 7 таблицами и 21 рисунком. Список литературы включает в себя 196 источников, из них отечественных - 32, иностранных – 164.
Моделирование негативного воздействия табачного дыма у лабораторных животных
Животные модели являются незаменимыми инструментами в области биомедицинских исследований. Для всестороннего изучения последствий и эффектов табакокурения к настоящему времени разработаны методы, позволяющие в зависимости от целей эксперимента, моделировать у лабораторных животных различные состояния, обусловленные действием никотина, компонентов табака или табачного дыма. От разового воздействия, включая острое отравление, до формирования никотиновой зависимости с развитием абстинентного синдрома после отмены никотина/табака. Наиболее часто для этих целей используются мыши и крысы. По сравнению с мышами крысы крупнее и более устойчивы к различным заболеваниям. Sprague-Dawley крысы и Wistar крысы - две наиболее часто используемые линии крыс. Это обусловлено, прежде всего, высокой скоростью размножения и низким уровнем заболеваемости спонтанными опухолями и инфекционными заболеваниями [183, 159]. Средний срок жизни чистопородной крысы составляет около 30 месяцев. В лабораторной практике для экстраполяции экспериментальных данных используются различные соотношения продолжительности жизни и фаз постнатального развития крысы и человека, но условно принято считать, что 1 месяц жизни грызуна соответствует от 24 до 36 месяцев жизни человека [8,17].
Большинство известных методов моделирования хронического табакокурения основаны на пероральном и парентеральном, чаще подкожном или интраперитонеальном, введение растворов никотина и его солей, а также табачного экстракта различной концентрации [45,46]. Для моделирования эффектов табачного дыма максимально приближенных к реальному курению, предпочтительнее использовать методики, основанные на вдыхании лабораторными животными табачного дыма или его конденсата. Суть способов заключается в помещении животных в специальную затравочную камеру, в которую с потоком воздуха посредством вентилятора поступает табачный дым от тлеющих сигарет, помещенных в генератор дыма. При сроке курения 6 месяцев по 1,5 часа ежедневно при использовании сигарет с содержанием смолы 11 мг и никотина 0,8 мг у крыс происходит характерное для курильщиков воспаление слизистых околоносовых пазух, подтвержденное морфологически [10]. Описан способ формирования ХОБЛ на лабораторных крысах. При этом животных помещали ежедневно на 2 часа в ингаляционную стеклянную камеру, подвергали воздействию табачного дыма. В данной модели использовались сигареты с содержанием смолы 25 мг, никотина 1,4 мг, концентрация угарного газа как основного токсического компонента табачного дыма составляла 265,5 мг/м3. Начиная с 3-го месяца, в экспериментальной группе животных стало происходить снижение массы их тела, к 6-му месяцу снижение массы было статистически достоверно. Эксперимент длился 8,4 месяца, по окончанию которого исследователи получили морфологические и гистохимические изменения в легких крыс, аналогичные проявлениям ХОБЛ у человека [197]. Воздействие и механизмы повреждающего действия продуктов сгорания табака на сосудистое русло в настоящее время не являются до конца изученными. Метаанализ 22 исследований показал, что при хроническом табакокурении происходит удвоение относительного риска развития ишемического инсульта и в 2-4 раза повышается риск инфаркта миокарда [161]. Известно, что табакокурение приводит к развитию эндотелиальной дисфункции, которая имеет свои особенности в зависимости от интенсивности и продолжительности воздействия, а также особенностей артериального бассейна. Так, одной из важных черт мозгового кровообращения, является высокая роль автономной ауторегуляции, обеспечивающая сравнительную независимость церебральной гемодинамики от сдвигов в системном кровообращении [5, 19]. Краткосрочная экспозиция табачного дыма реализуется через повреждающее действие его токсинов на сосудистый эндотелий, а также активацию симпато-адреналовой системы [126].
Хроническое воздействие табачного дыма приводит к снижению ктивности эндотелиальной NO-синтазы (eNOS) и синтеза оксида азота (NO), экспрессии молекул адгезии на поверхности эндотелиоцитов, активации протеинкиназы-С, усилению процессов перекисного окисления липидов с последующим стойким ремоделированием сосудистой стенки [13, 48, 89]. В ряде экспериментов, описано развитие эндотелиальной дисфункции сосудов церебрального и магистрального бассейнов у мышей при табакокурении, характеризующееся достоверным усилением и преобладанием констрикторной активности артерий, а также чрезмерным сокращением дилатационных резервов церебральных артерий на фоне ассиметричного роста каротидной констрикции [1]. Кроме развития эндотелиальной дисфункции и изменением характера вазомоторных реакций при табакокурении, в ряде экспериментальных исследований установлена связь между длительной экспозицией табачного дыма и необратимым изменением крупных артерий в виде утолщения их стенок с нарушением их механических свойств [89]. Параллельно у крыс-курильщиков обнаружен повышенный уровень эластазы и прогрессирующие дегенеративные изменения грудной и брюшной аорты, сопровождающиеся снижением ее эластических и механических свойств [103].
Характеристика аутопсийного материала
Для изучения негативного влияния длительного табакокурения на церебральные сосуды у человека в работу включено исследование аутопсийного материала головного мозга от лиц с длительным анамнезом табакокурения погибших от внешних причин. Забор аутопсийного материала осуществлялся на базе Спасского бюро судебной медицины в период с 2012 по 2014 гг. в ходе стандартной судебно-медицинской экспертизы трупа.
При отборе аутопсийного материала для исследования учитывалась причина смерти, возраст, длительность и интенсивность табакокурения, наличие и/или отсутствие диагностированного при жизни сердечно-сосудистого заболевания и/или его осложнений, известная при жизни или выявленная в ходе аутопсии тяжелая сопутствующая патология.
Критериями включения в исследуемую группу стали: возраст от 35 до 55 лет; анамнез табакокурения не менее 10 лет при условии выкуривания от 10 сигарет ( пачки) в сутки, который устанавливался в ходе расспроса родственников/сопровождающих лиц; отсутствие верифицированного при жизни диагноза ССЗ (артериальной гипертензии, ИБС и/или других форм атеросклероза) и его осложнений (перенесенные инфаркт миокарда, нарушение мозгового кровообращения) согласно данным архивной медицинской документации амбулаторной карты (форма № 025/У) и выписок из медицинских карт стационарного больного (форма 027/У), при условии отсутствия по результатам аутопсии (заключения судебно-медицинского эксперта, форма 170/У, и/или акта судебно-медицинского исследования трупа, форма 171/У) морфологических признаков ССЗ и/или их осложнений (утолщение и рубцовые изменения миокарда, увеличение камер сердца и аневризматические изменения, хронические постишемические кисты, очаги глиоза и лейкоареоза в головном мозге, распространенный макроскопический атеросклероз, врожденные и приобретенные пороки сердечно-сосудистой системы, сморщенная почка).
Согласно Международной классификации болезней X пересмотра ведущими причинами смерти включенных в исследование лиц явились транспортная травма (40%), нападения (33,3%), другие внешние причины травм при несчастных случаях, в том числе падение с высоты (13,3%), прочие внешние причины (10,1%), преднамеренные самоповреждения (3,3%). Среди данных лиц 76,6 % составили лица мужского пола и 23,3% лица женского пола. Средний возраст погибших равен 43,4±5,5 года. Таким образом, в группу исследования был включен аутопсийный материал от 30 лиц обоего пола с индексом курящего человека более 120 пачка/лет, что характеризует их как «злостных курильщиков».
Критериями исключения стали: возраст моложе 35 лет и старше 55 лет; известный при жизни диагноз сердечно-сосудистого заболевания (артериальная гипертензия, ИБС и/или другие формы атеросклероза) и/или его осложнений (перенесенный инфаркт миокарда и нарушение мозгового кровообращения), а также их морфологические признаки, выявленные в результате аутопсии; наличие тяжелой коморбитной патологии и терминальной стадии соматических заболеваний, известных при жизни и/или обнаруженных в ходе аутопсии (цирроз печени, уменьшение и морфологические изменения почек, уменьшение размеров поджелудочной железы, а также фиброз, липоматоз и кистозные изменения ее паренхимы, онкологические заболевания).
Контрольную группу составил аутопсийный материал от 10 лиц, сопоставимых по возрасту и полу, погибших от аналогичных причин, с соответствующими основной группе критериями включения/исключения и без табакокурения в анамнезе. Стандартная судебно-медицинская экспертиза трупа проводилась не ранее 12 часов после факта биологической смерти. В ходе аутопсии после трепанации черепа и внешней оценки состояния мозговых оболочек и тканей мозга, были забраны по 2-3 образца тканей серого вещества мозга с мягкими оболочками размерами от 1-3 см3. В случае повреждения тканей головы, оболочек и паренхимы мозга в процессе танатогенеза гистологические образцы брались с противоположной повреждениям стороне.
Биологический материал помещали в 10% забуференный раствор формалина, хранили и транспортировали в температурных условиях от +2 до +8 градусов. Далее после отмывания дистиллированной водой гистологический материал заключали в парафин по общепринятой методике. 2.3. Проведение и режимы экспериментальной фармакологической коррекции
На протяжении 8 недель животные первой подгруппы (группа бывших курильщиков, n=10) далее содержались в стандартных условиях вивария и никаких фармакологических агентов не получали. 2-ая подгруппа животных получала только симвастатин («Zocor» 0,01 № 28, Merck and Co) в дозе 5 мг/кг/сутки (n=10), что соотвествует высоким суточным дозам симвастатина у людей, при средней расчетной массе взрослого человека в 60-80 кг. Для этого таблетка с дозировкой 10 мг симвастатина дробилась на 5 равных частей. 1/5 таблетки растворяли с питьевой водой в шприце и вводили в per os каждому животному ежедневно 1 раз в день во второй половине дня в течение 8 недель. Учитывая средний срок жизни лабораторной крысы в 30 месяцев и примерное соотношение продолжительности жизни экспериментальных крыс и человека [17], данный 8-ми недельный срок фармакологического воздействия эквивалентен не менее 4-х летнему применению у человека, при средней продолжительности жизни мужчин в России 65,9 лет по данным ВОЗ за 2015 г.
Третья подгруппа животных получала концентрат -3ПНЖК, который был получен в лаборатории фармакологии Тихоокеанского института биологии моря ДВО РАН (с 1.09.2016 г. преобразован в «Национальный научный центр морской биологии» ДВО РАН) по разработанным ранее методам (Патент РФ № 2537252 «Способ получения докозагексаеновой кислоты», МПК 8 А 61 К 31/20, А 61 К 31/202, С 11 С 1/04 // С.П. Касьянов, Н.А. Латышев, А.Б. Имбс, Е.В. Ермоленко, Р.М. Султанов, 31.10.2014, правообладатель ННЦМБ ДВО РАН).
Раствор представлял собой светло-желтую подвижную маслянистую жидкость с невыраженным запахом и состоял из смеси очищенных и концентрированных до 95% эйкозопентаеновой и докозогексаеновой кислот в виде натриевых солей в соотношении 1:1, полученных из жира печени минтая с начальным содержанием ЭПК – 9,2%, ДГК – 6,1%. В концентрате отсутствовали неомыляемые вещества, кислотное число составляло 1,8 мг КОН/ г, перекисное число - 5,6 ммоль активного О2/ кг. Свободные жирные кислоты из рыбного жира были получены методом иодлактонизации [83]. Выделенные ЭПК и ДГК были переведены в натриевые соли и растворены в 40% этаноле до конечной концентрации 600мг/мл. Перед ежедневным введением per os исходный концентрированный раствор натриевых солей разбавляли в 4 раза физиологическим раствором и разовая доза на одно животное составляла 0,35мл, что соответствует 52 мг суммарных ЭПК и ДГК. Данная дозировка эквивалентна международным рекомендациям по нормам потребления -3ПНЖК для человека от 0,5 до 2 г/сутки с верхним пределом 3г/сутки [163]. Четвертая подгруппа животных получала перорально симвастатин и -3ПНЖК в таких же дозах. После окончания эксперимента всех животных фиксировали и анестезировали путем внутрибрюшинного введения рометара (Xylazinum, «Spora», Praha) в концентрации 5,5 мг/кг. Затем производилась декапитация животных, торакотомия и вскрытие черепной коробки, забор тканей аорты и головного мозга. Биологический материал помещали в 10% забуференный раствор формалина (получен путем добавления 0, 1 М фосфатного буфера, рН 7,2), хранили и транспортировали при температуре от +2 до +8 градусов. Далее после отмывания дистиллированной водой гистологический материал заключали в парафин по общепринятой методике.
Содержание матриксных металлопротеиназ ММП-2 и ММП-9 и их тканевых ингибиторов в аорте и церебральных артериях у лабораторных животных с экспериментальной моделью длительного табакокурения
Согласно полученным данным, показатели оптической плотности преципитата, отражающего содержание ММП-2 в аорте, у животных после длительного табакокурения, возросли на 2,3% при сравнении с контрольной группой животных. Статистической значимости различий для этих групп не выявлено (ММП-2контроль69,04±7,18 ЕОП, ММП-2б.курил. 70,58±5,22 ЕОП; z=-0,43, p=0,69). В то время как достоверное повышение оптической плотности преципитата, характеризующего содержание ММП-9, в аорте у крыс с моделью хронического табакокурения составило 21 % по сравнению с группой контроля (ММП-9 контроль62,34±7,76 ЕОП, ММП-9б.курил.75,35±5,20 ЕОП; z=2,29, p=0,02).
При сравнении интенсивности роста обеих протеаз в пиальных артериях и аорте обнаружено следующее. Рост содержания ММП-2 в пиальных сосудах составил 21,6%, в то время как в аорте лишь 2,3%, при этом статистической разницы между контрольной группой и группой бывших курильщиков не обнаружено для обоих сосудов. Рост индуцибельной ММП-9 оказался более значимый в пиальных сосудах, и составил 58,5% против 21% в аорте. Таким образом, после продолжительного табакокурения интенсивность повышения оптической плотности ММП-9 и ММП-2 в пиальных артериях крыс оказалась выше, чем в аорте.
Иными словами, согласно полученным в ходе работы данным, повышение содержания ферментов протеолиза в аорте в результате воздействия табачного дыма происходит менее значительными темпами при сравнении с пиальными артериями головного мозга. Вероятно, уровень повышения и степень выраженности процессов протеолиза в аорте зависит от продолжительности и интенсивности воздействия табачного дыма. Так, при краткосрочном 24-часовом воздействии на ГМК аорты водным экстрактом сигаретного дыма в литературе описано увеличение MMП-9, и менее выраженное увеличение MMП-2, что косвенно подтверждает более выраженные свойства индуцибельности ММП-9 и констутивный характер ММП-2 [88]. Однако, на финальных стадиях ремоделирования аорты и формировании аневризмы у курильщиков, описано существенное повышение активности как ММП-2, так и МПП-9 [24, 146]. Эти данные указывают на усиление процессов протеолиза при пролонгированном табакокурении и активное участие обоих металлопротеиназ в процессах ремоделирования аорты.
Особый интерес, представляют данные, характеризующие содержание в аорте тканевых ингибиторов при длительном табакокурении (таб. 4). Согласно представленным данным, в отличие от церебральных артерий, при длительном воздействии табачного дыма в аорте обнаружено увеличение плотности обоих тканевых ингибиторов. Содержание ТИМП-1 увеличилось на 21% при сравнении с контрольной группой животных, однако статистически достоверной разницы не выявлено (ТИМП-1контроль51,58±12,46 ЕОП, ТИМП-1б.курил.61,98±20,45 ЕОП; z=0,79, p=0,42). При этом достоверно увеличивается плотность преципитата, характеризующего содержание ТИМП-2, по сравнению с контрольной группой животных (ТИМП-2контроль15,08±9,11 ЕОП, ТИМП-2б.курил. 34,91±7,71 ЕОП; z=2,52, p=0,01). Прирост содержания ТИМП-2 оказался значительным и составил 130%.
Можно предположить, что после длительного воздействия табачного дыма в аорте, где широко представлены коллагеновые и эластические волокна в отличие от артерий мышечного типа, происходит менее значимое повышение уровня ММП-9 с одновременным усилением активности ТИМП-2, которое, прежде всего, направлено на сдерживание процессов протеолиза и деградации соединительнотканного каркаса самого крупного сосуда эластического типа. В литературе также описано одновременное повышение уровня ММП-1 и ТИМП-3 при воздействии конденсата табачного дыма на грудной отдел аорты кроликов [180].
Согласно полученным в ходе работы данным, у интактных животных и животных с моделью длительного табакокурения установлено присутствие ММП-2 и ММП-9 и их тканевых ингибиторов ТИМП-1 и ТИМП-2 в интиме и адвентиции пиальных артерий и в интиме, медии и адвентиции аорты. В церебральных сосудах после длительного табакокурения при сравнении с интактными животными содержание ММП-9, ТИМП-2 и ТИМП-1 меняется разнонаправленно, о чем свидетельствует значительное возрастание плотности преципитата, характеризующего содержание ММП-9 и соответственно достоверное снижение ТИМП-1 и ТИМП-2. В аорте у животных с длительным табакокурением установлено однонаправленное изменение содержания ММП-9 и ингибиторов в виде недостоверного повышения плотности иммуногистохимического преципитата для ТИМП-1 и значительного для ТИМП-2. 3.3. Морфологические изменения и характер ремоделирования артерий головного мозга у лиц с длительным анамнезом табакокурения
После приготовления гистологических образов аутопсийного материала головного мозга были получены и проанализированы изображения сосудов оболочки и паренхимы головного мозга контрольной группы и группы курильщиков. Среди данных лиц 76,6% составили лица мужского пола и 23,3 % лица женского пола. Средний возраст погибших составил 43,4±5,5 года. Пример полученных изображений представлен на рис. Рис.7. Пиальные сосуды головного мозга людей контрольной группы (A) и курильщиков (B). Окраска толуидиновый синий, ув. х200. Стрелками указаны сосуды мозговой оболочки.
Для оценки структурно-анатомических изменений и определения типа сосудистого ремоделирования пиальных артерий у людей контрольной группы и курильщиков были измерены толщина сосудистой стенки (H) и диаметр (D) и рассчитан индекс Керногана (отношение H/D). Полученные данные отражены на рисунке 8.
Показатели индекса Керногана в церебральных артериях людей контрольной группы и курильщиков. Примечание - различия статистически значимы по сравнению с группой контроля при p 0,05
Согласно полученным данным, выявлено статистическое достоверное увеличение индекса Керногана при сравнении группы контроля и группы погибших лиц с длительным анамнезом курения (H/D=0,11±0,07 и 0,314±0,08, p 0,05 соответственно), что является морфологическим отражением процессов сосудистого ремоделирования по гипертрофическому типу.
Важную роль в процессе сосудистого ремоделирования играет развитие эндотелиальной дисфункции и нарушение вазомоторных реакций церебральных артерий. В ряде исследований было показано, что повреждение эндотелия и развитие эндотелиальной дисфункции является одним из ключевых элементов патологического каскада развития сосудистого ремоделирования при хроническом табакокурении [66, 13]. Известно, что у курильщиков на фоне прогрессирующей эндотелиальной дисфункции, искажаются вазомоторные реакции, усугубляется локальный гемодинамический стресс, что приводит к усугублению морфологических изменений артериальной стенки. Основным компонентом медии церебральных артерий являются ГМК. Ремоделирование артерий мышечного типа осуществляется преимущественно за счет гипертрофии и пролиферации ГМК, дезорганизации и нарушения структуры коллагеновых волокон, что проявляется морфологически утолщением артериальной стенки [69, 129]. В ходе проделанной нами работы, получены аналогичные показатели гипертрофического ремоделирования церебральных артерий при длительном табакокурении у людей и животных с экспериментальной моделью курения.
Морфологические особенности аорты, церебральных артерий и динамика содержания матриксных металлопротеиназ и их ингибиторов после сочетанного применения симвастатина и -3ПНЖК
Согласно полученным ранее в ходе работы результатам, в стенке восходящего отдела аорты после 6-месячного табакокурения отмечен рост плотности ММП-2 на 2,3% по сравнению с группой контрольных животных, однако статистически достоверных отличий абсолютных значений плотности преципитата ММП-2 между контрольной группой и группой курения обнаружено не было (p 0,05). После завершения воздействия симвастатином обнаружено достоверное уменьшение плотности преципитата ММП-2 на 28,1% при сравнении с группой бывших курильщиков (p 0,05). В группе животных, получивших концентрат -3ПНЖК, обнаружено достоверное уменьшение плотности ММП-2 на 45,5%. В группе комбинированного воздействия снижение плотности преципитата ММП-2 составило 44,4% от показателей бывших курильщиков без коррекции. При сравнении абсолютных значений плотности преципитата ММП-2 среди групп экспериментальной коррекции обнаружена достоверная статистическая разница между группой комбинированного воздействия и группы симвастатина (ММП-2симв+ПНЖК39,28±7,5 и ММП-2симв.50,79±8,18 ЕОП; z=-2,56 при p=0,009). Таким образом, несмотря на исходное незначительное повышение уровня ММП-2 после длительного табакокурения в стенке аорты, для всех трех режимов фармакологической коррекции установлено ингибирующее влияние на содержание данной протеазы, интенсивность которого сопоставима среди групп комбинированного воздействия и -3ПНЖК и минимальна для группы животных, получивших симвастатин.
Содержание ММП-9 в стенке аорты у крыс курильщиков после завершения табакокурения возросло на 21% от контрольных значений. После завершения эксперимента максимальное снижение концентрации ММП-9 на 53,7% установлено в группе комбинированного воздействия, против 36,25% в группе симвастатина и 13,6% в группе -3ПНЖК. Абсолютные значения плотности преципитата иммуногистохимической реакции, отражающей содержание ММП-9 в стенке аорты, в группе комбинированного воздействия были достоверно ниже показателей группы симвастатина (ММП-9симв+ПНЖК34,82±7,09 и ММП 9симв48,04±5,72 ЕОП; z=1,97 при p=0,04) и группы -3ПНЖК (ММП-9симв+ПНЖК34,82±7,09 и ММП-9ПНЖК65,13±9,46 ЕОП; z=-2,14 при p=0,04). Можно сделать вывод об эффективном ингибирующем влиянии сочетанного применения симвастатина и концентрата -3ПНЖК в отношении индуцибельной ММП-9 в стенке восходящего отдела аорты экспериментальных животных после длительного табакокурения.
В отличие от артерий мышечного типа, после завершения экспериментального 6-месячного табакокурения, в аорте обнаружено повышение оптической плотности обоих тканевых ингибиторов. Наиболее значимо увеличилось содержание ТИМП-2, а именно на 130% при сравнении с контрольной группой. Увеличение плотности преципитата ТИМП-1 составило 21% от контрольных значений и оказалось статистически не достоверным.
После завершения экспериментальной фармакологической коррекции, максимальное снижение оптической плотности ТИМП-2 на 60,8% обнаружено в группе комбинированного воздействия, значения которой достоверно отличались от группы симвастатина (ТИМП-2симв+ПНЖК 13,69±8,57 и ТИМП-2симв33,22±7,91 ЕОП; z=2,90 при p=0,004) и группы -3ПНЖК (ТИМП-2симв+ПНЖК 13,69±8,57 и ТИМП-2ПНЖК 45,7±12,86 ЕОП; z=-0,05 при p=0,04). Уменьшение плотности преципитата иммуногистохимической реакции к ТИМП-2 в группе симвастатина составило 4,9% от показателей крыс - бывших курильщиков без медикаментозной коррекции, но статистически достоверной разницы при сравнении абсолютных величин оптической плотности преципитата среди групп симвастатина и бывших курильщиков не обнаружено (p 0,05). Интересно, что в группе животных, получивших концентрат -3ПНЖК, отмечен продолжающийся рост интенсивности отложения преципитата к ТИМП-2 на 31%, абсолютные значения плотности которого, были сопоставимы с показателями крыс - бывших курильщиков без экспериментальной коррекции (ТИМП-2ПНЖК 45,7±12,86 и ТИМП-2б.курил.34,91±7,71 ЕОП, при p=0,58) и достоверно отличались от группы контроля (ТИМП-2ПНЖК 45,7±12,86 и ТИМП-2контроль15,08±9,11 ЕОП, при p=0,01). Оптическая плотность ТИМП-1 в стенке аорты после завершения комбинированного применения симвастатина и концентрата -3ПНЖК достоверно снизилась на 52,1% при сравнении с группой бывших курильщиков (ТИМП-1симв+ПНЖК29,75±9,12 и ТИМП-1б.курил61,98±20,45; z=-3,16 при p=0,001) и оказалась достоверно меньше показателей контрольной группы животных (ТИМП-1симв+ПНЖК29,75±9,12 и ТИМП-1контроль 51,58±12,46; z=-2,19 при p=0,03).У животных, получивших симвастатин, выявлено уменьшение содержания ТИМП-1 на 20,9% при сравнении с бывшими курильщиками, при этом абсолютные значения оптической плотности преципитата иммуногистохимической реакций к ТИМП-1 среди групп симвастатина, бывших курильщиков и контроля были сопоставимы (p 0,05). Интенсивность снижения плотности ТИМП-1 в группе -3ПНЖК оказалась минимальной среди всех режимов фармакологической коррекции. Плотность преципитата ТИМП-1 в группе -3ПНЖК уменьшилась на 12,2% от значений крыс - бывших курильщиков без статистически достоверной разницы.
Исходя из полученных данных, можно сделать вывод о максимальной эффективности использования комбинации симвастатина и концентрата 3ПНЖК для коррекции соединительнотканного дисметаболизма в стенке восходящей аорты экспериментальных животных после длительного табакокурения за счет максимального ингибирования ММП-9 и ММП-2, а также обоих тканевых ингибиторов. Сочетанное применение симвастатина и концентрата -3ПНЖК способно уменьшить интенсивность процессов протеолиза в соединительнотканном матриксе и замедлить процессы ремоделирования восходящего отдела аорты после длительного табакокурения у экспериментальных животных.