Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы
1.1 Принципы коррекции ишемических - реперфузионных повреждений головного мозга. Основные лекарственные препараты для коррекции данных повреждений 12
1.2 Ишемическое прекондиционирование как новая стратегия при ишемическом поражении головного мозга 22
1.3 Тадалафил - ингибитор фосфодиэстеразы - 5 как агент фармакологического прекондиционирования 25
1.4 Рекомбинантный эритропоэтин («Эпокрин»): физиологическая роль и нейропротекторные свойства 29
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования
2.1 Материалы исследования 35
2.1.1 Соответствие работы правилам и рекомендациям к проведению экспериментальных исследований 35
2.1.2 Перечень используемых реактивов и веществ 35
2.1.3 Список использованного программного обеспечения 37
2.1.4 Экспериментальные животные 37
2.2 Методы исследования 38
2.2.1 Методы изучения нейропротекторных свойств in vivo 38
2.2.2 Оценка адекватности окклюзии артерий, кровоснабжающих головной мозг 40
2.2.3 Методы оценки неврологического дефицита у крыс 41
2.2.4 Определение маркеров повреждения головного мозга S100b и NSE 44
2.2.5 Морфометрические методы исследования 45
2.2.6 Методы статистической обработки 46
2.3 Протокол и дизайн исследования. Обоснование доз 46
ГЛАВА 3. Результаты собственных исследований
3.1 Морфофункциональные нарушения, возникающие при воспроизведении моделей двухсосудистой и четырехсосудистой ИГМ 54
3.1.1 Выбор экспериментальной модели исследования 54
3.1.2 Экспериментальный подбор продолжительности ишемического эпизода 57
3.1.3 Электрохемилюминесцентный иммуноанализ плазмы животных на наличие маркеров повреждения головного мозга 61
3.1.4 Морфометрические характеристики срезов головного мозга крыс 63
3.2 Оценка прекондиционирующего и церебропротективного действия тадалафила 70
3.2.1 Оценка поведенческого статуса и неврологического дефицита групп с ИГМ и тадалафилом 70
3.2.2 Оценка уровня биохимических маркеров повреждения головного мозга в данных экспериментальных группах 73
3.2.3 Морфометрические характеристики срезов головного мозга крыс 74
3.3 Оценка церебропротективного действия рекомбинантного эритропоэтина «Эпокрин» 77
3.3.1 Оценка поведенческого статуса и неврологического дефицита групп с ИГМ и коррекцией «Эпокрином» 77
3.3.2 Оценка уровня биохимических маркеров повреждения головного мозга в данных экспериментальных группах 79
3.3.3 Морфометрические характеристики срезов головного мозга крыс 80
3.4 Оценка церебропротективных свойств нейропротектора «Глиатилин» 84
3.4.1 Оценка поведенческого статуса и неврологического дефицита групп с ИГМ и введением «Глиатилина» в профилактических и лечебных целях 84
3.4.2 Оценка уровня биохимических маркеров повреждения головного мозга в экспериментальных группах с введением «Глиатилина» 86
3.4.3 Морфометрические характеристики срезов головного мозга крыс 88
3.5 Оценка церебропротективного действия комбинации тадалафила и «Глиатилина» 93
3.5.1 Оценка поведенческого статуса и неврологического дефицита группы крыс при коррекции тадалафилом и «Глиатилином» 93
3.5.2 Оценка уровня биохимических маркеров повреждения головного мозга в данных экспериментальных группах 96
3.5.3 Морфометрические характеристики срезов головного мозга крыс 97
3.6 Оценка К+АТФ-азных каналов в реализации церебропротекторных
эффектов фармакологического прекондиционирования тадалафилом и Эпокрином» 100
3.6.1 Оценка поведенческого статуса и неврологического дефицита групп с фармакологическим прекондиционированием тадалафилом, рекомбинантным эритропоэтином при предварительном введении глибенкламида 100
3.6.2 Оценка уровня биохимических маркеров повреждения головного мозга в данных экспериментальных группах 102
3.6.3 Морфометрические характеристики срезов головного мозга крыс. 104
ГЛАВА 4. Обсуждение результатов 109
Глава 5. Заключение 114
Выводы 119
Перечень сокращений и условных обозначений 122
Список литературы
- Тадалафил - ингибитор фосфодиэстеразы - 5 как агент фармакологического прекондиционирования
- Перечень используемых реактивов и веществ
- Экспериментальный подбор продолжительности ишемического эпизода
- Оценка поведенческого статуса и неврологического дефицита групп с фармакологическим прекондиционированием тадалафилом, рекомбинантным эритропоэтином при предварительном введении глибенкламида
Введение к работе
Актуальность темы исследования
Ишемический инсульт или инфаркт мозга является основной патологией
среди тяжелых форм сосудистых поражений мозга (Мирзоян Р.С., 2012;
Воронина Т.А., 2012). В России данная патология занимает первое место, как
причина потери трудоспособности, а в структуре общей смертности стоит на
втором месте (Суслина З.А., 2015). Проблема своевременной патогенетической
терапии данной патологии является важнейшей из-за широкой
распространенности, высокой летальности, инвалидизации и социальной
дезадаптации перенесших ее пациентов (Спасов А.А., 2014). На сегодняшний
день выделяют два подхода для решения этой проблемы: применение
медикаментозных (фармакологических) препаратов и немедикаментозных
методов, которые воздействуют на мобилизацию внутренних генетически-
детерминированных протекторных механизмов, эволюционно приобретенных.
С помощью терапии достигается восстановление кровотока в
ишемизированной области. К таким методам терапии относят:
тромболитическую, антикоагулянтную и антиагрегантную терапию, а также гемоделюцию (с использованием низкомолекулярных декстранов). На сегодняшний день есть потребность в поиске и разработке новых эффективных церебропротекторов, которые могли бы улучшить течение заболевания, предупредить развитие нейродегенеративных процессов мозга, более продуктивно оказать экстренную помощь, понизить летальность, уменьшить продолжительность острого периода, снизить инвалидизирующие последствия заболевания. Одним из более эффективных немедикаментозных методов является фармакологическое прекондиционирование (Momosaki S., 2016; Yamamoto M., 1988). Фармакологическая нейропротекция является одним из направлений лечения для сокращения повреждения при ишемическом инсульте, а также других модификациях ишемии мозга. Поэтому разработка и внедрение новых фармакологических агентов, которые способны снизить степень ишемических-реперфузионных повреждений головного мозга, остается одной из основных задач современной медицины. Наиболее перспективным для изучения, с нашей точки зрения, является ингибитор фосфодиэстеразы-5.
Степень разработанности темы
В настоящее время в нейрореаниматологии постоянно требуется
внедрение новейших методов раннего выявления и предупреждения вторичных
повреждающих факторов, в том числе и при ОНМК. В последних
рекомендациях American Heart Association / American Stroke Association и НИИ
цереброваскулярной патологии и инсульта не предложено методов
прогнозирования течения ИИ. Согласно ведущим международным
клиническим рекомендациям по лечению и профилактике последствий ОНМК и данным, полученным большинством больших рандомизированных исследований по изучению эффективности церебропротективных препаратов, на сегодня отсутствует нейропротективная схема назначения лекарственных препаратов, показавших достоверное улучшение исхода инсульта. Сейчас
известен большой ряд механизмов, являющихся базисом
прекондиционирования: открыты пусковые агенты, вещества - посредники, ряд
окончательных мишеней (Momosaki S, 2016; Yamamoto M, 1988; Власов Т.Д,
1998). Одной из многих ветвей исследования средств, обладающих
фармакологическим прекондиционированием, является воздействие на путь NO
– цГМФ - протеинкиназа G (ПК - G) (Должикова И.Н., 2013). Недавно
появилась новая потенциальная терапевтическая стратегия для ингибитора
фосфодиэстеразы типа 5, что он оказывает протективное воздействие на мозг
при нейрогенных, нейродегенеративных заболеваниях и потере памяти (Guo L.,
2015; Gulati P., 2014; Zhang R.L., 2012). В настоящее время нет препаратов на
основе иФДЭ - 5 разрешенных для клинического применения при ОНМК,
поэтому представляется целесообразным изучить наличие
церебропротективных свойств иФДЭ - 5 и их эффективность.
Цель исследования: повышение эффективности фармакологической
церебропротекции с использованием фармакологического
прекондиционирования ингибитором ФДЭ-5 (тадалафил) в сравнении с
рекомбинантным эритропоэтином («Эпокрин») и нейропротектором
«Глиатилин».
Задачи:
-
Провести количественную оценку нарушений при ишемических-реперфузионных повреждениях головного мозга с исследованием неврологического статуса, поведенческих реакций, значений биохимических маркеров ишемического повреждения головного мозга и морфометрических критериев.
-
Исследовать церобропротективные эффекты ингибитора ФДЭ-5, тадалафила при моделировании ишемических-реперфузионных повреждений головного мозга у крыс.
-
Изучить в сравнительном аспекте церобропротективные эффекты рекомбинантного эритропоэтина «Эпокрин» при моделировании ишемических-реперфузионных повреждений головного мозга у крыс.
4. Исследовать церобропротективные эффекты нейропротектора
«Глиатилина» при моделировании ишемических-реперфузионных повреждений
головного мозга у крыс.
5. Изучить аддитивное действие сочетанного использования ингибитора
ФДЭ-5, тадалафила и нейропротектора «Глиатилина» при моделировании
ишемических-реперфузионных повреждений головного мозга у крыс.
6. Исследовать вклад К+АТФ-азных каналов в реализацию
церебропротекторных эффектов фармакологического прекондиционирования
тадалафилом.
Научная новизна исследования
Впервые были изучены свойства ингибитора ФДЭ-5, тадалафила как церебропротектора при моделировании тотальной ишемии головного мозга у крыс. Впервые доказано, что ингибитор фосфодиэстеразы-5 обладает церебропротективным свойством в дозе 1 мг/кг. Наличие церебропротективных свойств тадалафила в дозе 1 мг/кг подтверждается достоверным снижением
тяжести неврологического дефицита, увеличением активности животных в поведенческих тестах, снижением маркеров повреждения головного мозга S100b и NSE, увеличением количества двуядрышковых и гипохромных нейронов на гистологических срезах при морфометрии. Количественные значения церебропротективных эффектов тадалафила сопоставимы с эффектами рекомбинантного эритропоэтина «Эпокрин» в дозе 50 МЕ/кг.
Блокада АТФ-зависимых калиевых каналов глибенкламидом в дозе 5 мг/кг блокировала развитие церебропротективных эффектов тадалафила, что свидетельствует об участии АТФ-зависимых калиевых каналов в реализации церебропротекции за счет механизма прекондиционирования.
Теоретическая и практическая значимость
Результаты проведенного исследования включены в материалы лекций и практических занятий для студентов и аспирантов на кафедре фармакологии НИУ «БелГУ», КГМУ, ВГМУ им. Н.Н. Бурденко.
В работе экспериментально обоснована эффективность применения
ишемического и фармакологического прекондиционирования для
профилактики и коррекции ишемических повреждений мозга, а также
возможность инициации процесса прекондиционирования ингибитором ФДЭ-5,
тадалафилом. Полученные данные позволяют рекомендовать
целенаправленные клинические испытания фармакологического
прекондиционирования ингибитором ФДЭ-5 для профилактики и коррекции ишемических повреждений при сочетанной патологии сосудов головного мозга и эректильной дисфункции.
Методология и методы диссертационного исследования
В экспериментальном исследовании использован комплексный подход к
изучению нейропротекторного влияния фармакологического
прекондиционирования на животных с ишемическими-реперфузионными повреждениями головного мозга на четырехсосудистой тотальной ишемии головного мозга. Эксперимент был выполнен согласно методическим рекомендациям по доклиническому изучению лекарственных средств (Воронина Т.А., 2012; Миронов А.Н, 2012). Исследование проводили на половозрелых самцах линии Wistar. Экспериментальное исследование было проведено с использованием современных высокоинформативных методов, которые используются на кафедре фармакологии медицинского института и в Центре доклинических и клинических исследований НИУ «БелГУ». Исходя из поставленной цели и задач исследования, были использованы современные методы in vitro и in vivo, позволяющие с высокой степенью достоверности выявить эффекты экспериментальных веществ.
Положения, выносимые на защиту:
1. Адекватной моделью является «четырехсосудистая» 4-минутная тотальная ишемия с последующей реперфузией под контролем ЭЭГ и ЛДФ-метрии сетчатки, с количественной оценкой неврологического статуса, поведенческих реакций, значений нейронспецифической енолазы и белка S100b в сыворотке крови и морфометрии гистологических препаратов головного мозга крыс.
-
Фармакологическое прекондиционирование ингибитором ФДЭ-5 тадалафилом (1 мг/кг) и рекомбинантным эритропоэтином («Эпокрин», 50 МЕ/кг) превосходит эффективность нейропротектора «Глиатилин» (85,7 мг/кг) по совокупности функциональных, биохимических и морфологических критериев церебропротекции при ишемии-реперфузии.
-
Сочетанное использование фармакологического прекондиционирования тадалафилом (1 мг/кг) и нейропротекции «Глиатилином» (85,7 мг/кг) проявляет адитивнвное церебропротекторное действие.
-
Блокада К+АТФ-азных каналов глибекламидом (5 мг/кг) снимает эффекты фармакологического перкондиционирования и не влияет на нейропротекцию, опосредованную «Глиатилином».
Степень достоверности и апробация результатов
Высокая степень достоверности полученных результатов подтверждается значительным объемом экспериментальных исследований с использованием современных методов и методических подходов, высокотехнологичного оборудования в соответствии с рекомендациями по доклиническому изучению лекарственных средств с противоишемическим действием (Angermaier A., 2011) и адекватных, общепринятых методов, критериев статистической обработки данных.
Материалы диссертации докладывались и обсуждались: на пятой конференции Rus-LASA, 23–25 сентября 2015 г. в г. Белгород; Х конгрессе «Рациональная фармакотерапия», октябрь 2015 г. в г. Санкт- Петербург; Второй международной научно-практической конференции «Экспериментальные и клинические аспекты микроциркуляции и функции эндотелия», 16–17 ноября 2016 г. в г. Смоленск. Апробация диссертации проведена на научно-практической конференции кафедр фармакологии и анатомии человека, гистологии, Центра доклинических и клинических исследований НИУ «БелГУ».
Публикации
По теме диссертации опубликовано 10 работ, в том числе 3 статьи в рецензируемых изданиях, рекомендуемых ВАК РФ, 1 статья в издании, входящем в базы данных Scopus, 1 ноу-хау, подана 1 заявка на патент РФ.
Личный вклад автора
Личный вклад автора состоит в непосредственном участии во всех этапах диссертационного исследования, в наборе экспериментального материала, углубленном анализе отечественной и зарубежной научной литературы по теме диссертационного исследования, анализе и интерпретации лабораторных и инструментальных данных, их систематизации, статистической обработке с последующим описанием полученных результатов, написании и оформлении рукописи диссертации, основных публикаций по выполненной работе.
Объем и структура работы
Диссертационная работа представлена на 147 страницах машинописного
текста, состоит из 3 глав собственных исследований, обсуждения результатов,
выводов, научно-практических рекомендаций и списка литературы,
включающего 192 источников, в том числе 116 зарубежных,
проиллюстрирована 44 рисунками, 33 таблицами.
Тадалафил - ингибитор фосфодиэстеразы - 5 как агент фармакологического прекондиционирования
Антикоагуляционная терапия заключается в методах введения гепарина и низкомолекулярных гепаринов. Показанием для проведения данной терапии является вероятный эмболический характер инсульта, но несмотря на снижение риска повторного развития ишемии и высокую эффективность таких методов при тромбоэмболии лёгочной артерии, венозных тромбозах, эмболических инсультах, частота развития геморрагических осложнений высока.
Антиагрегантная терапия применяется при риске развитии ишемического инсульта. Всем пациентам с первых двух суток от начала заболевания назначается ацетилсалициловая кислота в дозах до 325 мг/сут [119,120].
В блоке патогенетической терапии выделяют также методы первичной и вторичной нейропротекции. По экспериментальным данным доклинических и клинических исследований, раннее назначение нейропротективных препаратов позволяет уменьшить количество транзиторных ишемических атак и «малых» инсультов среди ОНМК ишемического типа, происходящих за счет уменьшения числа осложненных инсультов, значительно снизить площадь инфаркта мозга, пролонгировать период «терапевтического окна». Необходимо производить протекцию от реперфузионного повреждения [99,120, 137, 158]. Нейропротекция представляет собой комплекс методов, по средством которых предотвращается или снижается возникновение главных звеньев патохимического каскада, которые приводят к метаболическим изменениям ткани мозга. Для первичной нейропротекции используют лекарственные средства, функцией которых является быстрое прерывание глутамат-кальциевого каскада. Это необходимо для коррекции дисбаланса возбуждающих и тормозных нейротрансмиттерных систем, активизации природных тормозных процессов. Учитывая важную роль Са2+-индуцированной эксайтотоксичности в повреждении нервной ткани при ишемии, обосновано применение антагонистов кальция. Другие же антогонисты кальция (АК) (дародипина, исрадипина, цереброкраста) при ишемии мозга не обладают существенным нейропротективным действием. При этом артериальная гипотония являтся основным параметром ограничением для их назначения в первые часы после развития ишемического инсульта.
Первичную нейропротекцию нужно начинать с момента развития патологии. Курс терапии составляет минимум 72 ч, а особенно активно проводится в первые 12 ч. Первыми нейропротективными препаратами в экспериментальных условиях, для которых установили способность существенно (до 70 %) ограничивать зону инфаркта с помощью сохранения жизнеспособности места «ишемической полутени», являются антагонисты NMDA-рецепторов.
Нецелесообразно назначать при ишемическом инсульте другие
лекарственные средства этой группы, которые являются низкоаффинными антагонистами NMDA-рецепторов и обладают способностью ингибировать потенциалзависимые кальциевые каналы (дизолципин, ремацемид, аптиганел), так как они обладают нефротоксическим действием. На сегодняшний день были получены данные об эффективности лекарственных средств магния и глицина, использование которых ускоряет регресс расстройств сознания и других общемозговых симптомов, очагового дефекта, признаков отёка мозга и ускоряет регенерацию нарушенных неврологических функций [25, 43, 89, 106]. Глицин оказывает не только нейротрансмиттерное, но и общеметаболическое действие.
Он связывает низкомолекулярные токсичные продукты (альдегиды и кетоны), которые в больших количествах образуются в процессе ишемии. Сублингвальное назначение глицина в первые дни инсульта (в дозе 20 мг/кг; в среднем 1,0-2,0 г/сут) безопасно и может обеспечить церебропротекцию у больных с разной локализацией сосудистого поражения. Вторичная нейропротекция оказывает антиоксидантное воздействие. Основные направления вторичной антиоксидантной нейропротекции: замедление местной воспалительной реакции (антагонисты провоспалительных цитокинов и молекул клеточной адгезии), повышение трофического обеспечения мозга (нейротрофины), нейроиммуномодуляция (нейропептиды), регуляция рецепторных структур (ганглиозиды). В России к более активно применяемым препаратам метаболического и трофического действия относят: производные гамма-аминомасляной кислоты (ГАМК) – ноотропы («Пирацетам»); средства, участвующие в метаболизме ацетилхолина («Глиатилин», «Цитиколин»); вещества, влияющие на текучесть мембран (АКТГ-подобные пептиды); препараты карнитина гидрохлорида.
Лекарственные препараты антиоксидантной терапии подразделяют на препараты с первичной и вторичной антиоксидантной активностью. ЛС из первой группы обладают эффектом воздействия на процессы инактивации свободно-перикисного окисления в ишемизированных тканях. ЛС второй группы повышают устойчивость к гипоксии, благодаря активации ферментов антиоксидантной протекции, коррекции патологической активности определённых органов и систем, метаболических процессов, находящихся в основе энергообеспечения тканей. Стимуляция метаболической цепи цикла Кребса является первым из перспективных путей повышения энергетического обмена нейронов и клеток глии в условиях гипоксии, появляющейся из-за ишемии мозга. Главным способом достижения этого эффекта является применение сукцинат-содержащих веществ и препаратов этилметилгидроксипиридинасукцината [3, 57]. В последнее десятилетие в комплекс традиционной терапии при ишемическом инсульте включен унитол и токоферол (витамин Е), который также может использоваться в комбинированных формах (Аевит).
При лечении данной патологии доказана высокая эффективность таких ЛС, как эмоксипин и мексидол [26]. Эмоксипин является производным 3-гидроксипиридина (структурный аналог витамина В6). К основным эффектам эмоксипина относят: торможение липидной пероксидации и активацию антиоксидантной системы; изменение активности мембраносвязанных ферментов; изменение метаболической, рецепторной и транспортной функций клеточных мембран. Данный препарат стабилизирует Са2+-зависимую аденозинтрифосфатазу эндоплазматического ретикулума в условиях денатурации сарколеммы и мешает повреждению мембраны клетки.
Мексидол (соль эмоксипина и янтарной кислоты) является антиоксидантом нового поколения, который тормозит свободнорадикальные процессы, тем самым увеличивая концентрацию восстановленной формы глутатиона, активизирует внутреннюю антиоксидантную систему супероксиддисмутазы и церулоплазмина, предупреждает снижение активности глутатионзависимых ферментов (глутатионпероксидазы и глутатионредуктазы) [26]. Основная стратегия вторичной нейропротекции– разработка и внедрение в клиническую практику нейротрофического препарата с ростовыми свойствами. Факторы роста более предпочтительны в тактике лечения инсульта. Они представляют собой эндогенные полипептиды, которые имеют нейропротективные и репаративные свойства, благоприятно влияют на пролиферацию. В настоящие время большое внимание уделяется изучению свойств низкомолекулярных нейропептидов, так как естественные полипептидные факторы роста не проникают через гематоэнцефалический барьер и их клиническое использование ограничено. Эти соединения (нейропептиды) беспрепятственно проникают в мозг и оказывают многогранное воздействие на ЦНС. Нейропептиды характеризуются большой эффективностью и выраженной направленностью действия, если их концентрация в организме мала.
Перечень используемых реактивов и веществ
Все эксперименты были выполнены в соответствии с методическими рекомендациями по доклиническому изучению лекарственных средств для лечения нарушений мозгового кровообращения и мигрени [52,55]. Исследования проводили в условиях наркоза (Золетил 60 мг/кг и Хлоралгидрат 160 мг/кг, внутрибрюшинно)[87]. В работе были использованы несколько методов воспроизведения
экспериментальных моделей ишемии головного мозга:
1. Способ моделирования экспериментальной «двухсосудистой» модели ишемии головного мозга Нарушение мозгового кровообращения ишемического генеза моделируется путем временной окклюзии двух общих сонных артерий с последующей реперфузией. В зависимости от целей исследования длительность эпизодов ишемии-реперфузии может варьировать.
С зоны доступа удаляли волосяной покров с помощью депиляционного крема (рисунок 2.1, А). Была проведена антисептическая обработка операционного поля. Далее крысе делали небольшой разрез мягких тканей по средней линии шеи. Мышцы разводили тупым способом (рисунок 2.1, Б). Осуществляли выделение двух общих сонных артерий (рисунок 2.1, В) [41]. После крысе накладывали датчики для регистрации электроэнцефалограммы. Общие сонные артерии пережимались клипсами на 4 мин. (рисунок 2.1, Д). Рана послойно ушивалась, операционное поле обрабатывалось раствором антисептика. Животное помещали в индивидуальную клетку на 1 сут. Велось пристальное наблюдение для фиксации случаев ранней гибели.
2. Способ моделирования экспериментальной «четырехсосудистой» модели ишемии головного мозга С зоны доступа удаляли волосяной покров с помощью депиляционного крема (рисунок 2.1, А). Была проведена антисептическая обработка операционного поля. Далее крысе делали небольшой разрез мягких тканей по средней линии шеи. Мышцы разводили тупым способом (рисунок 2.1, Б). Осуществляли выделение двух общих сонных артерий (рисунок 2.1, В). Трахейную трубку, щитовидную железу отодвигали в сторону, чтобы открыть доступ к позвоночнику. Коагуляцию позвоночных артерий осуществляли на уровне С2-С3 (рисунок 2.1, Г), далее – перекрыв просвет сонных артерий (рисунок 2.1, Д) [151], выполняли регистрацию ЭЭГ и микроциркуляции в сетчатке животного методом ЛДФ. Это являлось основным критерием адекватно выполненной методики [21]. Рана послойно ушивалась, операционное поле обрабатывалось раствором антисептика. Животное помещали в индивидуальную клетку на 1 сутки. Велось пристальное наблюдение для фиксации случаев ранней гибели.
Оценка адекватности выполнения окклюзии артерий, кровоснабжающих мозг, осуществлялась с помощью регистрации электрической активности головного мозга животного и уровня микроциркуляции в склере глаза с помощью лазерной доплеровской флоуметрии, на приборе Biopac Systems Inc.MP150 EEG100C и LDF 100С. В первом случае 2 датчика фиксировались на голове животного и 1 на брюшке. Для снятия уровня микроциркуляции датчик игольчатого типа TSD-144 (США) наводили на глазное яблоко животного. Методы осуществлялись при помощи программы AcqKnowledge 4.2. Критерием правильно выполненной методики являлось уменьшение амплитуды ЭЭГ и снижение уровня микроциркуляции. 2.2.3 Методы оценки неврологического дефицита у крыс Неврологический дефицит является следствием ишемии головного мозга и сопровождается изменением стандартного неврологического статуса (парез, плегия, нарушение чувствительности, головокружение и т. п.) [21, 100]. Для оценки неврологического статуса крыс использовали следующие методы: 1. Балльная шкала оценки инсульта McGraw в модификации И.В. Ганнушкиной [21, 142] Данная шкала оценки представлена в таблице 2.2. Внутри группы крыс с признаками неврологического дефицита подразделяли на животных с легкой, средней и тяжелой симптоматикой неврологического дефицита. Если у животного присутствуют несколько признаков неврологического дефицита, то баллы суммируются. ПКЛ-поведенческий тест для изучения активности, эмоционального состояния и уровня тревожности лабораторных животных во время эксперимента. Выделяется несколько модификаций методики «Приподнятого крестообразного лабиринта». Разница заключается в определяемых параметрах. В данном эксперименте регистрировалось поведение животных в течение 3 мин. Далее оценивались следующие параметры: суммарное время нахождения в открытых и закрытых рукавах, количество стоек, свисаний. В эксперименте использовалась установка лабиринта фирмы Panlab Harvard Apparaturs LE 846. Таблица 2.2 – Шкала оценки неврологического дефицита по McGraw в модификации И.В. Ганнушкиной (1996) [21]
«Инфракрасный монитор активности»[35] «Инфракрасный монитор активности» включает в себя двухмерную квадратную раму и систему инфракрасных лучей для детектирования движений животного. IR Actimeter позволяет выполнять тестирование произвольной двигательной активности, числа и продолжительности эпизодов вставания на задние лапы, стереотипных движений, а также исследовательского поведения в модели «перфорированного поля» в условиях дневного и ночного освещения. Программное обеспечение ActiTrack позволяет сделать анализ траектории движения животного (расстояния, скорости, времени, проведенного в определенных зонах). Используется для оценки ориентировочно исследовательского поведения. Инфракрасный монитор активности. Пример трека животного
Для получения более точных результатов и верной их интерпретации плазма животных исследовалась на два маркера повреждения головного мозга. Определялась их концентрация в сыворотке [170]. Для этого из вены крысы брали 5 мл крови. Образцы центрифугировали в течение 10 мин. при 2500 об/мин. и отбирали полученную сыворотку. Концентрация исследуемого белка измерялась методом электрохемилюминесцентного иммуноанализа «EKLIA» при помощи тест - системы для количественного определения in vitro S100 (S100 A1B и S100 BB), NSE на анализаторе Cobas.
Экспериментальный подбор продолжительности ишемического эпизода
Экспериментальное изучение прекондиционирующего и церебропротективного действия тадалафила: 1 группа – четырехсосудистая модель ИГМ, t=4 мин.+ тадалафил (n = 10). За 60 мин до моделирования патологии животным внутрибрюшинно вводился тадалафил в дозе 1 мг/кг. Оценка неврологического дефицита производилась на 1,3,7 и 14 сут. Поведенческие реакции оценивались до моделирования патологии и на 2 сут после операции. Определялось наличие специфических маркеров повреждения головного мозга S100B и NSE. Проводилось морфометрическое исследование.
Экспериментальное исследование церебропротективного действия «Эпокрина»: 1 группа – четырехсосудистая модель ИГМ, t=4 мин.+ «Эпокрин» (n = 10). За 30 мин до моделирования патологии животным внутрибрюшинно вводился «Эпокрин» в дозе 50 МЕ/кг. Оценка неврологического дефицита производилась на 1, 3, 7 и 14 сут. Поведенческие реакции оценивались до моделирования патологии и на 2 сут после операции. Определялось наличие специфических маркеров повреждения головного мозга S100B и NSE. Проводилось морфометрическое исследование.
Экспериментальное исследование церебропротективного действия «Глиатилина»»: 1 группа – четырехсосудистая модель ИГМ, t=4 мин + «Глиатилин» после моделирования патологии (n = 10). После моделирования животным ИГМ вводился внутрибрюшинно «Глиатилин» спустя 30 мин в дозе 85,7 мг/кг. Оценка неврологического дефицита производилась на 1,3,7 и на 14 сут. Поведенческие реакции оценивались до моделирования патологии и на 2 сут после операции.
Определялось наличие специфических маркеров повреждения головного мозга S100B и NSE. Проводилось морфометрическое исследование. 2 группа – четырехсосудистая модель ИГМ, t=4 мин. + «Глиатилин» за 30 мин до моделирования патологии в дозе 85,7 мг/кг (n = 10). Оценка неврологического дефицита производилась на 1, 3, 7 и на 14 сут. Поведенческие реакции оценивались до моделирования патологии и на 2 сут после операции. Определялось наличие специфических маркеров повреждения головного мозга S100B и NSE. Проводили морфометрическое исследование. Экспериментальное исследование церебропротективного действия комбинации тадалафила и «Глиатилина»: 1 группа – четырехсосудистая модель ИГМ, t=4 мин + тадалафил + «Глиатилин» (n = 10). За 30 мин до моделирования патологии животным вводился тадалафил в дозе 1 мг/кг, через 30 мин после моделирования ИГМ «Глиатилин» в дозе 85,7 мг/кг.Оценка неврологического дефицита производилась на 1, 3, 7 и на 14 сут. Поведенческие реакции оценивались до моделирования патологии и на 2 сут после операции. Определялось наличие специфических маркеров повреждения головного мозга S100B и NSE. Проводилось морфометрическое исследование.
Экспериментальное исследование К+АТФ-азных каналов в реализации церебропротекторных эффектов фармакологического прекондиционирования тадалафилом и рекомбинантным эритропоэтином: 1 группа – глибенкламид + тадалафил + четырехсосудистая модель ИГМ, t = 4 мин (n = 10). За 60 мин до моделирования патологии животным вводился внутрибрюшинно глибенкламид в дозе 5 мг/кг, за 30 мин до моделирования – тадалафил. Оценка неврологического дефицита производилась на 1, 3, 7 и 14 сут. Поведенческие реакции оценивались до моделирования патологии и на 2 сутки после операции. Определялось наличие специфических маркеров повреждения головного мозга S100B и NSE. Проводилось морфометрическое исследование. 2 группа – глибенкламид + «Эпокрин» + четырехсосудистая модель ИГМ, t = 4 мин (n = 10). За 60 мин до моделирования патологии животным вводился внутрибрюшинно глибенкламид в дозе 5 мг/кг, а за 30 мин до моделирования – эритропоэтин в дозе 50 МЕ/кг. Оценка неврологического дефицита производилась на 1, 3, 7 и на 14 сут. Поведенческие реакции оценивались до моделирования патологии и на 2 сут после операции. Определялось наличие специфических маркеров повреждения головного мозга S100B и NSE. Проводилось морфометрическое исследование. Ишемическое-реперфузионное повреждение головного мозга оценивалось по уровню нейроспецифического маркера в сыворотке крови, неврологическим нарушениям и по размерам ишемических-реперфузионных повреждений
Оценка поведенческого статуса и неврологического дефицита групп с фармакологическим прекондиционированием тадалафилом, рекомбинантным эритропоэтином при предварительном введении глибенкламида
Ишемические повреждения головного мозга, появляющиеся вследствие тотального или локального снижения перфузии, находятся в ряду самых главных причин инвалидности и смертности во всём мире. Последствия тотальной ишемии головного мозга после остановки сердца (и успешной реанимации), очаговых окклюзий, инсультов, кровоизлияний и ишемических повреждений головного мозга после оперативного вмешательства на сердце или головном мозге негативно влияют на жизнь миллионов людей в разных уголках нашей планеты [124, 134]. Для защиты в такой ситуации используют нейропротекторы.
Нейропротекция – одно из ключевых направлений в стратегии лечения при ишемическом инсульте. Основная ее роль заключается в прерывании или замедлении каскада повреждающих биохимических и молекулярных реакций. Нейропротекция ускоряет активацию протекторных свойств нейронов, эндотелиальных и глиальных клеток при ишемических процессах [60, 116].
Нейропротекция и быстрая репарация головного мозга пациентов после его тяжёлого повреждения неизменно являются главными нереализованными медицинскими целями. Современные схемы лечения или неэффективны, или сопровождаются значимыми нежелательными эффектами. Поэтому постоянно ведутся изучения эндогенных механизмов, с помощью которых головной мозг может защитить себя от воздействия неблагоприятных стимулов и быстро восстанавливается после повреждений.
Последние десять лет интенсивно ведутся исследования
прекондиционирования («индуцированная толерантность»), что способствует созданию всевозможных многообещающих стратегий лечения пациентов с тяжёлыми патологиями головного мозга. Многие из данных стратегий были исследованы в ходе рандомизированных клинических испытаний. Важно, что изучение прекондиционирования привело к зарождению идеи о профилактически индуцируемой церебропротекции.
Есть данные, что прекондиционирующий транскрипционный фактор – цАМФ-зависимый связывающий белок (CREB) – благоприятно влияет на ускорение интенсивности выработки антиапоптотических белков BCL2 и BCLXL. Помимо этого, под воздействием прекондиционирования идет стабилизация потенциала мембран митохондрий, значительно уменьшается высвобождение митохондриального цитохрома С и снижается интенсивность выработки каспазы 3 и уменьшается активность ядерного белка p53 [115]. При воспроизведении четырехсосудистой ишемии головного мозга на крысах происходит запуск механизмов предотвращения апоптоза нейронов под воздействием ишемического прекондиционирования. Включается активация фосфатидилинозитол-3ОН-киназы (PI3K) и протеинкиназы В с последующей блокировкой сигнальных путей апоптоза [130].
Также прекондиционирование препятствует транслокации в митохондрии проапоптотического фактора BAD, мешает его связыванию с BCL-XL и расщеплению последнего с образованием проапоптотического фрагмента N-Bcl-XL; предотвращает образованию каналов в наружной мембране митохондрий. Скорость выхода цитохрома С из пространства меж мембранами митохондрий тоже снижается. В итоге в головном мозге крыс с ишемией-реперфузией, фиксировалась минимальная активность каспаз и небольшая активность апоптоза [130].
С клинической и практической точки зрения прекондиционирование фармакологическими агентами удобнее ишемического, так как технически проще, при его использовании нет потенциальной опасности ишемических периодов для измененных тканей. Огромное преимущество для клинического применения заключается в возможности контролировать длительность периода толерантности [95]. С нашей точки зрения, перспективным для исследований в прекондиционировании головного мозга являются ингибитор фосфодиэстеразы-5 и эритропоэтин.
Одной из многих ветвей исследования средств, обладающих фармакологическим прекондиционированием, является воздействие на путь NO-цГМФ- протеинкиназа G (ПК-G). При активизации ПК-G происходит фосфорилирование К+ каналов, снижение чувствительности мембраны по отношению к нервным импульсам и её гиперполяризация. Далее происходит снижение концентрации свободного Ca+2 цитоплазмы. Эти механизмы являются основой вазодилатирующих эффектов оксида азота. Главную роль в этом механизме играет фосфодиэстераза-5. Именно она уменьшает накопление цГМФ. Недавно появилась новая потенциальная терапевтическая стратегия для ингибитора фосфодиэстеразы типа 5, что и ФДЭ-5 оказывает протективное воздействие на мозг при нейрогенных, нейродегенеративных заболеваниях и потери памяти (см. рисунок 4).
Активизации ПК-G пути играет важную роль в развитии нескольких нейрозаболеваний, таких как болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона и рассеянный склероз. Поэтому разработаны препараты-ингибитры фосфодиэстеразы-5, которые необходимы для вазодилятации. Фосфодиэстеразы (ФДЭ) являются частью семейства Zn2+-зависимых металлофосфогидролаз, которые осуществляют функцию специфического расщепления цАМФ и/или цГМФ с образованием 5 -монофосфатного нуклеотида, принимают участие в регуляции содержащихся в клетках циклических нуклеотидов [4, 62, 71]. ФДЭ-5 могут накапливать цГМФ, что является катализатором захвата серотонина и ускорением транспортера серотонина. Серотонин играет важную роль в развитии легочной гипертензии, активизируя гипертрофию мышечных клеток, пролиферацию фибробластов и сосудорасширение в ответ на гипоксию [4, 144].
В настоящее время выполнен ряд научных исследований, где показывается эффективность использования ингибиторов ФДЭ-5 для профилактики, а также сокращения объема повреждений при ишемических повреждениях органов. В литературных источниках имеются данные, которые свидетельствуют о способности ингибиторов ФДЭ-5, увеличивая содержание цГМФ, тормозить 112 агрегацию тромбоцитов [35, 79, 149]. При ишемических-реперфузионных повреждениях на экспериментальной модели у животных и у людей выявлена способность ингибиторов ФДЭ-5 оказывать защитный эффект [166, 175, 187]. Введение иФДЭ-5 приводит к открытию митохондриальных АТФ чувствительных калиевых каналов, которые ингибируются глибенкламидом, что свидетельствует о наличии у него прекондиционирующего эффекта [187]. Еще одним из положительных эффектов ингибиторов ФДЭ-5 является уменьшение процессов апоптоза [170].