Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 16
1.1. Распределение в тканях и роль гликопротеина–Р 16
1.2. Структура и функционирование гликопротеина–Р 18
1.3. Субстраты, индукторы и ингибиторы гликопротеина–Р 21
1.4. Механизмы регуляции гликопротеина–Р 29
1.4.1. Механизмы индуцирования гликопротеина–Р 29
1.4.2. Ингибирование гликопротеина–Р 30
1.4.3. Роль стероидных гормонов в регуляции синтеза и функциональной активности гликопротеина–Р 31
1.5. Этинилэстрадиол и синтетические гестагены как потенциальные модуляторы функциональной активности гликопротеина–Р 35
1.5.1. Фармакологическая характеристика этинилэстрадиола 35
1.5.2. Фармакологическая характеристика гестодена 37
1.5.3. Фармакологическая характеристика диеногеста 40
1.5.4. Фармакологическая характеристика дроспиренона 42
1.5.5. Фармакологическая характеристика линестренола 44
Глава 2. Материалы и методы исследования 46
2.1. Экспериментальные животные 46
2.2. Дизайн исследования 46
2.3. Дозирование препаратов 49
2.4. Анализ функциональной активности гликопротеина–Р 50
2.4.1.Фармакокинетические методы исследования 52 2.
4.1.1.Отбор образцов плазмы крови 52
2.4.1.2.Экстракция фексофенадина из плазмы крови кроликов 52
2.4.1.3.Количественное определение фексофенадина в плазме крови кроликов 53
2.4.1.3.1. Параметры ВЭЖХ анализа фексофенадина в плазме крови кроликов 53
2.4.1.3.2. Определение калибровочной зависимости 54
2.4.1.4.Расчет основных фармакокинетических параметров фексофенадина 57
2.5. Определение относительного количества гликопротеина–Р на мембранах клеток 57
2.6. Биохимические методы исследования 59
2.7. Математико–статистическая обработка полученных результатов 59
Глава 3. Результаты исследования 61
3.1. Влияние курсового назначения комбинации этинилэстрадиола и гестодена на функциональную активность, относительное количество гликопротеина–Р на мембранах клеток и гормональный статус кроликов 61
3.2. Влияние курсового назначения комбинации этинилэстрадиола и диеногеста на функциональную активность, относительное количество гликопротеина–Р на мембранах клеток и гормональный статус кроликов 74
3.3. Влияние курсового назначения комбинации этинилэстрадиола и дроспиренона на функциональную активность, относительное количество гликопротеина–Р на мембранах клеток и гормональный статус кроликов 87
3.4. Влияние курсового назначения линестренола на функциональную активность, относительное количество гликопротеина–Р на мембранах клеток и гормональный статус кроликов 101
Глава 4. Заключение 117
Выводы 126
Список литературы 128
Благодарности 162
- Субстраты, индукторы и ингибиторы гликопротеина–Р
- Определение калибровочной зависимости
- Влияние курсового назначения комбинации этинилэстрадиола и диеногеста на функциональную активность, относительное количество гликопротеина–Р на мембранах клеток и гормональный статус кроликов
- Влияние курсового назначения линестренола на функциональную активность, относительное количество гликопротеина–Р на мембранах клеток и гормональный статус кроликов
Введение к работе
Актуальность. Широкое распространение полипрагмазии выводит на новый
уровень проблему лекарственных взаимодействий (Кукес В.Г. и соавт., М.: Гэотар –
Медиа, 2008. 293 с.; Сычев Д.А. и соавт., СПб.: ЦОП «Профессия», 2016. 224 с.).
Отдельную категорию пациентов, с позиции анализа лекарственных взаимодействий,
составляют лица с измененным гормональным статусом, а также получающие
гормонотерапию (Колпакова Т.А., Медицинский альянс. 2015. 2. С. 42–46; Смирнова О.М.
и соавт., Эффективная фармакотерапия. 2016. 37. С. 32– 43).
В прогнозировании и оценке межлекарственных взаимодействий все больший интерес исследователей и клиницистов отмечается к особенностям функционирования транспортных систем мембран клеток. Одно из ключевых мест среди транспортеров занимает гликопротеин–P (Pgp, ABCB1 белок), участвующий в выведении (эффлюксе) широкого спектра липофильных биобиотиков и ксенобиотиков из клетки. Учитывая значимость белков–транспортеров в развитии межлекарственных взаимодействий, регуляторы отдельных стран, например, FDA (Food and Drug Administration) в США, рекомендуют тестировать новые лекарственные средства на принадлежность к субстратам, индукторам и ингибиторам Pgp, а в инструкциях по применению указывать возможные взаимодействия на уровне Pgp.
Интерес представляют исследования взаимного влияния на функциональную активность Pgp совместного приема оральных гормональных контрацептивов и лекарственных веществ–субстратов белка–транспортера, так как оральные гормональные контрацептивы могут выступать в качестве самостоятельной стороны в формировании лекарственных взаимодействий, что в реальной клинической практике требует обязательного учета с целью коррекции доз.
Степень разработанности проблемы. Гормональная контрацепция является одним из высокоэффективных методов предохранения от нежелательной беременности. В настоящее время более 200 млн. женщин в мире применяют гормональные контрацептивы (Якушевская О.В. и соавт., Русский медицинский журнал. 2013. 23. С. 1122), и даже по самым скромным подсчетам к 2030 году эта цифра удвоится (United Nations, Department of Economic and Social Affairs, Population Division. 2015. 70 р.; United Nations, Department of Economic and Social Affairs, Population Division (2017). – NY: United Nations, 2017).
В ряде стран, в том числе и в России, в инструкциях по применению препаратов стали указывать возможные взаимодействия на уровне ферментных систем (цитохром P450) и белков–транспортеров (Pgp). Инструкции на многие оральные гормональные контрацептивы содержат указания о потенциальной неэффективности при совместном приеме с лекарственными веществами и лекарственными растениями, которые индуцируют Pgp (например, рифампицин, зверобой, ингибиторы протеаз, карбамазепин,
барбитураты и др.). Но также имеются данные о том, что синтез белка–транспортера и его функционирование регулируется эндокринной системой, а гормоны стероидной структуры принимают в этом непосредственное участие (Fedoruk M.N. et al., The Prostate. 2004. 59. 1. P. 77– 90; Frohlich M. et al., Biochemical Pharmacology. 2004. 68, 12. P. 2409– 2416; Kim W.Y. et al., Pharmaceutical Research. 2004. 21. 7. P. 1284–1293).
Однако отсутствуют публикации, отражающие влияние линестренола и
комбинаций этинилэстрадиола и гестодена, этинилэстрадиола и диеногеста,
этинилэстрадиола и дроспиренона на функциональную активность Pgp в условиях целостного организма.
Особенности структуры ряда компонентов оральных гормональных
контрацептивов позволяют предположить их влияние на белок–транспортер в качестве потенциальных ингибиторов функциональной активности и синтеза Pgp.
Кроме того, актуальным вопросом является выяснение и уточнение возможных
корреляционных зависимостей между изменением гормонального статуса и
фармакокинетическими параметрами фексофенадина – маркерного субстрата Pgp, а также относительным количеством Pgp на мембранах клеток, что можно оценить только в условиях целостного организма.
В данной связи необходимо изучить влияние оральных гормональных контрацептивов на функциональную активность и относительное количество белка– транспортера Pgp на мембранах клеток.
Цель исследования. Оценить влияние оральных гормональных контрацептивов, содержащих гестаген и гестагены в комбинации с этинилэстрадиолом на функциональную активность и относительное количество Pgp на мембранах клеток в условиях нормы.
Основные задачи исследования. Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
-
Изучить влияние курсового назначения комбинации этинилэстрадиола и гестодена на функциональную активность и относительное количество Pgp на мембранах клеток.
-
Изучить влияние курсового назначения комбинации этинилэстрадиола и диеногеста на функциональную активность и относительное количество Pgp на мембранах клеток.
-
Изучить влияние курсового назначения комбинации этинилэстрадиола и дроспиренона на функциональную активность и относительное количество Pgp на мембранах клеток.
-
Изучить влияние линестренола на функциональную активность и относительное количество Pgp на мембранах клеток.
5. Провести корреляционный анализ функциональной активности и относительного
количества Pgp на мембранах клеток с уровнем половых гормонов в крови при
назначении оральных гормональных контрацептивов.
Научная новизна. Впервые в эксперименте in vivo на кроликах изучено влияние оральных гормональных контрацептивов на функциональную активность и относительное количество Pgp на мембранах клеток на фоне нормы.
Впервые в эксперименте на кроликах показано влияние курсового введения в течение 21 дня комбинаций этинилэстрадиола в дозе 6,5 мкг/кг и гестагенов: гестодена в дозе 16,5 мкг/кг, диеногеста в дозе 450 мкг/кг и дроспиренона в дозе 650 мкг/кг на функциональную активность и относительное количество Pgp на мембранах клеток в условиях нормы.
Выявлено ингибирующее влияние курсового применения комбинации
этинилэстрадиола и гестодена на функциональную активность Pgp, о чем свидетельствуют изменения основных фармакокинетических параметров фексофенадина и уменьшение относительного количества белка–транспортера на мембранах гепатоцитов, энтероцитов и эндотелиоцитов ГЭБ, а также снижение уровня эндогенных регуляторов Pgp – эстрадиола и тестостерона.
Установлено ингибирующее влияние курсового применения комбинации этинилэстрадиола и диеногеста на функциональную активность Pgp, о чем свидетельствуют изменения основных фармакокинетических параметров фексофенадина и уменьшение относительного количества белка–транспортера на мембранах гепатоцитов и энтероцитов, а также снижение уровня эндогенного регулятора Pgp – прогестерона.
Выявлено ингибирующее влияние курсового применения комбинации
этинилэстрадиола и дроспиренона на функциональную активность Pgp, о чем свидетельствуют изменения основных фармакокинетических параметров фексофенадина и уменьшение относительного количества белка–транспортера на мембранах гепатоцитов и энтероцитов, а также снижение уровня эндогенных регуляторов Pgp – эстрадиола, прогестерона и тестостерона.
Установлено ингибирующее влияние 28–дневного курса линестренола в дозе 110
мкг/кг массы на функциональную активность Pgp, что подтверждается значимыми
изменениями фармакокинетических параметров маркерного субстрата белка–
транспортера – фексофенадина и снижением относительного количества белка– транспортера на мембранах гепатоцитов, эндотелиоцитов ГЭБ, и сопровождается уменьшением уровня эндогенных регуляторов Pgp – эстрадиола, прогестерона и тестостерона.
Впервые в эксперименте установлены корреляционные зависимости между изменением гормонального статуса кроликов, фармакокинетическими параметрами фексофенадина и относительным количеством Pgp на мембранах клеток на фоне курсового введения линестренола и комбинации гестагенов с этинилэстрадиолом в условиях нормы.
Теоретическая и практическая значимость работы. Результаты исследования показали ингибирующее влияние линестренола, комбинаций этинилэстрадиола и гестодена, этинилэстрадиола и диеногеста, этинилэстрадиола и дроспиренона на функциональную активность и снижение относительного количества Pgp на мембранах клеток. Полученные экспериментальные данные могут быть использованы в клинической практике с целью коррекции доз лекарственных средств–субстратов Pgp в сторону уменьшения в случае их комбинации с оральными гормональными контрацептивами, чтобы избежать повышения плазменной концентрации и возникновения нежелательных лекарственных реакций из–за ингибирования функциональной активности белка– транспортера. Терапия заболеваний лекарственными веществами–субстратами Pgp (дигоксин, варфарин, дабигатрана этексилата, ривароксибан, клопидогрел, доксорубицин, тетрациклин, цефазолин, цефоперазон, левофлоксацин, спарфлоксацин, пароксетин и др.) должна осуществляться с учетом возможных изменений их фармакокинетики в связи со снижением активности белка–транспортера на фоне линестренола, комбинаций этинилэстрадиола и гестодена, этинилэстрадиола и диеногеста, этинилэстрадиола и дроспиренона. Результаты работы позволяют использовать предложенные схемы введения оральных гормональных контрацептивов в качестве положительного контроля снижения функциональной активности Pgp с целью поиска веществ аналогичного действия, а также для прогнозирования возможной принадлежности изучаемых лекарственных веществ к числу субстратов белка–транспортера.
Методология и методы исследования. В работе использованы современные методы анализа функциональной активности, локализации и относительного количества Pgp, концентрации половых гормонов: аналитический – высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) с УФ–детектированием, фармакокинетический – модельно– независимый анализ фармакокинетики фексофенадина, иммуногистохимический – морфофункциональная оценка тканей, радиоиммунный – определение содержания половых гормонов и методы математической статистики. Исследование соответствует пунктам 4, 8 и 14 паспорта специальности «14.03.06 – Фармакология, клиническая фармакология».
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Комбинация этинилэстрадиола в дозе 6,5 мкг/кг и гестодена в дозе 16,5 мкг/кг, вводимая (в/ж) интактным кроликам в течение 21 дня, вызывает ингибирование
функциональной активности и уменьшение относительного количества Pgp на мембранах гепатоцитов, энтероцитов и эндотелия гематоэнцефалического барьера.
-
Комбинация этинилэстрадиола в дозе 6,5 мкг/кг и диеногеста в дозе 450 мкг/кг, вводимая (в/ж) интактным кроликам в течение 21 дня, вызывает ингибирование функциональной активности и уменьшение относительного количества Pgp на мембранах гепатоцитов и энтероцитов.
-
Комбинация этинилэстрадиола в дозе 6,5 мкг/кг и дроспиренона в дозе 650 мкг/кг, вводимая (в/ж) интактным кроликам в течение 21 дня, вызывает ингибирование функциональной активности и уменьшение относительного количества Pgp на мембранах гепатоцитов и энтероцитов.
-
Линестренол, вводимый (в/ж) интактным кроликам в дозе 110 мкг/кг в течение 28 дней, приводит к ингибированию функциональной активности и снижению относительного количества Pgp на мембранах гепатоцитов и эндотелия гематоэнцефалического барьера.
-
Уровень эстрадиола в сыворотке крови имеет обратные корреляционные связи средней силы с Сmax, AUC0–24 и AUC0– фексофенадина, прямые корреляционные связи средней силы с интенсивностью окраски Pgp–позитивных мембран гепатоцитов, а также прямые корреляционные связи высокой силы с относительной площадью Pgp–позитивных мембран гепатоцитов и интенсивностью окраски Pgp–позитивных мембран энтероцитов.
Уровень прогестерона в сыворотке крови имеет обратные корреляционные связи средней силы с AUC0–24 и МRT24 фексофенадина, прямые корреляционные связи средней силы с интенсивностью окраски и относительной площадью Pgp–позитивных мембран гепатоцитов, интенсивностью окраски Pgp–позитивных мембран энтероцитов, а также прямые корреляционные связи высокой силы с относительной площадью Pgp–позитивных мембран гепатоцитов и мембран эндотелия капилляров головного мозга.
Степень достоверности. Достаточный объем экспериментальных исследований, проведенных с использованием соответствующих поставленным задачам современных методов исследования, последующий анализ и комплексная статистическая обработка полученных данных обеспечивают высокую степень достоверности полученных результатов.
Личный вклад. Автором самостоятельно выполнен аналитический обзор литературы по изучаемой проблеме, разработана программа исследования, выполнена экспериментальная часть работы, проведены хроматографические исследования, анализ гистологических срезов, статистическая обработка и интерпретация полученных данных. По полученным результатам подготовлены публикации.
Внедрение результатов в практику. Результаты работы внедрены и используются в учебном процессе при обучении студентов и ординаторов на кафедре фармакологии с курсом фармации ФДПО ФГБОУ ВО РязГМУ Минздрава России.
Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы представлены на Всероссийской научной конференции, посвященной 90–летию со дня рождения профессора А.А. Никулина (Рязань, 2013), XIII–й международной конференции студентов и молодых ученых (Витебск, 2013), Всероссийской конференции молодых ученых с Международным участием, посвященной 150–летию со дня рождения академика Н.П. Кравкова (Рязань, 2015), III Всероссийской научной конференции молодых специалистов, аспирантов, ординаторов (Рязань, 2017), VII Международном молодежном медицинском конгрессе «Санкт–Петербургские научные чтения» (Санкт–Петербург, 2017), а также представлены на межкафедральном совещании кафедр фармакологии с курсом фармации ФДПО, нормальной физиологии с курсом психофизиологии, патофизиологии, биологической химии с курсом клинической лабораторной диагностики ФДПО, неврологии и нейрохирургии, общей и фармацевтической химии, фармакогнозии с курсом ботаники, биологии, сестринского дела ФГБОУ ВО РязГМУ Минздрава России с привлечением заинтересованных лиц 15 января 2018 г.
Публикации. Результаты исследования опубликованы в 5 статьях в ведущих рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки России, 1 патенте Российской Федерации и 7 тезисах докладов в материалах Российских и международных конференций.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 162 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания используемых материалов и методов исследования, обсуждения результатов, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, включающего 256 источников, из них 39 – отечественных и 217 – зарубежных источников. Работа иллюстрирована 25 таблицами и 54 рисунками. Диссертация выполнялась по основному плану научно–исследовательских работ ФГБОУ ВО РязГМУ Минздрава России.
Субстраты, индукторы и ингибиторы гликопротеина–Р
В настоящий момент все соединения, взаимодействующие с Pgp, можно разделить на три категории: субстраты, ингибиторы и индукторы белка– транспортера.
Субстраты представляют собой молекулы, которые активно транспортируются Pgp. Большинство из них являются гидрофобными соединениями, способными свободно проникать через мембрану пассивной диффузией и беспрепятственно связываться с сайтом белка–транспортера [198]. К ним относятся слабые органические основания, некоторые органические катионы и анионы, незаряженные органические соединения, например, полипептиды и их производные. Pgp транспортирует довольно обширную группу лекарственных средств: сердечные гликозиды (дигоксин), антиагреганты (клопидогрел, тикагренол) и антикоагулянты (дабигатрана этексилат, ривароксабан), статины (аторвастатин, симвастатин), антибактериальные средства (тетрациклин, цефазолин, цефоперазон, левофлоксацин, спарфлоксацин), антигистаминные средства (фексофенадин), антидепрессанты (пароксетин), ингибиторы ВИЧ–протеиназы, цитостатики (доксорубицин), стероидные гормоны (гидрокортизон, дексаметазон), флуоресцентные красители и т.д. [9, 17, 240]. Ряд лекарственных веществ может изменять активность Pgp [9, 33, 34].
Ингибиторы понижают функциональную активность белка–транспортера, что замедляет выведение лекарственных веществ–субстратов Pgp и приводит к возникновению нежелательных лекарственных реакций. Индукторы, напротив, повышают его активность, ускоряют удаление субстратов, что может привести к изменениям их фармакокинетики и стать причиной снижения эффективности фармакотерапии. Необходимо отметить, что индукция Pgp не имеет существенного клинического значения. Явление ингибирования белка– транспортера может иметь практическое значение, так как это один из способов предотвращения МЛУ.
В настоящее время существует множество способов прогнозирования принадлежности веществ к субстратам, индукторам или ингибиторам Pgp. Разработаны компьютерные модели и программы, которые на основе структурных свойств лигандов и пространственного расположения функциональных групп в молекуле позволяют с довольно большой точностью прогнозировать принадлежность исследуемого вещества к той или иной группе [91]. К ним относятся, например, автоматическая оценка свойств [236], QSAR– исследования (Quantitative Structure–Activity Relationship) [93], фармакофорное моделирование [194], стыковки в гомологии моделей [146], ряд правил, сформированных V. Poongavanam с соавторами и другие способы. Таким образом, при помощи всех моделей и правил возможно предсказать более 80% ингибиторов Pgp с точностью прогнозирования около 70% [198].
Согласно рекомендациям FDA c 2010 все новые лекарственные средства в обязательном порядке подвергаются исследованиям по оценке влияния на белок–транспортер in vitro на культурах клеток с гиперэкспрессией гена MDR1. При подтверждении принадлежности веществ к субстратам или ингибиторам от опытов in vitro переходят к исследованиям in vivo, где оценивается изменение фармакокинетики при совместном введении с сильными селективными ингибиторами и индукторами Pgp. Принадлежность исследуемого вещества к ингибиторам Pgp in vivo оценивают по изменению фармакокинетики маркерного субстрата, замедление выведения которого свидетельствует об ингибирующем влиянии на белок–транспортер. Оценка индуцирующего влияния веществ на Pgp происходит подобным образом. Так как механизмы индукции CYP3A4 и Pgp сходны между собой, то по данным об индукции CYP3A4 под действием тестируемого вещества, можно косвенно судить о его подобном влиянии и на Pgp. Если исследуемое вещество in vitro или in vivo не индуцирует CYP3A4, то дальнейшее исследование относительно его влияния на Pgp является нецелесообразным [118].
Известно, что многие вещества характеризуются амбивалентностью по отношению к Pgp, т.е. в зависимости от различных условий (концентрация, влияние других веществ и факторов), могут по–разному действовать на белок– транспортер. Диаграмма Венна (рисунок 5) наглядно демонстрирует данное свойство.
На диаграмме Венна круг, ограниченный непрерывной линией, включает в себя соединения – ингибиторы Pgp. Пунктиром ограничены некоторые соединения – индукторы белка–транспортера, а точками – его субстраты. При этом видно, что ряд веществ попадает в различные диапазоны. Под N на диаграмме Венна предполагается верапамил, дилтиазем и большинство ингибиторов первого поколения (таблица 1), а также субстратов, способных конкурентно ингибировать Pgp. Таким образом, существуют ингибиторы Pgp, которые также являются субстратами данного белка–транспортера. Например, пропафенон и его метаболиты 5–гидрокси–пропафенон и N– дезалкилпропафенон. Это конкурентные ингибиторы, поскольку они конкурируют с другими субстратами за сайт связывания, таким образом, способствуют внутриклеточному накоплению этих субстратов [52].
Классическим примером амбивалентного влияния на функциональную активность Pgp могут служить хинидин и ампренавир. Они выступают в качестве субстратов, ингибиторов, а также индукторов Pgp в зависимости от дозы и прочих факторов.
Такие вещества, как прогестерон, гомисин А (gomisin A – соединение, выделенное из лимонника китайского), валсподар (valspodar), элакридар (elacridar), в исследованиях на культуре клеток эпителия кишечника человека (Т84), являются только ингибиторами Pgp и не принадлежат к числу его субстратов. Они не взаимодействуют с сайтом связывания и не транспортируются за счет Pgp, но при этом неконкурентно ингибируют функциональную активность белка–транспортера [123, 124]. На линии клеток яичника китайского хомячка (CR1R12) установлено, что прогестерон является очень эффективным ингибитором Pgp, а в присутствии верапамила ингибирующая активность прогестерона увеличивается в несколько раз, за счет того, что верапамил увеличивает сродство прогестерона к сайту связывания [160]. Кроме того, прогестерон, не являясь субстратом белка–транспортера [120, 231], оказывает влияние на АТФазу Pgp, нарушает процесс связывания Pgp с субстратами или изменяет активность сайта, ответственного за перенос субстратов [246]. Это подтверждается тем, что замена в молекуле Pgp аминокислоты глицина в положении 185 на валин сопровождается значимыми изменениями функциональной активности Pgp [210]. Введение в C–17 положение молекулы прогестерона заместителей приводит к возрастанию его способности ингибировать функциональную активность белка–транспортера и связываться с прогестероновыми рецепторами, что приводит к потере гормонального эффекта. Это позволяет использовать синтетические C–17– аналоги прогестерона в качестве мощных ингибиторов Pgp в терапии многих заболеваний [156].
Ингибиторы Pgp классифицируются на три поколения (таблица 1). Эта классификация основывается на их специфичности, аффинности и токсичности. Она разработана на базе скрининга соединений, которые оказывают на белок– транспортер то или иное влияние. Была проведена систематизация этих данных. При помощи компьютерных технологий и химического синтеза разработаны новые вещества, которые являются менее токсичными, более селективными ингибиторами Pgp. Они могут применяться как в исследованиях по изучению белка–транспортера, так и в клинической практике.
Определение калибровочной зависимости
Количественное определение концентрации фексофенадина в плазме крови кроликов проводили методом абсолютной калибровки. Калибровочные растворы готовили добавлением в интактную плазму животных необходимого количества матричного раствора стандарта фексофенадина гидрохлорида с концентрацией 10 мкг/мл.
Калибровочную зависимость определяли в диапазоне 25 – 1000 нг/мл. Характеристики количественного определения фексофенадина представлены в таблице 4.
Mean - среднее арифметическое; SD - стандартное отклонение среднего арифметического; 95% CL - 95% доверительный интервал; CV,% - коэффициент вариации; 5,%- относительная величина систематической ошибки
Полученные результаты свидетельствуют о приемлемой точности (accuracy), повторяемости (repeatability) и прецизионности (precision) используемой методики, которые соответствовали требованиям, предъявляемым к биоаналитическим исследованиям [117].
Установлено, что зависимость концентраций фексофенадина от высоты его пика имеет линейный характер и описывается уравнением: y=10,6111+14,1107x, где x – значение высоты пика фексофенадина, а у – его концентрация. Коэффициент корреляции (R2)=0,9994.
На основании полученных данных были рассчитаны фармакокинетические параметры фексофенадина в плазме крови кроликов (таблица 5). Расчеты проводили модельно–независимым методом с использованием программы «Kinetica 5.0».
Для определения относительного количества Pgp на мембранах клеток использовали непрямой иммуногистохимический метод. Исследование выполняли в Центральной Научно–Исследовательской Лаборатории ФГБОУ ВО РязГМУ Минздрава России.
Кроликов выводили из эксперимента методом воздушной эмболии. Метод эвтаназии подобран в соответствии с этическими стандартами [16]. Производили забор образцов внутренних органов лабораторных животных (печень, почки, тонкий кишечник и кора больших полушарий головного мозга). Образцы фиксировали в 10%–ном растворе нейтрального формалина. Выбор тканей для исследования обусловлен локализацией Pgp и их ролью в фармакокинетике – процессах абсорбции, распределения и элиминации лекарственных веществ [181].
Подготовку гистологического материала проводили стандартным методом: обезвоживание в растворах этилового спирта возрастающей концентрации, просветление ксилолом, заключение в парафин. Перед реакцией иммунного окрашивания производили демаскировку антигенов тканей нагреванием на водяной бане в 10 мМ цитратном буфере (рН 6,0). Блокировали эндогенную пероксидазу 3%–ным раствором пероксида водорода. Затем срезы инкубировали с первичными антителами к Pgp (Mdr–1 3H2833: sc–71557 «Santa cruz biotechnology, Inc», США) в разведении 1:50 по стандартной методике. Для иммунного окрашивания применяли полимерную систему детекции с пероксидазной меткой («Dako», Дания). Ядра клеток докрашивали гематоксилином.
Микропрепарат фотографировали при увеличении в 400 раз цифровой камерой Canon Power Shot G5. В каждом гистологическом препарате оценивали 10 репрезентативных участков (10 фотографий). В дальнейшем анализировали изображения с использованием программы для анализа и обработки цифровых изображений ImageJ (США), которая позволяет провести количественный иммуногистохимический анализ [233]. С помощью специального плагина «Colour Deconvolution», изображение разделяли на слой, окрашенный гематоксилином и диаминобензидином [102]. При помощи модуля Histogram определяли интенсивность окраски мембран в тонком кишечнике, печени, почках и ГЭБ. Полученные значения переводили в условные единицы (у.е.), используя формулу у.е. = 255 – (полученное модулем Histogram значение интенсивности окраски) [102] и «+», используя формулу интенсивность окраски в «+» = 3–0,008 (полученное модулем Histogram значение интенсивности окраски) (0 – отсутствие окраски, «+» – слабая окраска, «++» – умеренная окраска, «+++» – высокая окраска). С помощью модуля Analyze Particles в печени и мозге определяли относительную площадь Pgp–позитивных мембран, которая рассчитывалась как отношение Pgp–позитивных мембран к общей площади поля зрения, умноженное на 100% [175].
Влияние курсового назначения комбинации этинилэстрадиола и диеногеста на функциональную активность, относительное количество гликопротеина–Р на мембранах клеток и гормональный статус кроликов
В соответствии с целями и задачами настоящего исследования проведена оценка влияния курсового применения (курс 14 и 21 день) комбинации этинилэстрадиола (6,5 мкг/кг) и диеногеста (450 мкг/кг) на функциональную активность Pgp у кроликов. Оценивали характер изменения фармакокинетических параметров фексофенадина (67,5 мг/кг) после его однократного введения.
Динамика индивидуальных значений плазменных концентраций фексофенадина у интактных животных, кроликов на фоне 14 и 21 дневного курсового введения комбинации этинилэстрадиола (6,5 мкг/кг) и диеногеста (450 мкг/кг) в серии повторных измерений представлена в таблице 11.
Индивидуальные фармакокинетические кривые фексофенадина у интактных кроликов и животных после курсового введения комбинации этинилэстрадиола (6,5 мкг/кг) и диеногеста (450 мкг/кг) представлены на рисунках 25–27; усредненные фармакокинетические кривые – на рисунке 28.
Индивидуальные фармакокинетические параметры фексофенадина у кроликов на фоне курсового введения комбинации этинилэстрадиола и диеногеста представлены в таблице 12.
Динамика параметров фармакокинетики фексофенадина у кроликов на фоне курсового применения комбинации этинилэстрадиола (6,5 мкг/кг) и диеногеста (450 мкг/кг) представлена в таблице 13.
Введение кроликам комбинации этинилэстрадиола в дозе 6,5 мкг/кг и диеногеста в дозе 450 мкг/кг сопровождалось достоверным изменением ряда изучаемых фармакокинетических показателей фексофенадина, как на 14, так и на 21 день исследования. Применение комбинации гормонов в течение 14 дней приводило к достоверному повышению Стах фексофенадина на 263% (р0,05), AUCo–24 на 597,4% (р0,05), AUC0– на 652,7% (р0,05), МRT24 на 24,6% (р0,05), снижению Cl на 90,5% (р0,05), Vd на 77,4% (р0,05), и Сmax/AUC0– на 40% (р0,05) по сравнению с исходными показателями.
Введение комбинации этинилэстрадиола и диеногеста в течение 21 дня вызывало повышение Стах фексофенадина на 224,5% (р0,05), Тш на 152,9% (р0,05), AUCo–24 на 501,3% (р0,05), AUC0– на 902,6% (р0,05), МRT24 на 30,1% (р0,05), МRT на 125,3% (р0,05), снижение Cl на 92,3% (р0,05), Vd на 77,2% (р0,05), Ке1 на 66,7% (р0,05) и Сmax/AUC0–t на 46,7% (р0,05), Стах / AUCo– на 61,4% (р0,05) в сравнении с данными интактных животных. Увеличение концентрации фексофенадина в крови и снижение его выведения свидетельствуют об ингибировании транспортной функции Pgp.
После введения комбинации этинилэстрадиола и диеногеста курсом 21 день, по сравнению с фармакокинетическими параметрами фексофенадина, полученными на 14 день введения гормональных веществ, наблюдалось достоверное увеличение Ті/2 на 83,2% (р0,05), МRT на 73% (р0,05), снижение Ке1 на 40% (р0,05) и Сmax /AUC0– на 45,8% (р0,05).
Достоверных различий между Ттах фексофенадина у кроликов до и после введения изучаемой комбинации гормональных препаратов обнаружено не было (р 0,05).
На фоне введения комбинации этинилэстрадиола (6,5 мкг/кг) и диеногеста (450 мкг/кг) изучалась динамика уровня половых гормонов кроликов: эстрадиола, прогестерона и тестостерона. Данные, полученные в результате эксперимента, представлены в таблице 14.
Выявлено достоверное снижение концентрации прогестерона на 21 день введения комбинации этинилэстрадиола и диеногеста на 37,4% (р0,05) от исходных значений и на 26,1% (р0,05) по сравнению с данными, полученными на 14 день введения изучаемой комбинации. Наблюдается тенденция к снижению концентрации эстрадиола на 34,5% (р 0,05) на 21 день эксперимента. Уровень тестостерона в ходе исследования практически не изменялся. Достоверных различий между уровнями половых гормонов на 14 и 21 дни применения изучаемой комбинации выявлено не было.
Поскольку более выраженные достоверные изменения фармакокинетических параметров фексофенадина, свидетельствующие о снижении функциональной активности Pgp, были выявлены на 21 день введения комбинации этинилэстрадиола и диеногеста, относительное количество белка–транспортера на мембранах клеток изучалось только на данном сроке эксперимента. Анализу подвергались гистологические срезы печени, тонкого кишечника, почек и мозга (рисунки 29–32). После введения кроликам этинилэстрадиола (6,5 мкг/кг) и диеногеста (450 мкг/кг) установлено достоверное (p 0,05) снижение интенсивности окраски Pgp–позитивных мембран гепатоцитов, в у.е. на 21,7% (р0,05), относительной площади Pgp–позитивных мембран гепатоцитов на 52,5 % и интенсивности окраски Pgp–позитивных мембран энтероцитов, в у.е. на 42,16% (р0,05). Наблюдается тенденция к снижению интенсивности окраски и относительной площади Pgp–позитивных мембран эндотелия капилляров головного мозга на 13,6% и 13,2% соответственно (p 0,05) (таблица 15).
На рисунке 33 представлены корреляционные зависимости изучаемых фармакокинетических параметров и относительного количества Pgp на мембранах клеток от показателей гормонального статуса кроликов. Выявлена обратно пропорциональная связь между уровнем прогестерона и AUC0–24 (Rs= – 0,39) (р0,05), а также прямо пропорциональная связь между уровнем прогестерона и Cmax/AUC0– (Rs= 0,58) (р0,05), Cl (Rs= 0,39) (р0,05), Vd (Rs=0,50) (р0,05), интенсивностью окраски Pgp–позитивных мембран гепатоцитов (Rs=0,66) (р0,014), относительной площадью Pgp–позитивных мембран гепатоцитов (Rs=0,69) (р0,009) и интенсивностью окраски Pgp– позитивных мембран энтероцитов (Rs=0,59) (р0,033).
Таким образом, корреляционная зависимость свидетельствует о том, что при снижении концентрации прогестерона в организме животных, снижается выведение фексофенадина и относительное количество белка–транспортера Pgp на мембранах гепатоцитов и энтероцитов, а, следовательно, и функциональная активность Pgp, но нельзя исключать и прямого влияния на Pgp компонентов исследуемой комбинации гормональных веществ.
Таким образом, при введении комбинации этинилэстрадиола (6,5 мкг/кг) и диеногеста (450 мкг/кг) выявлено ингибирование функциональной активности Pgp на уровне целостного организма, о чем свидетельствует изменение основных параметров фармакокинетики фексофенадина – маркерного субстрата Pgp и относительного количества изучаемого белка– транспортера на мембранах клеток. Установлены корреляционные связи средней силы между функциональной активностью, относительным количеством Pgp на мембранах гепатоцитов и энтероцитов и уровнем прогестерона в сыворотке крови кроликов.
Полученные результаты опубликованы в статье: Якушева Е.Н. Влияние орального гормонального контрацептива «Жанин» на функциональную активность гликопротеина–Р / Е.Н. Якушева, А.А. Котлярова, А.А. Никифоров // Российский медико–биологический вестник им. академика И.П. Павлова. – 2013. – №4. – С. 65–70 [31].
Влияние курсового назначения линестренола на функциональную активность, относительное количество гликопротеина–Р на мембранах клеток и гормональный статус кроликов
Реализуя цели и задачи настоящего исследования, проведена оценка влияния курсового введения (курс 14, 21 и 28 дней) линестренола (110 мкг/кг) на функционирование Pgp у кроликов. Функциональную активность белка– транспортера оценивали по изменению основных фармакокинетических параметров фексофенадина при его однократном введении в дозе 67,5 мг/кг.
Динамика индивидуальных значений плазменных концентраций фексофенадина у интактных животных, кроликов на фоне 14, 21 и 28 дневного курсового введения линестренола (110 мкг/кг) в серии повторных измерений представлена в таблице 21.
Индивидуальные фармакокинетические кривые фексофенадина у кроликов до и после 14, 21 и 28 дневного курсового введения линестренола (110 мкг/кг) представлены на рисунках 44–47; усредненные фармакокинетические кривые – на рисунке 48. Индивидуальные фармакокинетические параметры фексофенадина у интактных кроликов, на фоне 14, 21 и 28–дневного курсового введения линестренола (110 мкг/кг) представлены в таблице 22.
Введение кроликам линестренола в дозе ПО мкг/кг в течение 14 дней приводило к достоверному повышению Стахфексофенадина на 155,4% (р 0,05), AUCo-24 на 180,1% (р 0,05), AUCo-ооНа 367,5% (р 0,05), Тш на 241,5% (р 0,05), MRT24 на 18,7% (р 0,05), MRT на 137,2% (р 0,05), снижению С1 на 82,2% (р 0,05), Vd на 39,8% (р 0,05), Kd на 70,9% (р 0,05), Cmax / AUC0_24 на 42,9% (р 0,05) и Cmax/AUC0_oo на 63,6% (р 0,05) по сравнению с исходными показателями.
Применение исследуемого вещества в течение 21 дня также сопровождалось достоверным изменением ряда изучаемых фармакокинетических показателей: наблюдалось повышение Стах фексофенадина на 204,8% (р0,05), AUCo– на 363,0% (р0,05), МRT на 82,5% (р0,05), снижение Cl на 80,3% (р0,05), Vd на 59,7% (р0,05), Ке1 на 54,3% (р0,05) в сравнении с данными интактных животных.
Введение изучаемого гормонального вещества курсом 28 дней вызывало достоверное увеличение Стах фексофенадина на 229,3% (р0,05), AUC0– на 610,9% (р0,05), Туг на 231,2% (р0,05), МRT24 на 16,9% (р0,05), МRT на 141,8% (р0,05), снижение Cl на 86,8% (р0,05), Vd на 65,9% (р0,05), Ке1 на 68,9% (р0,05) и Сmax/AUC0– на 54,5% (р0,05) по сравнению с исходными данными.
Достоверных различий между Тmax, AUC0-24 и Стах / AUC0-24 фексофенадина у кроликов до и после введения изучаемого гормонального вещества обнаружено не было.
На фоне введения линестренола (110 мкг/кг) изучалась динамика сывороточных концентраций половых гормонов кроликов: эстрадио ла, прогестерона и тестостерона (таблица 24)
Наблюдалось значимое снижение концентрации прогестерона на 21 день введения препарата на 59,3% (р0,05), на 28 день – на 48,2% (р0,05), снижение концентрации эстрадиола на 33,5% (р0,05) и тестостерона на 47,3% (р0,05) на 28 день введения линестренола по сравнению с исходными значениями.
Поскольку наиболее выраженные изменения фармакокинетических параметров фексофенадина, свидетельствующие об угнетении функциональной активности Pgp, были выявлены на 28 день введения линестренола (110 мкг/кг), относительное количество белка–транспортера на мембранах клеток изучалось только на данном сроке эксперимента. Анализу подвергались гистологические срезы печени, тонкого кишечника, почек и мозга (рисунки 49–52).
После введения кроликам линестренола (110 мкг/кг) установлено достоверное (p 0,05) снижение интенсивности окраски Pgp–позитивных мембран гепатоцитов, в у.е. на 25,3% (р0,05), снижение относительной площади Pgp–позитивных мембран гепатоцитов на 53,9% (р0,05), и относительной площади Pgp–позитивных мембран эндотелия капилляров головного мозга на 38,1% (р0,05).
Наблюдалась тенденция к снижению интенсивности окраски Pgp– позитивных мембран эндотелия капилляров головного мозга, не имеющая достоверного характера (p 0,05). Относительное количество Pgp на мембранах энтероцитов не изменялось (таблица 25).
На рисунке 53 представлены корреляционные зависимости изучаемых фармакокинетических параметров фексофенадина от показателей гормонального статуса кроликов. Выявлена обратно пропорциональная связь между уровнем эстрадиола и AUC0–24 (Rs= –0,42) (р=0,005), AUC0– (Rs= –0,43) (р=0,007), а также прямо пропорциональная связь между уровнем эстрадиола и Cmax/AUC0–24 (Rs= 0,38) (р=0,015), Cmax/AUC0– (Rs= 0,34) (р=0,035), и Vd (Rs=0,34) (р=0,030).
Уровень прогестерона и Vd также находятся в прямо пропорциональной связи (Rs=0,35) (p=0,028). Но более сильное влияние на Vd, по данным нашего исследования, оказывает тестостерон. Наблюдалась прямо пропорциональная связь между уровнем тестостерона и Vd (Rs=0,43) (p=0,006). Уровень тестостерона также оказывает влияние на Cl фексофенадина (Rs=0,43) (p=0,050).
На рисунке 54 представлена оценка корреляционных зависимостей относительного количества Pgp на мембранах гепатоцитов и эндотелия капилляров головного мозга от показателей гормонального статуса кроликов. Выявлена прямо пропорциональная связь между уровнем прогестерона и относительной площадью Pgp–позитивных мембран гепатоцитов (Rs=0,89) (р0,01), интенсивностью окраски Pgp–позитивных мембран гепатоцитов (Rs=0,68) (р0,04), и интенсивностью окраски Pgp–позитивных мембран эндотелия капилляров головного мозга (Rs=0,90) (р0,005).
Таким образом, при курсовом введении (курс 14, 21 и 28 дней) линестренола (110 мкг/кг) выявлено снижение функциональной активности Pgp, установленное по изменению ряда основных фармакокинетических параметров фексофенадина и снижение относительного количества Pgp на мембранах клеток. Установлены корреляционные связи между функциональной активностью, относительным количеством Pgp на мембранах клеток и гормональным статусом кроликов. Выявлены корреляционные связи высокой силы между уровнем прогестерона и относительным количеством Pgp на мембранах гепатоцитов и эндотелия капилляров головного мозга.
Полученные результаты опубликованы в статье: Якушева, Е.Н. Половые различия функциональной активности и экспрессии гликопротеина–Р у кроликов / Е.Н. Якушева, И.В. Черных, А.В. Щулькин, А.А. Котлярова, А.А. Никифоров // Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова. – 2014. – Т. 100, №8. – C. 944–952 [36].
Патент 2553362 РФ, МПК G09B23/28. Способ моделирования состояния ингибирования функциональной активности гликопротеина–Р линестренолом в эксперименте / А.А. Котлярова, Е.Н. Якушева; патентообладатель: ФГБОУ ВО РязГМУ Минздрава России. – № 2014100531. – заявл. 09.01.2014; опубл. 18.05.2015.