Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 11
1.1. Роль простагландиновой, калликреин-кининовой и ренин-ангиотензиновой систем в контроле ионорегулирующей функции почек 11
1.1.1. Простагландиновая система почек 11
1.1.2. Калликреин-кининовая система почек 16
1.1.3. Ренин-ангиотензиновая система почек 22
1.2. Участие почечной дофаминергической системы в регуляции
транспорта натрия в канальцах почек 30
1.3. Влияние дофамина на ионорегулирующую функцию почек 34
1.4. Заключение 37
Глава 2. Материалы и методы исследования 39
Глава 3. Собственные исследования
3.1. Влияние допамина и антагониста D-дофаминовых рецепторов галоперидола на ионорегулирующую функцию почек крыс 44
3.2. Взаимодействие допамина в почке крыс с ингибитором синтеза простагландинов диклофенаком натрия 49
3.3. Взаимодействие допамина в почке крыс с ингибитором калликреин-кининовой системы контрикалом 54
3.4. Влияние ингибиторов системы ренин-ангиотензин эналаприла, лозартана и алискирена на реакцию почек крыс при действии допамина 57
3.5. Взаимодействие допамина с петлевым диуретиком фуросемидом в почке крыс с моделью сердечной недостаточности 66
Заключение 72
Выводы 82
Практические рекомендации 83
Список сокращений 84
Список литературы
- Простагландиновая система почек
- Влияние дофамина на ионорегулирующую функцию почек
- Взаимодействие допамина в почке крыс с ингибитором синтеза простагландинов диклофенаком натрия
- Влияние ингибиторов системы ренин-ангиотензин эналаприла, лозартана и алискирена на реакцию почек крыс при действии допамина
Введение к работе
Актуальность темы исследования и степень ее разработанности
Дофаминомиметик допамин, идентичный естественному медиатору дофамину, является лекарственным препаратом, который широко используется для лечения кардиогенного шока и острой сердечной недостаточности, включая острый кардиоренальный синдром, возникающий у лиц с острой декомпенсированной ХСН (Национальные рекомендации по диагностике и лечению ХСН // Журнал Сердечная недостаточность. 2009. Т. 10, № 2. С. 64-106). В этих условиях допа-мин оказывает благоприятное влияние на почки, способствуя не только восстановлению почечной гемодинамики, но и увеличению диуреза и выделению с мочой электролитов, что препятствует избыточной задержке жидкости и ухудшению клинического состояния больного.
Благоприятное действие допамина на ионорегулирующую функцию почек связано с прямой стимуляцией D1-дофаминовых рецепторов, которые располагаются в гладкой мускулатуре почечных сосудов, гломерулярных артериолах, клетках проксимальных канальцев и других сегментов нефрона. При их возбуждении развивается выраженная диуретическая реакция, обусловленная, прежде всего, угнетением реабсорбции натрия в ПК, которое возникает в ответ на подавление активности апикального Na+/H+-ионообменника 3 типа (NHE3) и Na+, K+-АТФ-азы, локализованной в базолатеральных мембранах канальцевых клеток (Gildea J.J., Israel J.A., Johnson A.K. et al. Caveolin-1 and dopamine mediated internalization of Na-K ATP-ase in human renal proximal cell // Hypertension. 2009. Vol. 54, № 5. P. 1070-1076; Hu M.C., Di Sole F., Zhand J. et al. Chronic regulation of renal Na+/H+-exchanger NHE3 by dopamine: translational, and posttranslational mechanisms //Am. J. Physiol. Renal. Physiol. 2013. Vol. 304, № 9. P. F1169-F1180).
Однако, несмотря на глубокую разработку современных представлений о дофаминергической регуляции функции почек, многие стороны действия допа-мина на почки изучены недостаточно или совсем не исследованы. Это касается возможного участия в механизме формирования сосудистого и канальцевого эффектов допамина РАС и других почечных нейрогуморальных систем, которые участвуют в регуляции транспорта ионов в проксимальном канальце и других сегментах нефрона. Их роль в механизме действия допамина на почки не исследована, хотя выяснение этого вопроса имеет существенное значение не только для уточнения фармакодинамики этого препарата, но и оценки характера его взаимодействия в почках с ингибиторами РАС с другими нейрогуморальными системами. Недостаточно исследованы также особенности фармакодинамического взаимодействия допамина в почках с фуросемидом и другими петлевыми диуретиками, которые применяются в комбинации с этим препаратом у больных с деком-пенсированной ХСН для восстановления диуреза и устранения избыточной задержки жидкости в организме.
В настоящей работе проведен фармакологический анализ роли простаглан-диновой (ПГ), калликреин-кининовой (ККС) и ренин-ангиотензиновой систем (РАС) в механизме формирования почечных эффектов допамина и изучены осо-
бенности его взаимодействия с диуретиком фуросемидом в почках крыс на модели сердечной недостаточности.
Цель исследования
Цель исследования – уточнение роли почечных нейрогуморальных систем в механизме действия допамина на ионорегулирующую функцию почек и оценка характера его фармакодинамического взаимодействия в почках с петлевыми диуретиками при экспериментальной сердечной недостаточности.
Задачи исследования
Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:
-
Исследовать влияние дофаминомиметика допамина на ионорегулирую-щую функцию почек крыс.
-
Оценить влияние антагониста D-дофаминовых рецепторов галоперидола на реакцию почек крыс в ответ на допамин.
-
Изучить влияние специфических ингибиторов простагландиновой системы (диклофенак натрия), калликреин-кининовой системы (контрикал) и ренин-ангиотензиновой системы (эналаприл, лозартан, алискирен) на ионорегулирую-щую функцию почек крыс при действии допамина.
-
Исследовать фармакодинамическое взаимодействие допамина с петлевым диуретиком фуросемидом в почке крыс с экспериментальной сердечной недостаточностью, вызванной длительным воздействием на сердце избыточной физической нагрузки и больших доз адреномиметика фенилэфрина.
Методология и методы исследования
Для оценки роли почечных простагландиновой, калликреин-кининовой и ренин-ангиотензиновой систем в механизме действия допамина на ионорегули-рующую функцию почек крыс и изучения характера его фармакодинамического взаимодействия в почках с фуросемидом у крыс с экспериментальной сердечной недостаточностью использованы различные методологические подходы.
Клиренсовые опыты на наркотизированных крысах
Эксперименты выполнены на 90 наркотизированных тиопенталом натрия (50 мг/кг, внутрибрюшинно) крысах-самцах массой 190-220 г (питомник «Столбовая», Московская область), находившихся на обычном рационе вивария. После наступления наркоза крысу фиксировали на спине и вскрывали брюшную полость. В мочевой пузырь и заднюю полую вену вводили катетеры для сбора мочи и введения 0,9% раствора NaCl, содержащего 0,25% инулина, со скоростью 50 мкл/мин, которую поддерживали на постоянном уровне в течение всего эксперимента. Одновременно из мочевого пузыря в мерные пипетки собирали 10-минутные порции мочи. После стабилизации диуреза собирали две контрольные порции мочи, вводили допамин и исследовали функцию почек крыс в течение 80-90 минут наблюдения. Перед инъекцией препарата, в середине и в конце эксперимента из хвостовой вены брали пробы крови в объеме 0,1 мл. В полученных пробах крови и мочи определяли концентрацию инулина антроновым методом и исследовали содержание натрия и калия методом пламенной фотометрии.
Функция почек оценивалась по величине диуреза, клиренса инулина, характеризующего скорость клубочковой фильтрации, выделении натрия и калия с мо-
чой, экскретируемой фракции натрия и отношения (индекса) натрий/калий мочи, которые рассчитывались по стандартным формулам в пересчете на 100 г массы животного (Рябов С.И., Наточин Ю.В. Методы очищения в оценке функционального состояния почки (глава 2) // Функциональная нефрология. СПб.: Лань, 1997. С.45-76).
Допамин (допмин) водился крысам однократно подкожно в дозе 1мг/кг, вызывающей выраженную диуретическую реакцию. Функция почек крыс изучалась также при комбинации допамина с антагонистом D-дофаминовых рецепторов га-лоперидолом, ингибитором калликреина контрикалом и ингибитором циклоокси-геназы диклофенаком натрия, которые вводились внутримышечно соответственно в дозах 1 мг/кг, 6000 АТрЕ/кг и 3 мг/кг за 20 минут до введения допамина. Ингибитор АПФ эналаприл, антагонист АТ1-ангиотензиновых рецепторов лозартан и алискирен предварительно вводились животным однократно внутрь в течение 7 дней до постановки эксперимента в дозах соответственно 1мг/кг, 1мг/кг и 4 мг/кг, которые примерно соответствуют высшим суточным дозам для человека.
Каждый опыт ставился на одном животном. После окончания опыта крысы подвергались эвтаназии с помощью передозировки наркоза. Всего выполнено 9 серий экспериментов (90 опытов).
Опыты на крысах с моделью сердечной недостаточности
В экспериментах использовались 22 крысы-самца массой 200-250 г, находившиеся на стандартном рационе вивария и имевшие свободный доступ к воде. Животные были разделены на две группы, в которых после первоначальной оценки действия допамина и фуросемида на функцию почек интактных крыс и 3-дневного периода “washout” моделировалась сердечная недостаточность и вновь изучалась реакция почек на исследуемые препараты.
Экспериментальную сердечную недостаточность у крыс моделировали по методике В.И. Инчиной и др. (2000) в модификации С.П. Саликовой и др. (2002). Для этого животным ежедневно в течение 10 дней вводили подкожно 0,1 мл 1% раствора адреномиметика фенилэфрина и затем подвергали их интенсивному плаванию до полного изнеможения. В результате у крыс формировалась ЭСН, которая подтверждалась клиническими (тахикардия, асцит, гепатомегалия) и морфологическими (микроскопия гистологических срезов миокарда и печени) данными (Инчина В.И., Столярова В.В., Гарькин Г.Г. и др. Состояние миокарда в модельной ситуации активации гипертензивных механизмов // Второй конгресс по патофизиологии. М. 2000. С.68; Саликова С.П., Пресняков С.В., Фарек Фуад Мухаммед. Структурный анализ миокарда крыс с экспериментальной сердечной недостаточностью при культивировании in vitro // Морфология. 2002. Т.121. № 2-3. С.128-129).
Влияние лекарственных препаратов на функцию почек крыс изучалось на фоне 3% водной нагрузки с добавлением 0,6% хлорида натрия. С этой целью животные после солевой нагрузки и введения препаратов помещались в индивидуальные плексигласовые боксы для сбора мочи. Моча собиралась каждые 1,5 часа в течение 4,5 часов. В полученных образцах мочи с использованием коммерческих наборов CREATININE 60 (фирма «Кормей», Польша) определяли содержа-
ние креатинина на биохимическом анализаторе «Vitalit» (фирма «I.S.E.S.r.I.», Италия) и исследовали концентрацию натрия и калия на пламенном фотометре. Показатели диуреза, экскреции с мочой креатинина, натрия, калия и отношение натрий/калий мочи рассчитывали по общепринятым формулам. Допамин и фуро-семид вводились однократно подкожно в дозах 1 мг/кг.
По окончании опытов животных подвергали эвтаназии с помощью передозировки наркоза. Всего выполнено 6 серий экспериментов (60 опытов).
Опыты на наркотизированных и бодрствующих крысах проведены в соответствии с требованиями приказов № 1179 МЗ СССР от 10.10. 1983 г., № 267 МЗ РФ от 19.06. 2003 г., регламента Европейской Конвенции (Страсбург, 1986) по содержанию, уходу за подопытными животными, выводу их из эксперимента и последующей утилизации. План исследования одобрен Локальным этическим комитетом ГБОУ ВПО «Оренбургская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения РФ (протокол № 68 от 26 сентября 2012 г.).
Статистическая обработка данных проведена на персональном компьютере с использованием программы STATISTICA 5.0. Статистическую значимость различий количественных характеристик между выборками данных, полученных в экспериментах на наркотизированных крысах, оценивали с помощью критерия Вилкоксона для парных данных. Достоверность не связанных между собой данных, полученных в опытах на животных с экспериментальной ХСН, проверялась с помощью критерия Манна-Уитни. Статистически достоверными считались различия при р < 0,05.
Степень достоверности, апробация результатов, личное участие автора
Научные положения, выводы и рекомендации диссертации основаны на анализе достаточного объема фактических данных, избранном дизайне и использовании современных методов оценки ионорегулирующей функции почек, адекватных сформулированным в работе целям и задачам. В работе использовались сертифицированные отечественные и импортные лекарственные препараты, позволившие получить достоверные данные о механизме формирования их почечных эффектов. Статистическая оценка результатов исследования проведена с использованием современных компьютерных методик обработки и оценки исходных количественных показателей.
Основные положения диссертации доложены, обсуждены и опубликованы в материалах Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых «Сибирский медико-биологический конгресс» (г. Барнаул, 2011) Всероссийских конференций молодых ученых и специалистов Оренбургской области (г. Оренбург, 2012, 2013 гг.), Всероссийской научно-практической конференции «Нано-технологии в фармакологии и медицине» (г. Оренбург, 2012 г.). Результаты исследований представлены в материалах Российского национального конгресса кардиологов (г. Москва, 2011, 2012 г.), Московского международного форума кардиологов (г. Москва, 2013, 2014 гг.) и IV съезда фармакологов России «Инновации в современной фармакологии» (г. Казань, 2012 г.).
Апробация работы состоялась на расширенном заседании кафедры фармакологии с участием сотрудников кафедры патологической физиологии, кафедры
патологической анатомии, кафедры биохимии, кафедры клинической лабораторной диагностики, кафедры управления и экономики фармации, фармтехнологии и фармакогнозии ГБОУ ВПО «ОрГМУ» Минздрава России.
Автор непосредственно участвовал в выполнении диссертации на всех этапах работы. Основная идея, цель, задачи, дизайн исследования, его методология и общая концепция определялись совместно с научным руководителем д.м.н., профессором О.Б. Кузьминым. Анализ современной отечественной и зарубежной литературы, статистическая обработка первичных данных, их анализ, написание и оформление диссертации, представление результатов работы в виде научных публикаций и докладов на конференциях осуществлялись лично соискателем. Соавторы к.м.н. М.О. Пугаева и к.м.н. Н.В. Бучнева оказывали консультативную помощь при подготовке ряда публикаций.
Положения, выносимые на защиту
1. Допамин увеличивает скорость клубочковой фильтрации и тормозит у
крыс реабсорбцию натрия в почках, вызывая выраженную диуретическую реак
цию с одновременным увеличением выделения натрия и калия с мочой. Реакция
почек крыс на допамин устраняется антагонистом D-дофаминовых рецепторов га-
лоперидолом.
-
Почечные простагландиновая и калликреин-кининовая системы не участвуют в механизме, опосредующем действие допамина на ионорегулирующую функцию почек крыс.
-
Почечная ренин-ангиотензиновая система препятствует ингибирующему действию допамина на реабсорбцию натрия в почках, ослабляя его диуретический, натрийуретический и калийуретический эффекты.
-
Допамин улучшает у крыс с экспериментальной сердечной недостаточностью, вызванной избыточной физической нагрузкой и введением больших доз ад-реномиметика фенилэфрина, ионорегулирующую функцию почек и значительно усиливает при добавлении к диуретику фуросемиду его диуретический эффект, способствуя дополнительному увеличению выделения натрия с мочой и повышению отношения натрий/калий мочи.
Научная новизна
Впервые в экспериментах с ингибитором ПГ-системы диклофенаком натрия и ингибитором ККС контрикалом показано, что эти нейрогуморальные системы не участвуют в механизме действия допамина на ионорегулирующую функцию почек крыс.
Впервые в опытах с ингибиторами РАС эналаприлом, лозартаном и алиски-реном установлено, что почечная ренин-ангиотензиновая система непосредственно включается в механизм действия допамина на ионорегулирующую функцию почек крыс, выполняя функцию модулятора, препятствующего при действии этого дофаминомиметика избыточной потере воды и электролитов с мочой.
В экспериментах на крысах с ЭСН, вызванной избыточной физической нагрузкой и введением больших доз адреномиметика фенилэфрина, впервые выявлено, что допамин при добавлении к диуретику фуросемиду не только значительно усиливает его диуретическое действие, но и вызывает преимущественное по-
вышение потери натрия с мочой, способствуя существенному увеличению отношения натрий/калий мочи.
Теоретическая и практическая значимость работы
В экспериментах на крысах уточнена роль простагландиновой, калликреин-кининовой и ренин-ангиотензиновой систем в механизме действия допамина на ионорегулирующую функцию почек и выяснены особенности его фармакодина-мического взаимодействия в почках с ингибиторами АПФ, антагонистами АТ1-ангиотензиновых рецепторов и прямыми ингибиторами ренина, которые широко применяются для лекарственной терапии ХСН. На крысах с экспериментальной сердечной недостаточностью уточнены также особенности совместного влияния на ионорегулирующую функцию почек допамина и диуретика фуросемида, комбинация которых широко применятся для устранения рефрактерности к диуретикам у лиц с острой декомпенсированной ХСН.
Практическое значение результатов исследования определяется выяснением особенностей фармакодинамического взаимодействия в почках допамина с ингибиторами синтеза простагландинов, кининов, различными по механизму действия ингибиторами РАС и диуретиком фуросемидом, которые необходимо учитывать при совместном назначении этих препаратов в клинике.
Внедрение результатов исследования в практику
Результаты исследования внедрены в учебный процесс на кафедре фармакологии и кафедре пропедевтики внутренний болезней ГБОУ ВПО «Оренбургский государственный медицинский университет» Минздрава России.
Публикации
Соискатель имеет 17 опубликованных работ, из них по теме диссертации опубликовано 13 научных работ общим объемом 3,4 печатных листа, в том числе 7 публикаций (3 статьи и 4 тезиса) в научных журналах, включенных в Перечень рецензируемых научных журналов и изданий, рекомендованных ВАК РФ для публикации основных научных результатов диссертации, 6 работ опубликовано в материалах всероссийских и международных конференций.
Объем и структура диссертации
Диссертация изложена на 98 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка сокращений и списка литературы. Библиографический указатель включает 128 источников, из них 21 отечественных и 107 иностранных авторов. Работа иллюстрирована 4 рисунками и 12 таблицами.
Простагландиновая система почек
Простагландины представляют собой главную разновидность простаноидов, являющихся метаболитами широко распространенных полиненасыщенных жирных кислот. Основным ферментом, контролирующим образование этих биологи 12 чески активных веществ, является фосфолипаза А2, которая высвобождает арахи-доновую кислоту из фонда мембранных фосфолипидов (рисунок 1.1). Последующие процессы преобразования арахидоновой кислоты связаны с участием цикло-оксигеназы (простагландинсинтазы G2/H2) и других специфических ферментов, которые синтезируют в клетках 5 основных биологически активных простаноидов ПГЕ2, ПГI2, ПГD2, ПГF2 и ТХА2 [30].
Сейчас установлено существование двух изоферментов циклооксигеназы, ЦОГ-1 и ЦОГ-2, которые синтезируются различными генами и отличаются особенностями экспрессии и регуляции. ЦОГ-1 является «конститутивной» циклоок-сигеназой и весьма широко распространена в различных органах и тканях. ЦОГ-2 обозначается термином «индуцируемая», так как в обычных условиях слабо экс-прессирована, но активируется под влиянием провоспалительных и/или пролифе-ративных цитокинов [37]. В почках конститутивная ЦОГ-1 экспрессирована в эн-дотелиальных клетках сосудов, включая гломерулярные афферентные артериолы, мезангиальных клетках клубочков и клетках собирательных трубок коры и, особенно, мозгового вещества [66]. Матричная информационная РНК и сам белок ЦОГ-2 выявляются в относительно небольших количествах в клетках macula densa (плотного пятна) ЮГА, прилегающих к ним клетках ТВКПГ и интерстици-альных клетках внутреннего мозгового слоя почек [51]. Образующиеся под влиянием этих циклооксигеназ простаноиды специфически стимулируют простаноид-ные рецепторы клеток, которые обозначаются как ЕР (для Е-простаноидов), IP, DP, FP и ТР-рецепторы соответственно для каждой их отдельной разновидности. Функциональные сдвиги, возникающие в клетках-мишенях при возбуждении про-станоидных рецепторов, определяется их сопряжением со стимулирующими (Gs) или ингибирующими (Gi) G-белками. EP2, EP4, IP и DP-рецепторы сопряжены с Gs- белками и опосредуют эффекты, связанные с активацией аденилатциклазы и увеличением содержания в клетках цАМФ. ЕР3-рецепторы специфически взаимодействуют с Gi-белками и поэтому, напротив, оказывают ингибирующее влияние на внутриклеточную продукцию этого биологически активного вещества [38].
Простагландины в основном синтезируются в почках, где их продуцируется Рисунок 1.1. - Циклооксигеназный путь метаболизма основных продуктов арахи-доновой кислоты.
ПГЕ2 – простагландин Е2, ПГI2 – простагландин I2, ТХА2 – тромбоксан А2. ЕР, IP, FP и ТР – простаноидные рецепторы различных подтипов. примерно в 10 раз больше, чем в других органах. Этот процесс наиболее активно происходит в интерстициальных клетках внутренней зоны мозгового вещества, липидные гранулы которых содержат большое количество предшественников этих биологически активных веществ. Другой основной источник образования простагландинов в почках – клетки собирательных трубок, локализованных в этой же зоне почечной ткани. В обычных условиях эти клетки продуцируют ПГЕ2 и небольшое количество ПГF2. Скорость и количество продуцируемых простаг-ландинов в коре почек значительно ниже, чем в мозговом веществе, хотя ПГЕ2 синтезируется в биологически активных количествах в клубочках и клетках собирательных трубок, локализованных в корковом слое почек. Эндотелиальные клетки сосудов коры, клубочковых артериол и гломерулярных капилляров продуцирует преимущественно ПГI2, который, подобно ПГЕ2, обладает выраженными сосудорасширяющими свойствами.
Простагландины, синтезируемые в почках, весьма нестойки и практически полностью разрушаются после однократного прохождения через легочный круг кровообращения. Благодаря этому их биологические эффекты развиваются локально и ограничиваются местом образования в клетках различных структур почечной ткани.
Синтезируемые в почках простагландины играют важную роль в регуляции почечной микроциркуляции. Наиболее чувствительными к ним оказались прямые сосуды (vasa recta) мозгового вещества почек, в гладких мышцах которых локализованы в основном ЕР2, ЕР4 и IP-подтипы простаноидных рецепторов, опосредующие сосудорасширяющее действие этих биологически активных веществ. В связи с этим ПГЕ2 и ПГI2, генерируемые эндотелиальными клетками и интерсти-циальными клетками мозгового вещества, обеспечивают поддержание адекватного уровня медуллярного кровотока и снабжения кислородом этой зоны почечной ткани при состояниях и заболеваниях, связанных с гиперактивностью РААС и других сосудосуживающих нейрогормональных систем. Сейчас установлено, что компенсаторные сосудорасширяющие возможности ПГЕ2, продуцируемого эндотелием сосудов коры почек в значительной степени ограничены благодаря высокой плотности в их гладкомышечных клетках ЕР1-рецепторов и, особенно, ЕР3-рецепторов, которые опосредуют сосудосуживающее действие простаноидов [25].
Основным ПГ, синтезируемым в почках, является ПГЕ2, который продуцируется в клетках различных сегментов нефрона и действует как аутокринный фактор, регулирующий транспорт натрия и других ионов. К настоящему времени установлено, что он продуцируется в проксимальных канальцах, клетках ТВКПГ, но в наибольших количествах образуется в эпителиальных клетках собирательных трубок, локализованных в мозговом и корковом веществе почечной ткани [26] . В кортикальных собирательных трубках ПГЕ2 специфически возбуждает ЕР2-рецепторы клеточных мембран, активирует внутриклеточный АЦ/цАМФ сигнальный путь и прямо тормозит транспорт натрия, ингибируя активность Na+, K+- АТФ-азы, локализованной в базолатеральных мембранах канальцевых клеток [107]. Ряд данных свидетельствует о том, что в клетках проксимальных канальцев ПГЕ1 способен оказывать стимулирующее влияние на Na+, K+-АТФ-азу базолате-ральных мембран и повышать эффективность механизма, транспортирующего натрий в этом сегменте нефрона [57].
Особую роль в поддержании функционального состояния почек играет ПГЕ2, который в больших количествах синтезируется интерстициальными клетками мозгового слоя. Благодаря своим свойствам он не только поддерживает адекватный объем медуллярного кровотока, необходимого для нормального функционирования механизма концентрирования мочи, но и одновременно препятствует стимуляции реабсорбции натрия и воды в тех сегментах нефрона, которые, располагаются в этой зоне почечной ткани. Так, взаимодействуя с ЕР2-рецепторами клеток собирательных трубок и медуллярной части ТВКПГ, ПГЕ2 тормозит реабсорбцию натрия, предотвращая его задержку в организме при избыточном потреблении поваренной соли или под влиянием повышенной активности РААС и других сосудосуживающих нейрогуморальных систем [36].
Таким образом, ПГЕ2, являясь одним из основных звеньев сосудорасширяющей натрийуретической простагландиновой системы, выполняет в почках функцию модулятора, который препятствует избыточному влиянию на них СНС, РААС и других сосудосуживающих нейрогуморальных систем, увеличивающих реабсорбцию натрия и задерживающих его организме.
Влияние дофамина на ионорегулирующую функцию почек
Каждый опыт ставился на одном животном. После окончания эксперимента наркотизированные крысы подвергались эвтаназии с помощью внутривенной передозировки наркоза. Всего выполнено 9 серий экспериментов (90 опытов).
Препараты: Допамин (допмин, фирма «Орион-фармацевтика», Финляндия) вводился подкожно однократно в дозе 1 мг/кг, вызывающей выраженную диуре тическую реакцию. Функция почек крыс изучалась также при комбинации допа мина с антагонистом D1-дофаминовых рецепторов галоперидолом (фирма «Richter», Венгрия), ингибитором калликреина контрикалом (апротинин, фирма «AWD», Германия) и ингибитором циклооксигеназы диклофенаком натрия (ди клонат, фирма «Pliva», Хорватия), которые вводились внутримышечно соответст венно в дозах 1 мг/кг, 6000 АТрЕ/кг и 3 мг/кг за 20 минут до введения допамина. Ингибитор АПФ эналаприл (энап, фирма «KRKA», Словения), антагонист АТ1 ангиотензиновых рецепторов лозартан (козаар, фирма «MERCK SHARP&DOHME», Нидерланды) и прямой ингибитор ренина алискирен (расилез, фирма «Novartis Farma», Италия) предварительно назначались животным одно кратно внутрь в дозах соответственно 1,1 и 4 мг/кг/сутки в течение 7 дней до по становки эксперимента. Опыты на крысах с экспериментальной сердечной недостаточностью В экспериментах использовались 22 белые беспородные крысы-самцы массой 200-250 г, находившиеся на стандартном рационе вивария и имевшие свободный доступ к воде. Животные были разделены на две группы, в которых после первоначальной оценки действия допамина и фуросемида на функцию почек ин-тактных крыс и 3-дневного периода “washout” моделировалась сердечная недостаточность и вновь изучалась реакция почек на исследуемые препараты.
Экспериментальную сердечную недостаточность у крыс моделировали по методике В.И. Инчиной и др. (2000) в модификации С.П. Саликовой и др. (2002). Для этого животным в течение 10 дней ежедневно вводили подкожно 0,1 мл 1% раствора адреномиметика фенилэфрина и затем подвергали их интенсивному плаванию до полного изнеможения. В результате у крыс развивается экспериментальная сердечная недостаточность, которая подтверждается клиническими данными (тахикардия, асцит, гепатомегалия) и морфологическими данными (микроскопия гистологических срезов миокарда и печени) [6, 20]. У таких животных выявляется также характерный для застойной ХСН дефект реабсорбции натрия в почке, который проявляется в ее увеличении и замедлении выведения натрия из организма после солевой нагрузки [3].
Влияние лекарственных препаратов на функциональное состояние почек крыс изучалось фоне 3% водной нагрузки с добавлением 0,6% хлорида натрия. С этой целью животные после солевой нагрузки и введения препаратов помещались в индивидуальные плексигласовые боксы для сбора мочи. Моча собиралась через каждые 1,5 часа в течение 4,5 часов. В качестве контроля использовались интакт-ные крысы. В полученных образцах мочи с использованием коммерческих наборов CREATININE 60 (фирма «Кормей», Польша) определяли содержание креати-нина на биохимическом анализаторе «Vitalit» (фирма «I.S.E.S.r.I.», Италия) и исследовали концентрацию натрия и калия на пламенном фотометре ПФМ МУ. Показатели диуреза, экскреции с мочой креатинина, натрия, калия и отношение натрий/калий мочи рассчитывали по общепринятым формулам в пересчете на 100 г массы животного. Для взвешивания крыс использовались электронные весы HL-400 (фирма «A&D», Япония).
По окончании опытов животных подвергали эвтаназии с помощью передозировки наркоза. Всего выполнено 6 серий экспериментов (60 опытов).
Препараты: Допамин и петлевой диуретик фуросемид (лазикс, фирма «Хехт лимитед, Индия») водились однократно подкожно в дозах 1 мг/кг.
Опыты на наркотизированных и бодрствующих крысах проведены в соответствии с этическими нормами, которые регламентированы требованиями по уходу, содержанию, экспериментам на животных и их утилизации, отраженными в международных и отечественных нормативно-правовых документах [5, 7, 17]. План исследования одобрен Локальным этическим комитетом ГБОУ ВПО «Оренбургская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения России (протокол № 68 от 26 сентября 2012 г.).
Статистическая обработка
Статистическая обработка данных проведена на персональном компьютере с использованием программы STATISTICA 5.0. При анализе количественных характеристик для оценки центральной тенденции использовалась М – средняя арифметическая величина и m – средняя ошибка средней арифметической. Статистическую значимость различий количественных характеристик между выборками данных, полученных в экспериментах на наркотизированных крысах, оценивали с помощью критерия Вилкоксона для парных данных. Достоверность не связанных между собой данных, полученных в опытах на животных с экспериментальной ХСН, проверялась с помощью критерия Манна-Уитни [4, 18]. Статистически достоверными считались различия при р 0,05.
Взаимодействие допамина в почке крыс с ингибитором синтеза простагландинов диклофенаком натрия
В первоначальных экспериментах была проведена оценка влияния дофами-номиметика допамина на основные показатели ионорегулирующей функции почек наркотизированных крыс. Введение допамина таким животным вызывало выраженную диуретическую реакцию, которая развивалась в первые 10 мин после инъекции препарата, быстро нарастала и в большинстве опытов достигала максимума спустя 30-40 мин после введения. К 80 мин наблюдения средний уровень диуреза вырос с 1,88±0,07 до 4,18±0,18 мкл/мин/100 г, то-есть в 2,22 раза (р 0,05). Клиренс инулина, отражающий величину СКФ, при этом также возрос, указывая на незначительное, но достоверное увеличение клубочковой фильтрации. Одновременно с увеличением мочеотделения наблюдалась характерная натрийу-ретическая реакция, которая сопровождалась достоверным увеличением выделения натрия с мочой в 2,15 раза. Экскретируемая фракция натрия, отражающая количество натрия, удаляемого с мочой из профильтровавшейся в клубочках жидкости возросла с 0,28±0,02 % до 0,48±0,03 % (р 0,05), что прямо свидетельствует о существенном угнетении реабсорбции этого иона в почечных канальцах. Натрий-уретической реакции, развивавшейся у крыс при введении допамина, сопутствовало также увеличение выделения с мочой ионов калия. Экскреция этого иона спустя 80 мин наблюдения достоверно возросла в 2,77 раза. Индекс натрий/калий мочи при этом существенно не изменился, хотя и имел тенденцию к некоторому снижению (таблица 3.1).
Результаты этих опытов подтвердили известные данные о том, что допамин вызывает у интактных и наркотизированных животных выраженную диуретическую и натрийуретическую реакцию, которая сопровождается увеличением потери калия с мочой. В механизме формирования этих эффектов допамина участвует незначительный прирост СКФ, но главную роль играет угнетение реабсорбции натрия в канальцах почек.
Известно также, что диуретический и натрийуретический эффекты допами-на в основном связаны с прямым возбуждением D1-дофаминовых рецепторов клеток проксимальных канальцев и ТВКПГ, которые опосредуют ингибирующее влияние препарата на реабсорбцию натрия в почках. Для уточнения роли этих рецепторов в механизме действия допамина на ионорегулирующую функцию почек мы исследовали реакцию почек крыс на допамин после предварительной блокады D1-дофаминовых рецепторов почек с помощью дофаминоблокатора галоперидо-ла. С этой целью мы первоначально вводили крысам галоперидол, затем спустя 20 мин – допамин и оценивали характер их фармакодинамического взаимодействия в почках.
Как показывают данные, предварительная инъекция галоперидола практически полностью устраняла диуретическую и натрийуретическую реакцию почек в ответ на дофаминомиметик допамин. К 80 мин наблюдения после введения этого препарата средняя величина мочеотделения практически не изменилась по сравнению с контрольным уровнем, составляя соответственно 2,50 ± 0,09 и 2,38 ± 0,09 мкл/мин/100 г (р 0,05). Аналогичным образом допамин, действуя на фоне предварительной блокады D1-дофаминовых рецепторов почечной ткани, терял способность вызывать выраженную натрийурети ческую реакцию с одновременным увеличением объема клубочковой фильтрации и экскретируемой фракции натрия. Величина последнего показателя, отражающая реабсорбцию натрия в ка 46
Примечание: контроль – значения показателей до введения допамина (1 мг/кг, подкожно). р 0,05 (критерий Вилкоксона). нальцах почек, в этих условиях практически не изменилась, что прямо указывает на потерю допамином способности оказывать специфическое ингибирующее влияние на этот процесс. Устранению галоперидолом натрийуретического действия допамина сопутствовало также резкое ослабление калийуретического эффекта этого препарата, хотя полностью его калийуретический эффект при этом не устранялся. Выделение ионов калия с мочой спустя 80 мин после введения крысам допамина возросло с 0,159 ± 0,02 до 0,213 ± 0,02 мкмоль/мин/100 г (р 0,05). Индекс натрий/калий мочи при этом достоверно снизился в 1,46 раза (таблица 3.2).
Результаты экспериментов с галоперидолом подтвердили представление о том, что реакция почек на дофаминомиметик допамин связана со специфической стимуляцией D-дофаминовых рецепторов гладкой мускулатуры почечных сосудов, клубочковых артериол, клеток проксимальных канальцев и других сегментов нефрона. Хорошо известно, что выраженная диуретическая реакция, развивающаяся при возбуждении D1-дофаминовых рецепторов почек, обусловлена не столько увеличением СКФ, сколько прямым угнетением реабсорбции натрия в проксимальных канальцах в ответ на подавление активности апикального Na+/H+-обменника 3 типа, локализованного в люменальных мембранах канальцевых клеток [27], и Na+, K+-АТФ-азы, осуществляющей активный перенос этих ионов через их базолатеральные мембраны [47, 99]. Однако не исключено, что в механизм формирования эффектов, возникающих в почках при возбуждении D1-дофаминовых рецепторов, могут вовлекаться также различные нейрогуморальные системы, которые участвуют в регуляции транспорта натрия и других ионов в различных сегментах нефрона. Прежде всего, это касается почечной тканевой РАС, активность которой может существенно изменяться под влиянием допами-на. Вполне возможно, что в механизм действия этого препарата на ионорегули-рующую функцию почек могут включаться также простагландиновая и калликре-ин-кининовая системы почек, которые непосредственно контролируют транспорт натрия, воды и других электролитов в проксимальных и дистальных отделах почечных канальцев.
Влияние ингибиторов системы ренин-ангиотензин эналаприла, лозартана и алискирена на реакцию почек крыс при действии допамина
Фуросемид, торасемид и другие петлевые диуретики широко применяются для лечения отечного синдрома у больных ХСН и восстановления функции почек при остром кардиоренальном синдроме, возникающем у пациентов с острой де-компенсированной сердечной недостаточностью. Однако фармакологические особенности совместного влияния допамина и препаратов этого ряда на ионоре-гулирующую функцию почек при ХСН во многом остаются неясными.
Петлевые диуретики обладают мощным диуретическим и салуретическим действием, причиной которого является избирательное угнетение активности Na+-K+-2Cl-котранспортера, осуществляющего симпорт этих ионов через апикальные мембраны клеток ТВКПГ [2, 48]. Действие допамина на почки связано преимущественно с возбуждением почечных D1-дофаминовых рецепторов клеток проксимальных канальцев, которые опосредуют его ингибирующее влияние на ионные механизмы, обеспечивающие реабсорбцию натрия в этом сегменте нефрона. Исходя из этого, можно ожидать, что допамин, тормозящий транспорт ионов в проксимальном канальце, может усиливать диуретический и натрийуретический эффекты петлевых диуретиков благодаря увеличению доставки нереабсорбирован 67 ного натрия к месту действия этих препаратов в ТВКПГ.
Для уточнения характера фармакодинамического взаимодействия допамина и петлевых диуретиков в почках мы исследовали влияние допамина и его комбинации с фуросемидом на показатели ионорегулирующей функции почек крыс с ЭСН, вызванной длительным комбинированным действием на сердце избыточной физической нагрузки и больших доз адреномиметика фенилэфрина [6, 20]. С целью более точной оценки эффектов исследуемых лекарственных препаратов при ХСН мы первоначально изучили влияние допамина на показатели ионорегу-лирующей функции почек интактных крыс, а затем исследовали реакцию почек крыс на допамин и его сочетание с фуросемидом у животных с моделью сердечной недостаточности.
Введение допамина интактным крысам не оказывало заметного влияния на величину диуреза, но вызывало характерную натрийуретическую реакцию. Выделение натрия с мочой достоверно возросло с 37,4±6,60 до 62,6±6,95 мкмоль/4,5 ч/100 г (р 0,05), то-есть в 1,67 раза, и было связано в основном с угнетением в почках реабсорбции этого иона, так как экскреция креатинина с мочой, отражающая величину СКФ, при этом существенно не изменилась. Допамин не оказывал также достоверного влияния на выделение почками калия, но почти в 2 раза увеличивал к концу наблюдения отношение натрий/калий мочи, что подтверждает известные данные о преимущественном действии этого препарата на транспорт натрия в канальцах почек (таблица 3.10).
Предварительная оценка функционального состояния почек животных с моделью сердечной недостаточности показала, что у них формируется характерный для ХСН дефект реабсорбции натрия, который проявляется в замедлении его выведения из организма. Благодаря этому уровень экскреции натрия с мочой после 0,6% солевой нагрузки у крыс с ЭСН упал с исходных 37,4±6,60 до 18,2±4,48 мкмоль/4,5 ч/100 г (р 0,05), что составляет более 50% от уровня натрийуреза, отмеченного в контрольных опытах с интактным животными. У крыс с моделью сердечной недостаточности наблюдалось также достоверное уменьшение выделения с мочой креатинина, которое косвенно указывает на участие снижения СКФ в Таблица 3.10 - Влияние допамина и его комбинации с фуросемидом на показатели ионорегулирующей функции почек крыс с моделью сердечной недостаточности (M±m)
Отношение натрий/калий в моче 0,77±0,12 1,59±0,16 0,39±0,07 1,05±0,09 2,92±0,25 3,93±0,36 Примечание: - р 0,05 по сравнению с контролем, - р 0,05 по сравнению с результатами, полученными при введении крысам одного фуросемида (критерий Манна-Уитни); n – количество экспериментальных животных. СН – сердечная недостаточность. механизме задержки натрия в организме. Одновременно у таких животных по сравнению с интактными крысами отмечалась достаточно выраженная антика-лийуретическая реакция, которая сопровождалась уменьшением отношения натрий/калий мочи с 0,77±0,12 до 0,39±0,07 (р 0,05).
Дальнейшие эксперименты показали, что функциональный сдвиг, возникающий при действии допамина в почках крыс с ЭСН, принципиально не отличается от реакции почек интактных животных на этот препарат. Как и в контрольных опытах, не было отмечено достоверных изменений в величине диуреза и экскреции с мочой креатинина, свидетельствующее об отсутствии достаточно выраженных сдвигов в объеме клубочковой фильтрации. Выделение почками натрия в этих условиях достоверно выросло в 2,16 раза, но в абсолютном значении примерно соответствовало приросту экскреции этого иона почками, отмеченного в экспериментах на интактных крысах. Количество теряемого с мочой калия при этом практически не изменилось, в то время как отношение натрий калий мочи возросло с 0,39±0,07 до 1,05±0,09 (р 0,05).
Введение фуросемида животным с ЭСН вызывало ответную реакцию почек, характерную для петлевых диуретиков. Под влиянием этого препарата развивалась диуретическая реакция, которая сопровождалась значительным приростом натрийуреза, выделения креатинина и резким увеличением индекса натрий/калий мочи. После назначения фуросемида уровень потери натрия с мочой возрос с 18,2±4,48 до 130,5±14,8 мкмоль/4,5 ч/100 г (р 0,05), то-есть примерно в 7,17 раза по сравнению с данными контрольных экспериментов. Добавление к фуросемиду допамина существенно усиливало его диуретическое и натрийуретическое действие. Выделение почками натрия при совместном применении обоих препаратов возросло дополнительно еще в 1,46 раза по сравнению с величиной прироста на-трийуреза, наблюдавшегося после введения одного фуросемида. Поскольку при этом не было отмечено достоверных изменений в экскреции креатинина, можно полагать, что прирост натрийуреза, возникавшего при добавлении допамина к фу-росемиду, был обусловлен в основном дополнительным угнетением реабсорбции натрия в почечных канальцах. Потеря калия с мочой в этих условиях также воз 70 росла, но изменения в величине калийуреза не были достоверными. Отношение натрий/калий мочи при совместном применении допамина и фуросемида у крыс с ЭСН, также как и в опытах с одним допамином, выросло с 2,92±0,25 до 3,93±0,36 (р 0,05), что указывает на преимущественное увеличение экскреции почками натрия по сравнению с калием.
Таким образом, введение допамина крысам с ЭСН, вызванной совместным воздействием на сердце избыточной физической нагрузки и больших доз адрено-миметика фенилэфрина, не оказывает существенного влияния на величину диуреза и экскрецию почками калия, но вызывает выраженную натрийуретическую реакцию, которая сопровождается увеличением отношения натрий/калий мочи. Добавление дофаминомиметика к фуросемиду усиливает диуретический, натрийуре-тический и, в меньшей степени, калийуретический эффекты этого диуретика у животных с моделью сердечной недостаточности, способствуя дополнительному приросту величины индекса натрий/калий мочи.