Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 13
1.1. Фармакологические и физиологические эффекты мелатонина в норме и патологии 13
1.2. Стресс-индуцированные изменения органов желудочно-кишечного тракта и способы их коррекции 25
Глава 2. Материалы и методы исследования 31
2.1. Экспериментальные животные 31
2.2. Используемые препараты 31
2.3. Определение типологической принадлежности животных 32
2.4. Экспериментальная модель острого иммобилизационного стресса и хронического стресса ограничения подвижности 33
2.5. Определение биохимических показателей, характеризующих функциональную активность печени и состояние прооксидантно-антиоксидантного баланса 34
2.6. Определение биохимических показателей, характеризующих функциональную активность пародонта и состояние прооксидантно-антиоксидантного баланса 36
2.7. Морфологическое исследование тканей пародонта и печени 38
2.8. Морфологическое исследование ткани печени 38
2.9. Статистическая обработка материала 39
ГЛАВА 3. Результаты собственных исследований 40
3.1 Изучение фармакологического влияния мелатонина на поражения пародонта стресс-устойчивых и стресс-неустойчивых крыс Вистар, перенесших хронический или острый стресс 40
3.2. Фармакологические эффекты мелатонина на синтетическую функцию печени и состояние прооксидантно-антиоксидантного баланса у животных, перенесших острый или хронический стресс 52
3.3. Фармакологическое действие мелатонина на морфологические нарушения ткани печени стресс-устойчивых и стресс-неустойчивых крыс Вистар, перенесших хронический или острый иммобилизационный стресс. 76
Заключение 91
Выводы 105
Практические рекомендации 106
Список литературы 107
- Стресс-индуцированные изменения органов желудочно-кишечного тракта и способы их коррекции
- Экспериментальная модель острого иммобилизационного стресса и хронического стресса ограничения подвижности
- Определение биохимических показателей, характеризующих функциональную активность пародонта и состояние прооксидантно-антиоксидантного баланса
- Фармакологические эффекты мелатонина на синтетическую функцию печени и состояние прооксидантно-антиоксидантного баланса у животных, перенесших острый или хронический стресс
Введение к работе
Актуальность избранной темы
Серьезной проблемой современного общества является всеобщая подверженность стрессовым воздействиям. Многочисленными работами российских и зарубежных ученых показано, что при стрессе нарушаются различные физиологические функции, в том числе, эндокринных желез, сердечнососудистой и дыхательной систем, развиваются выраженные метаболические изменения (Судаков К.В., 2008).
Показано, что одним из органов-мишеней стресса является печень, в которой под влиянием чрезвычайных факторов развиваются выраженные нарушения структуры ткани, проявляющиеся гидропической дистрофией, расширением сосудистого русла, нарушением регенерации гепатоцитов (Выборова И.С., 2005). Также при стрессе наблюдаются расстройства обмена веществ, что, учитывая важную роль печени в процессах метаболизма, указывает на развитие функциональных расстройств в этом органе (Иванов Д.Е., 1998).
В современной литературе накоплены многочисленные данные о том, что хронический стресс и сопровождающее его усиление перекисного окисления липидов вызывают деструкцию и дисфункцию пародонта (Гожая И.Н., 2012), нарушают организацию органического матрикса костной ткани пародонта (Не-порада К.С., 2003).
Пародонт является одной из тканей, структурная и функциональная полноценность которой, тесно связана с активностью печени. В частности, установлены особенности течения пародонтита у крыс с токсическим повреждением печени (Вохминцева Л.В., 2007). Показано, что развитие патологии печени сопровождается нарушениями во всех тканях пародонта (Анисимов В.Н., 2000). Расстройства обмена витаминов С, А, D, возникающие при поражении печени, приводят к нарушениям синтеза коллагена, формирования десны и резорбции альвеолярной кости. Учитывая высокую чувствительность резистивных сосудов пародонта к регуляторным влияниям, нарушения регуляции сосудистого тонуса при заболеваниях печени сопровождаются расстройством микроциркуляции в пародонте (Арушанян Э.Б., 2012).
В этой связи поиск новых средств фармакологического воздействия на развитие стресс-индуцированных поражений пародонта и печени приобретает особую актуальность.
В последние годы установлено, что эпифизарный гормон мелатонин является важным компонентом антистрессорной системы организма. Показано, что под влиянием различных стрессоров в эпифизе происходит накопление его предшественника (Reiter R.J., 2013). Секреция мелатонина подвержена точному суточному ритму: максимум в темное время суток и минимум в светлое, поэтому предъявление стрессорного фактора в вечернее и ночное время значительно усиливает продукцию это гормона. Мелатонин оказывает регулирующее влияние на стресс-лимитирующие системы мозга, в первую очередь ГАМК- и до-фаминергические структуры, снижает стресс-индуцированную активацию ги-3
пофизарно-гипоталамо-надпочечниковой системы (Shi L., 2013), подавляет вызванную стрессом активацию перекисного окисления липидов (Арушанян Э.Б., 2012). Этот гормон также предупреждает угнетение иммунного ответа и продукцию интерлейкинов, что наблюдается при различных видах стресса, оказывает противоспалительное действие и анальгетическое действие (Арушанян Э.Б., 2012, 2013; Calvo J.R., 2013). Показано изменение содержание мелатонина у людей, страдающих заболеваниями пародонта (Almughrabi O.M., 2013), а также влияние нехирургического лечения таких поражений на концентрацию гормона в слюнных железах (Bertl K., 2013).
Совокупность уникальных свойств мелатонина делает перспективным использование синтетических аналогов гормона в клинической практике (Ару-шанян Э.Б., 2014; Bubenik G.A., 2011).
В связи с вышесказанным представляет интерес анализ перспектив использования мелатонина для коррекции стресс-индуцированных поражений печени и пародонта.
Степень разработанности темы
Избранная тема является новой, так как в литературе отсутствуют данные о влиянии мелатонина на стресс-индуцированные изменения в пародонте. Исследования, посвященные эффектам мелатонина на изменения в печени животных, перенесших стресс, являются единичными, носят фрагментарный характер.
Диссертационная работа представляет собой комплексное исследование фармакологических эффектов мелатонина на развитие изменений в пародонте и печени при различных видах стресса. Использованы модели острого и хронического стрессов, изучена зависимость эффектов мелатонина от использованной дозы. Проведен комплексный анализ морфо-функциональных нарушений в па-родонте и печени с использованием гистологических, планиметрических, биохимических методов. Работа выполнена на животных различных типологических групп: стресс-устойчивых и стресс-неустойчивых, что обосновывает принципы использования мелатонина с учетом индивидуальных особенностей организма. Выводы, сделанные автором, обоснованы и вытекают из результатов экспериментальных исследований.
Цель исследования: повышение эффективности фармакологической коррекции стресс-индуцированных поражений пародонта и печени у животных путем применения мелатонина.
Задачи исследования:
выяснение особенностей поражения печени и пародонта при остром и хроническом стрессе у животных различных типологических групп;
анализ влияния мелатонина на стресс-индуцированные поражения паро-донта животных;
исследование фармакологических эффектов мелатонина на нарушения синтетической функции печени у животных, подвергшихся стрессу;
- выяснение действия мелатонина на состояние прооксидантно-
антиоксидантного баланса и изменения в системе ферментов антиоксидантной
защиты в тканях печени и пародонта при остром и хроническом стрессе;
сравнительное изучение фармакологического влияния мелатонина на морфологические и функциональные нарушения гепатоцитов при остром и хроническом стрессе.
разработка метода применения мелатонина для коррекции патологических изменений в печени и пародонте при стрессе.
Научная новизна
В работе впервые проведен сравнительный анализ морфологических и функциональных изменений в пародонте и печени у животных различных типологических групп, перенесших острый или хронический стресс.
Установлено, что применение мелатонина уменьшает выраженность морфологических и функциональных нарушений пародонта, возникающих при хроническом стрессе, у стресс-устойчивых и стресс-неустойчивых крыс Вистар. Впервые показано, что его стресс-протективное действие активнее проявляется у животных с низкой устойчивостью к стрессу. Впервые выявлено, что механизм действия мелатонина на морфо-функциональное состояние пародонта при стрессе включает нормализацию прооксидантно-антиоксидантного баланса, стимуляцию адаптационных изменений в системе антиоксидантных ферментов, предупреждение снижения содержания коллагеновых белков и небелковых компонентов соединительно-тканного матрикса пародонта.
Впервые проведен сравнительный анализ фармакологического влияния мелатонина на стресс-индуцированные изменения синтетической функции печени при остром и хроническом стрессе у лабораторных животных. Установлено его корригирующее действие на белковый и липидный обмен при остром и хроническом стрессе у крыс.
В работе впервые выполнен комплексный анализ влияния мелатонина на морфологические и функциональные нарушения в печени, возникающие у животных различных типологических групп, при остром и хроническом стрессе и установлено его стресс-протективное действие.
Показано, что эффекты мелатонина на развитие стресс-индуцированных нарушений в пародонте и печени носят дозо-зависимый характер.
Теоретическая и практическая значимость работы
Выполнено комплексное исследование фармакологических эффектов ме-латонина на развитие стресс-индуцированных поражений пародонта и печени у животных различных типологических групп. Показано антистрессорное действие мелатонина, проявляющее коррекцией стресс-индуцированных изменений пародонта и печени. Установлено его антиоксидантное действие, влияние на активность антиоксидантных ферментов, биохимический состав ткани десны. Показано, что применение мелатонина снижает выраженность морфологических изменений в печени и пародонте при стрессе.
Разработан метод коррекции стресс-индуцированных нарушений паро-донта и печени у экспериментальных животных с использованием мелатонина.
Показано, что длительное введение мелатонина снижает выраженность морфологических и функциональных нарушений в пародонте при стрессе. В работе установлено, что фармакологические эффекты мелатонина при стрессе зависят от индивидуальных особенностей организма и более выражены у особей, неустойчивых к стрессу. Эти данные необходимо учитывать при применении лекарственных препаратов – аналогов мелатонина.
Полученные в работе данные о роли мелатонина в предупреждении стресс-индуцированных нарушений в пародонте и печени и зависимости его эффекта от индивидуальных особенностей организма необходимо использовать при разработке профилактических мероприятий для работников, чья деятельность сопровождается развитием психо-эмоционального возбуждения.
Методология и методы диссертационного исследования
Работа посвящена исследованию фармакологических эффектов мелато-нина на развитие стресс-индуцированных изменений в пародонте и печени. Выбор органов для исследования обоснован тесной зависимостью состояния пародонта от функциональной активности печени, что подтверждается данными литературы. Методология исследования основана на использовании широкого спектра методов: гистологических, планиметрических, биохимических, для подтверждения развития поражений пародонта и печени при стрессе, а также изучения антистрессорных эффектов мелатонина. Для уточнения особенностей действия мелатонина лабораторные животные были разделены на типологические группы: стресс-устойчивые и стресс-неустойчивые, и проведено сравнительное исследование влияния мелатонина на крыс этих групп. Установлена зависимость его эффектов от использованной дозы.
Использованные статистические методы показали существенную взаимосвязь патологии печени и пародонта, а также позволили убедительно показать позитивное корригирующее влияние мелатонина на развитие стресс-индуцированных поражений печени и пародонта.
Положения, выносимые на защиту:
-
Применение мелатонина уменьшает выраженность стресс-инду-цированных морфологических и функциональных изменений пародонта.
-
Фармакологические эффекты мелатонина при стрессе зависят от типологических особенностей животных и носят дозо-зависимый характер.
-
Использование мелатонина предупреждает угнетение синтетической функции печени у животных при остром и хроническом стрессе.
-
Применение мелатонина корригирует нарушения прооксидантно-антиоксидантного баланса и стимулирует адаптационные процессы в системе антиоксидантных ферментов в пародонте при хроническом стрессе.
Степень достоверности полученных результатов
Научные положения и выводы, сделанные диссертантом, основаны на анализе достаточного объема экспериментальных исследований, адекватном выборе экспериментальных групп животных, применении современных и легко воспроизводимых морфологических, биохимических методов. В работе использовался сертифицированный мелатонин, что позволило получить достоверные
данные о его фармакологической активности в пародонте и печени. Для статистической обработки использовались современные методы сбора и обработки исходных количественных данных.
Апробация и публикация результатов
Основные положения диссертации представлены на VI и X Международных дистанционных научных конференциях «Инновации в медицине» (Курск, 2014, 2016), Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Современная стоматология – эффективность профилактики и лечения. Нанотехнологии в стоматологии» (Самара, 2014), III международной научно-практической конференции «Современная биология: актуальные вопросы» (Санкт-Петербург, 2014).
По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ в центральной и местной печати, в том числе 5 – в изданиях, рекомендуемых ВАК Министерства образования и науки Российской Федерации для публикации основных научных результатов диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук, и содержат полный объем информации, касающейся темы диссертации.
Соответствие работы паспорту специальности
Научные положения диссертации соответствуют паспорту специальности 14.03.06 – Фармакология, клиническая фармакология. Результаты проведенного исследования соответствуют пункту 3 «Исследование механизмов действия фармакологических веществ в экспериментах на животных, на изолированных органах и тканях, а также на культурах клеток», пункту 4 «Исследование взаимодействия между организмом и лекарственными средствами, изучение их фармакодинамики, фармакокинетики и метаболизма. Установление связей между дозами, концентрациями и эффективностью лекарственных средств. Экстраполяция фармакологических параметров с биологических моделей на человека».
Личный вклад в проведенное исследование
Автором под руководством научного руководителя составлен план и дизайн исследования, проведен анализ отечественных и зарубежных источников литературы по теме диссертации, выполнен весь комплекс научных экспериментальных исследований, включенных в диссертацию. Автором лично проведено изучение морфологических и биохимических изменений, развивающихся в пародонте и печени под действием стресса, установлены фармакологические эффекты мелатонина на стресс-индуцированные биохимические и морфологические изменения в печени и пародонте. Вклад автора является определяющим и заключается в непосредственном участии на всех этапах исследования: от постановки задач, их экспериментально-теоретической реализации до обсуждения результатов в научных публикациях, докладах и внедрения в практику.
Объем и структура работы
Диссертация изложена на 126 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 3 глав собственных исследований, заключения, выводов, практических реко-7
мендаций, списка использованной литературы. Библиографический указатель включает 208 литературных источников, в том числе 83 отечественных и 125 зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 12 таблицами и 20 рисунками.
Стресс-индуцированные изменения органов желудочно-кишечного тракта и способы их коррекции
В последние годы теория стресса, предложенная Г. Селье, получила дальнейшее развитие. Сформулировано представление о стрессе, как эмоциональной реакции организма, которая возникает тогда, когда субъект при наличии у него жизненно важной потребности не имеет возможности достичь социально или биологически значимого результата [74, 75]. При длительных затруднениях в достижении результата отрицательные эмоции суммируются, приобретают длительный характер и трансформируются в стресс [73, 74]. Морфо-функциональной основой такого длительного эмоционально-негативного состояния, в настоящее время, рассматривается циркуляция возбуждения по замкнутым кругам гипоталамо-лимбико-ретикулярных структур мозга [75]. Длительное существование такой циркуляции вызывает развитие комплекса сомато-вегетативных нарушений, которые проявляются, в первую очередь, в генетически-детерминированных наиболее слабых местах саморегуляции функциональных систем организма [74]. Был показан индивидуальный характер реагирования индивидуумов на действие аналогичных стрессорных ситуаций [75]. Подтверждено существование, так называемых стресс-устойчивых и стресс-предрасположенных животных [59]. Общепризнано, что одним из факторов, обеспечивающих различную устойчивость животных и людей к стрессу, являются особенности содержания регуляторных пептидов как в мозге, так и в других органах и тканях [75].
В последние годы открыты молекулярные механизмы развития стресса [46]. К ним относятся: появление стресс-белков или белков теплового шока [107], нарушения микроциркуляции, развитие гипоксии тканей, активация процессов свободнорадикального окисления в органах и тканях [19, 69], снижение активности Na,K-АТФазы и гиперпродукция NO, увеличение внутриклеточной концентрации кальция [46, 47].
Особую роль в реализации повреждающих механизмов стресса играет усиление перекисного окисления липидов, связанное с избыточным образованием активных форм кислорода. В настоящее время сформулировано понятие окислительного стресса [29]. Это состояние сопровождается формированием избытка Са2+ в цитоплазме клеток, что дает толчок к запуску каскада ферментативных реакций, связанных с активацией фосфолипаз, липаз и протеаз. Развитие окислительного стресса проявляется повреждением ферментов, клеточных рецепторов, ионных каналов, поражением наружной клеточной и внутриклеточных мембран [29]. С этим связана деструкция митохондрий, а, следовательно, нарушение энергетического обмена в клетках.
Практически все органы и ткани организма человека являются мишенью стресс-индуцированных повреждений, в том числе, и органы желудочно-кишечного тракта. В первую очередь нарушаются все виды обмена. Так, моделирование стресса у крыс подвешиванием на 22 часа за шейную складку сопровождалось снижением интенсивности анаэробного гликолиза, угнетением пентозного цикла, торможением глюконеогенеза и активацией липолиза [20]. При травмах, связанных в кровопотерей и шоком, в крови отмечается падение общего уровня белка. Причем, чем тяжелее кровопотеря и шок, тем более выражено снижение белка [33]. При травматическом стрессе наблюдается изменение продукции профакторов свертывания в печени. Так, концентрация фибриногена в плазме у больных с травмой мозга снижалась на протяжении 2 недель [23]. Моделирование геморрагического шока у кошек вызывало фазовые изменения фосфолипидного состава плазматических мембран гепатоцитов [43].
Одновременно протекали процессы как деградации, так и восстановлении мембранных структур гепатоцитов. В начальном периоде развития геморрагического шока отмечается уменьшение концентрации фосфатидилинозитола и фосфатидилхолина, а содержание фосфатидилэтаноламина увеличивалось. Такие изменения приводят, с одной стороны, к нарушению реализации биологической активности гормонов, участвующих в механизмах адаптации [56], а с другой – усилению активности кальциевого насоса в клетках [29].
Стресс нарушает активность ферментативного аппарата печени. Так, при моделировании иммобилизационного стресса у взрослых и старых крыс установлено, что снижение функциональной активности редуктаз микросом в обеих группах экспериментальных животных [63], что способствует ограничению скорости реакций гидроксилирования при стрессе. У взрослых крыс такое уменьшение было более выражено, что связано с исходно низкой активностью ферментов у старых животных. Кроме того, показано значительное снижение чувствительности указанных редуктаз к стимулирующим и ингибирующим влияниям у животных, подвергшихся иммобилизационному стрессу [64]. Проведено сравнение содержания пиридиновых коферментов в печени взрослых и старых крыс при иммобилизационном стрессе [65]. Установлено, что у взрослых животных наблюдается увеличение окисленного НАД и НАДФ, а концентрация восстановленного НАДФ снижалась, хотя уровень восстановленного НАД оставался без изменений. Возможно, такие изменения объясняются использованием коферментов в процессах микросомального окисления и реакциях восстановления глютатиона, что отмечается при стрессе. Многочисленные экспериментальные и клинические исследования подтверждают факт развития патологических изменений в ткани пародонта при стрессе. Ранее показано, что при моделировании острого стресса отмечается угнетение остеогенеза и усиление резорбции костной ткани [76]. Установлены особенности реакции на стресс ткани пародонта у животных с разными типологическими особенностями. Показано, что хронический стресс вызывает повышение в 1,7 раза содержания оксипролина в органическом матриксе нижнечелюстной кости у стресс-неустойчивых крыс [51]. При этом у животных стресс-устойчивого типа этот показатель не отличался от аналогичного у контрольных животных. Известно, что концентрация свободного оксипролина характеризует интенсивность резорбции костной ткани. Аналогичные данные установлены и по содержанию хондроитинсульфатов в нижнечелюстной кости: у стресс-неустойчивых крыс этот показатель увеличен по сравнению с контрольной группой, а у стресс-устойчивых особей – достоверно не отличался. Известно, что хондроитинсульфаты - это главный тип гликозаминогликанов, входящих в состав протеогликанов костной ткани. На основании изложенных результатов авторы делают вывод о том, что при хроническом стрессе отмечается угнетение созревания костной ткани пародонта, усиление распада коллагена и протеогликанову животных стресс-неустойчивого типа (51).
Моделирование однократного или многократного холодового воздействия у мышей двух линий Balb/c и C57BI/6, отличающихся по устойчивости к стрессу, позволило установить, что и однократное, и многократное помещение животного в камеру на 3 минуты при температуре минус 20 градусов приводило к увеличению числа зубов с рецессией десны и возрастанию величины рецессии у стресс-неустойчивых особей линии Balb/c. У стресс-устойчивых мышей C57BI/6 незначительная рецессия отмечалась только после однократного холодового воздействия, а при многократном, напротив, выявлено уменьшение числа зубов с рецессией и снижение величины самой рецессии [41]. Назначение мексидола стрессированным мышам приводило к уменьшению числа зубов с рецессией десны и величины рецессии у стресс-неустойчивых животных [41].
Экспериментальная модель острого иммобилизационного стресса и хронического стресса ограничения подвижности
О состоянии прооксидантно-антиоксидантного баланса судили по содержанию в плазме крови в гомогенате ткани печени, в гомогенате ткани десны продуктов ПОЛ: АГП и МДА, а также активности ферментов антиоксидантной системы: СОД и каталазы, которые оценивали традиционными методами [45, 50, 82]. Навеску ткани печени или десны массой 100 мг гомогенизировали в 1 мл 0,025 М трис-НСl буфера (pH 7,4). Уровень АГП определяли следующим методом. К 0,2 мл гомогената или плазмы добавляли 6 мл смеси гептана и изопропанола, а затем 1 мл соляной кислоты и интенсивно встряхивали. После расслоения фаз отбирали гептановый слой, в котором спектрофотометрически измеряли содержание АГП при длине волны 233 нм против контрольной пробы и выражали в условных единицах. Для определения МДА к 0,02 мл исследуемой пробы добавляли 0,5 мл смеси тиобарбитуровой кислоты и уксусной кислоты в соотношении 1:1, а затем инкубировали 60 минут при 100оС, измеряли оптическую плотность при 532 нм и рассчитывали количество малонового диальдегида в мкмоль/г белка ткани или в мкмоль/мл плазмы. Активность СОД определяли спектрофотометрическим методом, основанным на определении степени торможения реакции восстановления нитросинего тетразолия. Для этого 0,02 мл экстракта гомогената или плазмы вводили в 3 мл инкубационной среды, содержащей 0,41 мМ нитросинего тетразолия, 0,33 мМ ЭДТА, 0,01 мМ N метилфеназония метилсульфата. Измеряли оптическую плотность на спектрофотометре при длине волны 540 нм, затем добавляли в кювету 0,1 мл 0,8 мМ НАД-Н, перемешивали и оставляли в темноте на 10 мин, после чего повторно измеряли оптическую плотность. О реакции судили по разнице между первым и вторым показаниями спектрофотометра. За условную единицу активности СОД принимали 50 % торможение реакции восстановления нитросинего тетразолия.
Активность каталазы определяли методом, основанным на способности перекиси водорода образовывать с солями молибдена стойкий окрашенный комплекс, для чего к 0,1 мл гомогената добавляли 2,0 мл 0,03% раствора перекиси водорода. После 10-минутной инкубации при 37оС останавливали реакцию добавлением 1,0 мл 4% раствора молибдата аммония. Интенсивность окраски измеряли фотометрически при 410 нм. Активность каталазы рассчитывали по формуле А (мкат/л) = ЕХОЛ-ЕОП-3,1 выражали в мкат/г ткани или мкат/мл плазмы. Концентрацию холестерина в плазме крови определяли ферментативным колориметрическим методом, когда холестерин, содержащийся в пробе окисляется под влиянием холестеролоксидазы [42]. Добавление пероксидазы и образование перекиси водорода дает красное окрашивание при реакции с фенолом и 4-аминофеназоном. Интенсивность окраски пропорциональна концентрации холестерина и может быть измерена фотометрически.
Содержание ЛПОНП, ЛПНП и ЛПВП определяли ферментативными колориметрическими тестами, когда на первом этапе из пробы удаляли все ЛП за исключением тех, чья концентрация измеряется [42]. В дальнейшем сложные эфиры холестерина окисляли под влиянием холестеролэстеразы и холестеролоксидазы, и получаемый продукт при добавлении перекиси водорода под влиянием пероксидазы изменяет окраску хинониминового красителя. Интенсивность окраски пропорциональна концентрации соответствующих сложных эфиров холестерина и может быть измерена фотометрически.
Концентрацию ТГ определяли с помощью ферментативного теста (РАР-метод). ТГ разрушали липопротеиновой липазой до глицерина с последующим окислением до дигидроксиацетонфосфата и перекиси водорода [42]. Полученная перекись водорода вступает в реакцию с 4-аминофеназоном и 4-хлорфеноном и дает красное окрашивание.
Содержание НЭЖК в плазме крови определяли методом, основанным на способности комплексных соединений НЭЖК с медью взаимодействовать с дефенилкарбозидом и давать розово-малиновую окраску [42]. Для этого к раствору кремниевой кислоты и смеси хлороформ-гептан добавляют исследуемую сыворотку. После инкубации и добавления медного реактива вносят дефенилкарбозид и определяют интенсивность образовавшейся ркраски, которая пропорциональна содержанию НЭЖК.
Содержание АЛТ определяли кинетическим методом, основанным на фотометрическом измерении скорости уменьшения концентрации НАДН [42]. Эта скорость прямо пропорциональна скорости образования пирувата при взаимодействии 2-оксоглутарата и L-аланина, а, соответственно, и активности АЛТ.
Содержание АСТ определяли с помощью УФ-метода, в основе которого лежит реакция взаимодействия L-аспартата и 2-оксаглутарата под влиянием АСТ [42]. Образующийся оксалоацетат взаимодействует с НАДН под влиянием фермента малатдегидрогеназы. Скорость уменьшения концентрации НАДН, измеряемая фотометрически) прямо пропорциональна скорости формирования оксалацетата и, соответственно, активности АСТ.
2.6. Определение биохимических показателей, характеризующих функциональную активность пародонта и состояние прооксидантно-антиоксидантного баланса
После эвтаназии у животных забирали ткани для исследования. Предварительно отделенную ткань десны на половине верхней и нижней челюстей массой 100 мг гомогенизировали в 1 мл 0,025 М трис-НСl буфера (pH 7,4). Состояние соединительно-тканного матрикса (СТМ) оценивали по уровню свободного и связанного оксипролина (ОП) и гликозаминогликанов (ГАГ) в ткани десны [80, 81].
Содержание свободного и связанного ОП определяли модифированным методом, основанным на окислении ОП хлорамином Б и конденсации продуктов его окисления парадиметиламинобензальдегидом. В центрифужную пробирку наливали по 0,3 мл гомогената тканей пародонта, 0,5 мл хлорной кислоты и 0,5 мл трихлоруксусной кислоты. Содержимое перемешивали, нагревали на водяной бане, затем охлаждали до 20 С и центрифугировали 5 минут при 3000 об/мин. К пробам добавляли по 1 капле раствора фенолфталеина и нейтрализовывали раствором едкого натра, добиваясь появления устойчивой слабопурпурной окраски. Затем добавляли раствор хлорамина, через 4 минуты раствор хлорной кислоты и реактив, содержащий раствор парадиметиламинобензальдегида в этаноле. Смесь нагревали на водяной бане, охлаждали до 20 С, добавляли 4 мл реактива, содержащего смесь четыреххлористого углерода и бутанола в соотношении 1:3. Пробы встряхивали, центрифугировали 10 минут при 3000 об/мин супернатант фотометрировали при длине волны 560 мл. Содержание ОП выражали в ммоль/г ткани.
Содержание ГАГ определяли модификацией метода количественного анализа с использованием трихлоруксусной кислоты и известной карбонильной реакции. В центрифужную пробирку наливали 0,5 мл гомогената тканей пародонта и 2 мл охлажденного реактива, содержащего этанол, уксуснокислый калий и уксусную кислоту. Пробу перемешивали и через 5 минут центрифугировали при 3000 об/мин 15 минут. Осадок эмульгировали в 3 мл трихлоуксусной кислоты и полученную смесь гидролизовали в кипящей водяной бане 30 мин. Затем пробу охлаждали до 20 С и центрифугировали при 3000 об/мин 10 минут. К 1 мл надосадочной жидкости добавляли 5 мл реактива, содержащего концентрированную серную кислоту и кристаллический тетраборнокислый натрий. Пробы нагревали на кипящей водяной бане 10 минут и затем охлаждали до 20 С. К 0,1 мл пробы добавляли реактив, содержащий раствор карбазола и этанол. Содержимое перемешивали, нагревали на кипящей водяной бане. Появлялось фиолетово-розовое окрашивание. Через 10 минут пробы фотометрировали при длине волны 330 нм. Содержание ГАГ выражали в мг/г ткани.
Определение биохимических показателей, характеризующих функциональную активность пародонта и состояние прооксидантно-антиоксидантного баланса
Печень является ключевым участником различных видов обмена веществ. Исследование биохимических показателей позволяет судить об уровне функциональной метаболической активности печени, развитии стресс индуцированных повреждений в органе. Таким образом, изучение фармакологических эффектов мелатонина на изменение биохимических показателей в плазме крови и ткани печени позволяет выяснить роль этого соединения не только в коррекции стресс-индуцированных нарушений ткани органа, но и в регуляции метаболической активности печени.
Моделирование острого шестичасового иммобилизационного стресса крысам Вистар вызывает резкое повышение содержания АЛТ и АСТ в плазме крови (Рисунок 4, 5, Таблица 5). Так, через 39 часов после воздействия наблюдается увеличение концентрации АЛТ в 2,5 раза (p 0,001), а АСТ в 3,0 раза (p 0,001) по сравнению с интактными животными. Установлено снижение содержания общего белка в плазме на 5,3% (p 0,05) (Рисунок 6). Не отмечено статистически достоверных изменений концентраций альбумина и глюкозы у животных, перенесших стресс (p 0,05).
На четвертые сутки после моделирования острого шестичасового иммобилизационного стресса у крыс контрольной группы отмечается резкое снижение содержания АЛТ и АСТ в плазме крови, указанные показатели не отличаются достоверно от аналогичных у интактных крыс (p 0,05). В этот период установлено снижение концентрации альбумина на 3,5% (p 0,05) по сравнению с интактными животными (Рисунок 7). Показатели содержания общего белка и глюкозы в плазме не отличаются от аналогичных у интактных крыс (p 0,05).
Аналогичная картина наблюдается у контрольных животных и на 7 сутки после моделирования стресса. Концентрация альбумина по-прежнему снижена по сравнению с интактными животными (на 3,7%, p 0,05), а остальные исследованные показатели (АЛТ, АСТ, концентрация общего белка и концентрация глюкозы) не отличаются от показателей у интактных крыс (p 0,05).
Примечание: - p 0,05 по сравнению с контрольной группой; х - p 0,05 по сравнению с интактной группой; ххх - p 0,001 по сравнению с интактной группой. Рисунок 6 – Влияние мелатонина на содержание общего белка в плазме крови у животных, перенесших острый иммобилизационный стресс.
Влияние мелатонина на концентрацию альбумина в плазме крови у животных, перенесших острый иммобилизационный стресс. Применение мелатонина в дозе 1,0 мг/кг приводит к снижению концентрации АЛТ на 20,0% (p 0,05) и АСТ – на 22,2% (p 0,05) по сравнению с контрольной группой. Не установлено различий показателей концентраций альбумина, общего белка, глюкозы в плазме крови между сравниваемыми группами (p 0,05).
На четвертые и седьмые сутки после стрессорного воздействия значения всех изучаемых показателей не отличались статистически достоверно от аналогичных у контрольных животных (p 0,05).
Введение изучаемого гормона в дозе 0,2 мг/кг не оказывало существенного влияния на изменения всех изучаемых показателей через 39, 4 и 7 суток часов после моделирования острого шестичасового иммобилизационного стресса (p 0,05).
Моделирование хронического стресса ограничения подвижности в течение 12 суток вызывало повышение содержания в плазме крови АЛТ и АСТ в 2,6 и 3,6 раза соответственно (p 0,001) (Рисунок 8, 9, Таблица 6). Отмечается статистически достоверное снижение концентрации альбуминов в плазме на 8,1% (p 0,01) (Рисунок 10). Содержание общего белка и глюкозы в плазме крови крыс, перенесших 12-суточный хронический стресс, существенно не менялось (p 0,05).
Применение мелатонина в дозе 1,0 мг/кг у животных, подвергнутых хроническому стрессу, приводило к статистически достоверному снижению концентрации АЛТ и АСТ в плазме крови (на 21,4% (p 0,01) и 32,2% (p 0,001) соответственно). Содержание альбуминов было существенно выше, чем в контрольной группе (на 7,3%, p 0,05) и не отличалось достоверно от аналогичного показателя у интактных крыс (p 0,05). Концентрация глюкозы и содержание общего белка в плазме крови существенно не отличались в сравниваемых группах (p 0,05).
Фармакологические эффекты мелатонина на синтетическую функцию печени и состояние прооксидантно-антиоксидантного баланса у животных, перенесших острый или хронический стресс
В работе установлено, что применение мелатонина в дозе 1,0 мг/кг оказывает более выраженное влияние на снижение содержания продуктов ПОЛ и повышение активности антиоксидантных ферментов по сравнению с его использованием в дозе 0,2 мг/кг при многократно повторяющихся стрессорных воздействиях.
Подобное действие гормона объясняют его способностью связывать свободные радикалы [88], стимулирующим влиянием на антиоксидантные ферменты [157, 191], потенцированием эффектов других антиоксидантов организма [138]. В нашем исследовании подтверждено стимулирующее влияние гормона на СОД и каталазу при многократно повторяющихся стрессорных воздействиях, которые сопровождаются резким угнетением активности антиоксидантных систем [32].
При стрессе мелатонин выступает не только как антиоксидант, но и проявляет присущие ему стресс-лимитирующие свойства [4]. Показано, что он способен предупреждать избыточную секрецию кортикотропин-рилизинг гормона при действии чрезвычайных факторов [207], а также нарушения микроциркуляции [49], оказывает анальгетическое действие [92], то есть ограничивает патогенетические механизмы, которые и вызывают усиление ПОЛ при стрессе. Поэтому эффекты мелатонина на состояние прооксидантно-антиоксидантного баланса связаны не только с прямым действием на свободные радикалы и антиоксидантные ферменты, но и опосредованным влиянием на факторы, обуславливающие стресс-индуцированную активацию ПОЛ. При изучении влияния гормона на изменения в печени при остром иммобилизационном стрессе установлено, что адаптационные процессы, развивающиеся под влиянием мелатонина в паренхиме печени крыс, перенесших стресс, имеют свои особенности в сравнении животными после хронического стресса. Так, стимуляция репаративных процессов под действием мелатонина была более выражена у стресс-устойчивых крыс. В обеих группах был установлен гепатопротекторный эффект мелатонина, который увеличивал количество нормальных гепатоцитов по сравнению с контрольной группой. Аналогично экспериментам с хроническим стрессом в сериях с острым установлено антиоксидантное действие гормона, его способность положительно влиять на продукцию липопротеидов и белка гепатоцитами.
В работе показано, что под влиянием хронического стресса нарушаются морфо-функциональные свойства пародонта. Установлено, что моделирование 12-дневного стресса ограничения подвижности приводит к визуальным и выявленным при микроскопии изменениям всех тканей пародонта: расширению сосудов, гиперемии и отеку слизистой, изменению толщины и дистрофии разных слоев эпителия, моно- и полинуклеарной инфильтрация различных тканей пародонта и истончению костных трабекул.
Моделирование хронического стресса ограничения подвижности у стресс неустойчивых крыс приводило к снижению компонентов СТМ в ткани десны: коллагена и ГАГ. Ранее показано, что повышение подвижности зубов приводит к снижению концентрации ГАГ в пародонте [196]. То есть хронический стресс нарушает опорную функцию пародонта. Авторы связывают такие изменения с нарушениями микроциркуляции и гипоксией. Показано значительное изменение прооксидантно-антиоксидантного баланса под влиянием стресса. При этом у стресс-устойчивых крыс наблюдалась только активация ПОЛ. Под влиянием шестичасового иммобилизационного стресса у стресс-устойчивых животных наблюдаются минимальные изменения морфо-функциональных свойств пародонта и незначительная активация ПОЛ, что сопровождается накоплением в слизистой пародонта только промежуточных продуктов – АГП. Это указывает на высокий уровень адаптационных возможностей пародонта у животных этой типологической группы.
У стресс-неустойчивых крыс изменения, развивающиеся в пародонте при остром иммобилизационном стрессе, более выражены. Эти данные указывают на низкие адаптивные возможности пародонта стресс-неустойчивых животных по сравнению со стресс-устойчивыми.
Можно констатировать, что выраженность активации ПОЛ при остром или хроническом стрессе в ткани печени выше, чем в пародонте. По нашему мнению, это объясняется особенностями строения этих тканей. Печень – паренхиматозный орган с обильным кровоснабжением. Расстройства кровотока, возникающая вследствие этого гипоксия стимулируют свободнорадикальное окисление и образование активных форм кислорода. Развивается типичный оксидативный стресс, который приводит к повреждению фосфолипидов клеточных мембран, нарушению активности мембрано-связанных ферментов и запускает ПОЛ [17, 31, 131]. В пародонте количество рыхлых тканей минимально (отдельные слои слизистой), кровоток существенно ниже. Поэтому его расстройство при стрессе не вызывает выраженной гипоксии и активации свободнорадикального окисления. Учитывая тот факт, что ткани, составляющие пародонт, имеют выраженные волокнистые структуры в своем составе, количество субстрата для усиления ПОЛ минимально. Т.е. устойчивость пародонта к свободнорадикальному окислению объясняется, по нашему мнению, как отсутствием условий для существенной активации образования активных форм кислорода, так и низким содержанием субстрата для ПОЛ. Поэтому активное включение ПОЛ в развитие изменений в пародонте, приводящее к срыву адаптационных механизмов возможно при длительном действии чрезвычайного раздражителя, что имеет место при хроническом стрессе.