Введение к работе
Актуальность исследования. К настоящему времени в многочисленных исследованиях представлен полифункциональный характер биологических эффектов регуляторных пептидов, которые контролируют практически все физиологические функции организма. Данное обстоятельство способствовало созданию на их основе целого ряда фармакологических препаратов (Шабанов П.Д., 2008; Королева С.В., 2012; Kolomin T., 2013). Одним из наиболее успешно реализованных проектов в данном направлении можно считать создание на основе синтетического аналога фрагмента АКТГ4-7 препарата семакс, который нашел широкое применение в клинике в качестве ноотропного и нейропротекторного средства (Королева С.Н., 2010; Манченко Д.М., 2010; Kolomin T., 2013). При этом отдельный интерес представляют экспериментальные данные об эффектах пептида в условиях стресса. В частности, семакс при хроническом введении предотвращал у крыс последствия непредсказуемого хронического стрессирования в виде повышенной тревожности, выраженности депрессивных компонентов поведения, снижения массы тела и увеличения относительной массы надпочечников (Яценко К.А., 2013). Также установлено, что пептид оказывал защитное противотромботическое действие в условиях многократного иммобилизационного стресса за счет повышения антикоагулянтной, суммарной и неферментативной фибринолитической активности, активности активатора плазминогена плазмы крови (Ляпина Л.А., 2008, 2010; Григорьева М.Е., 2010).
Известно, что стресс, являясь неспецифической адаптивной реакцией организма на действие различных раздражителей, с одной стороны, сопровождается системной перестройкой защитных механизмов, а с другой – может оказывать повреждающее действие на функциональные системы организма. Одним из важных механизмов стрессорного повреждения тканей является увеличение продукции реактивных оксигенных радикалов, что сопровождается пероксидацией липидов клеточных мембран (Sahin E., 2007).
При этом печень, которой принадлежит уникальная роль в регуляции постоянства внутренней среды организма, обладает высокой чувствительностью к действию различных раздражителей, в том числе и стресса. Важную роль в развитии стресс-индуцированных изменений в печени наряду с активацией процессов свободнорадикального окисления играют ишемия, гипоксия и нарушения процессов микроциркуляции (Fausto N., 1994; Arias I.M., 2009; Snchez-Valle V., 2012). Известно, что семакс в культуре ткани оказывает выраженное антиоксидантное, антигипоксическое, ангиопротекторное и нейротрофическое действие (Гусев Е.И., 2005; Пирутин С.К., 2007).
Учитывая вышеуказанную плейотропность эффектов препарата, а также особенности механизмов стрессорного повреждения печени, представлялось целесообразным изучение влияния семакса на структуру и функции печени при стрессорном воздействии.
Cтeпeнь рaзрaботанности тeмы. Семакс является синтетическим аналогом
фрагмента гормона АКТГ4-7, стабилизированным к действию экзо- и эндопептидаз
присоединением к С-концу последовательности аминокислот Pro-Gly-Pro и лишенным
гормональной активности (Пономарева-Степная М.А., 1984; Долотов О.В., 2004;
Левицкая Н.Г., 2008). Как и все регуляторные пептиды, данный препарат обладает
полифункциональными эффектами, среди которых отмечается антиастеническое,
антиамнестическое, антигипоксическое, анксиолитическое, ноотропное и нейротрофическое действие (Ашмарин И.П., 1997; Гривенников И.А., 1999; Золотарев Ю.А., 2006; Романова Г.А., 2006; Соколова М.Г., 2014; Долотов О.В., 2015), что обусловливает его широкое использование как нейропротектора. Также установлено, что препарат может обладать как стресс-лимитирующим (Umriukhin P.E., 2001; Виленский Д.А., 2007; Соловьев В.Б., 2011; Яценко К.А., 2013), так и стресс-потенцирующим воздействием (Иванова Д.М., 2006).
Выявлено кардиопротекторное (Голубева А.В., 2006; Гаврилова С.А., 2008; Бердалин А.Б., 2011, 2012), антигемолитическое (Голубева М.Г., 2010, 2013), антикоагулянтное (Григорьева М.Е., 2010; Ляпина Л.А., 2008, 2010), гастропротекторное (Жуйкова С.Е., 2000; Бакаева З.В., 2009; Новицкий В. В., 2009) действие семакса. Однако изучения влияния препарата на функции гепатоцитов и структуру печени в условиях стресса до настоящего времени не проводилось.
Диссертационное исследование (№ государственной регистрации 01201254916) выполнено согласно основному плану научно-исследовательской работы Курского государственного медицинского университета.
Цель исследования – изучить влияние АКТГ4-7-ПГП (семакса) на
морфофункциональное состояние гепатоцитов при иммобилизационном и эмоционально-болевом стрессах.
Задачи исследования
1. Изучить влияние введения АКТГ4-7-ПГП (семакса) на изменение в сыворотке
крови и гомогенате печени биохимических показателей функционального состояния
гепатоцитов в условиях острого и хронического эмоционально-болевого стресса.
2. Исследовать морфологические изменения печени после введения семакса в
условиях острого и хронического эмоционально-болевого стресса.
3. Изучить влияние введения семакса на изменение в сыворотке крови и гомогенате
печени биохимических показателей функционального состояния гепатоцитов в условиях
острого и хронического иммобилизационного стресса.
4. Исследовать морфологические изменения печени после введения семакса в
условиях острого и хронического иммобилизационного стресса.
5. Выявить корреляционные взаимосвязи показателей функционального состояния
печени и ее морфологических изменений после введения семакса в условиях различных
видов стрессорного воздействия.
Научная новизна. В работе впервые проведено комплексное исследование влияния АКТГ4-7-ПГП (семакса) на механизмы перекисного окисления и антиоксидантной защиты в гепатоцитах, их протеинсинтетическую функцию, цитолитические и репаративно-восстановительные процессы. Установлено, что выраженность и направленность эффектов пептида зависят от величины используемой дозы, вида стрессорного воздействия и его продолжительности.
Впервые определены дозы семакса, оказывающие наиболее выраженное влияние на морфофункциональное состояние гепатоцитов в условиях иммобилизационного и эмоционально-болевого стресса.
Впервые с использованием корреляционного анализа изучено влияние семакса на взаимосвязи показателей морфофункционального состояния гепатоцитов в условиях различных видов стрессорного воздействия.
Практическая значимость работы. Экспериментально показано влияние
АКТГ4-7-ПГП (семакса) на морфофункциональное состояние гепатоцитов в условиях стресса, которое следует учитывать при использовании семакса в клинической практике, разработке патогенетически обоснованных методов коррекции стресс-индуцированных патологических сдвигов в печени, а также при разработке фармакологических препаратов на основе пептидов семейства меланокортинов. На основании результатов исследования получен патент «Применение пептида АКТГ(4-7)-ПГП для гепатопротекторного воздействия» (патент на изобретение № 2528741 от 20.09.14 г.).
Полученные данные расширяют существующие представления о роли регуляторных пептидов в организме, полифункциональном характере их биологических эффектов и плейотропности действия фармакологических препаратов на их основе.
Мeтодология и мeтоды иccлeдовaния. Мeтодология иccлeдовaния состояла в изучении эффектов внутрибрюшинного введения АКТГ4-7-ПГП (семакса) в условиях эмоционально-болевого и иммобилизационного стресса различной продолжительности на биохимические (аланинаминотрасфераза (АлАТ), аспартатаминотрансфераза (АсАТ), общий
белок, мочевина, щелочная фосфатаза (ЩФ), малоновый диальдегид (МДА), общая антиокислительная активность (ОАА), супероксиддисмутаза (СОД), каталаза) и морфологические (число многоядерных (МЯ) и одноядерных (ОЯ), одноядрышковых (ОЯд) и многоядрышковых (МЯд) гепатоцитов перипортальных и центролобулярных зон печеночных долек) показатели, характеризующие состояние печени.
Cтeпeнь доcтовeрноcти и aпробaция мaтeриaлов иccлeдовaния. Cтeпeнь
доcтовeрноcти опрeдeляeтcя доcтaточным чиcлом наблюдений (216 самцов крыc Виcтaр),
рандомизированным формированием интактных, контрольных и экспериментальных групп,
общепринятыми методами оценки активности аминотрансфераз, концентрации
сывороточного белка, мочевины и ЩФ, активности антиоксидантных ферментов и концентрации МДА, общепринятыми методиками получения гистологических препаратов и их морфометрической оценки, а также выбором и применением методов cтaтиcтичecкой обрaботки данных согласно типу их распределения.
Основные положения, выносимые на защиту
1. АКТГ4-7-ПГП (семакс) оказывает существенное влияние на морфофункциональное
состояние гепатоцитов при различных видах стресса за счет влияния на процессы
перекисного окисления и механизмы антиоксидантной защиты в гепатоцитах, их
протеинсинтетическую функцию, цитолитические и репаративно-восстановительные
процессы.
2. Выраженность и направленность установленных эффектов семакса зависят от
величины используемой дозы, вида стрессорного воздействия и его продолжительности.
3. Изменение показателей морфофункционального состояния гепатоцитов при
введении семакса стрессированным животным сопровождается значительными изменениями
корреляционных взаимосвязей, изначально вызванных стрессорным воздействием.
4. Установленное влияние семакса на морфофункциональное состояние гепатоцитов
имеет преимущественно адаптогенный, стресс-лимитирующий и гепатопротекторный
характер.
Aпробaция и публикaция мaтeриaлов иccлeдовaния. Основные положения диссертации представлены и обсуждены на итоговой научной конференции КГМУ «Университетская наука: Взгляд в будущее» (Курск, 2013), VII Международной научной конференции молодых ученых-медиков (Курск, 2013), VI Международной дистанционной научной конференции КГМУ (Курск, 2014), международной научно-практической конференции «Интегративные процессы в образовании и медицине» (Курск, 2014), III Всероссийской научно-практической конференции студентов и молодых ученых с международным участием «Актуальные проблемы науки XXI века» (Смоленск, 2015),
Межрегиональной научно-практической конференции молодых ученых и студентов с международным участием (Кемерово, 2015), X Юбилейной Международной научно-практической конференции молодых ученых-медиков (Курск, 2016), 81-й Всероссийской научной конференции студентов и молодых ученых с международным участием «Молодежная наука и современность» (Курск, 2016), научно-практической конференции «Павловские чтения» (Курск, 2016), XII Международной (XXI Всероссийской) Пироговской научной медицинской конференции студентов и молодых ученых (Москва, 2017), IV Международной научно-практической конференции студентов и молодых ученых «Наука и медицина: Современный взгляд молодежи» (Алматы, 2017).
Aпробaция диcceртaции состоялась на совместной научной конференции сотрудников кафедр общей гигиены, патофизиологии, фармакологии, клинической фармакологии, нормальной физиологии, судебной медицины, гистологии, эмбриологии, цитологии, биологической химии, патологической анатомии, спортивной медицины и лечебной физкультуры, акушерства и гинекологии ФПО, инфекционных болезней и эпидемиологии, ФГБОУ ВО КГМУ Минздрава России.
Внедрение полученных результатов. Материалы диссертации используются в
лекционных курсах кафедр фармакологии и нормальной физиологии Курского
государственного медицинского университета, кафедры фармакологии Медицинского
института Белгородского государственного национального исследовательского
университета, в работе Института молекулярной генетики Российской академии наук.
Публикации. По материалам диссертации в центральной и региональной печати опубликовано 16 работ, включая 6 – в изданиях, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки Российской Федерации (4 из них – в журналах, индексируемых в базах Web of Science и Scopus), 1 – патент на изобретение. В публикациях содержится полный объем информации по теме диссертации.
Личный вклад автора. Личный вклaд aвторa оcущecтвлялcя нa вceх этaпaх рaботы в формe плaнировaния экcпeримeнтов (85%), их нeпоcрeдcтвeнного выполнeния (95%), обрaботки получeнных рeзультaтов (100%), обcуждeния рeзультaтов (95%), нaпиcaния cтaтeй и тeзиcов (85%), нaпиcaния диcceртaции и aвторeфeрeтa (95%).
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора данных литературы, описания материалов и методов исследования, изложения собственных материалов исследования, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка сокращений и списка литературы, включающего 266 источников, в том числе 128 отечественных и 138 зарубежных. Диссертация изложена на 178 страницах машинописного текста, содержит таблиц – 28, рисунков – 43.