Участие прилежащего ядра в механизмах безусловного и условного подкрепления аддиктивных веществ Лашкина Мария Владимировна

Содержание к диссертации

Введение

Глава 1. Нейробиологические механизмы систем награды и наказания в головном мозге при активации прилежащего ядра (обзор литературы) 13

1.1. Нейробиология положительных и отрицательных подкрепляющих систем мозга как основа аддиктивного влечения 13

1.2. Участие прилежащего ядра в механизме положительного подкрепления 17

1.3. Участие прилежащего ядра в механизме отрицательного подкрепления 29

1.4. Прилежащее ядро как интегрирующий компонент положительных и отрицательных стимулов эмоциональной природы 34

Глава 2. Материалы и методы исследования 43

2.1. Выбор животных и их содержание 43

2.2. Вживление электродов и канюль в структуры мозга 43

2.3. Методы самораздражения мозга у крыс 46

2.4. Фармакологические вещества, используемые для анализа эмоциональных форм поведения 49

2.5. Условная реакция предпочтения места (УРПМ) 49

2.6. Статистическая обработка полученных материалов 51

Глава 3. Результаты собственных исследований 52

3.1. Нейромедиаторные и гормональные механизмы прилежащего ядра в реализации подкрепляющих эффектов наркоманов у крыс 52

3.2. Участие прилежащего ядра в механизмах условного подкрепления у крыс 60

3.3. Нейрохимические механизмы прилежащего ядра, участвующие в воспроизведение условной реакции предпочтения места психотропных веществ у крыс 67

Глава 4. Обсуждение полученных результатов 74

Выводы 84

Научно-практические рекомендации .86

Литература

• Участие прилежащего ядра в механизме положительного подкрепления
• Вживление электродов и канюль в структуры мозга
• Статистическая обработка полученных материалов
• Нейрохимические механизмы прилежащего ядра, участвующие в воспроизведение условной реакции предпочтения места психотропных веществ у крыс

Введение к работе

Актуальность исследования. Представления о механизмах подкрепляющего действия наркогенов (опиоидов и неопиоидов) основываются на существовании в головном мозге системы специализированных эмоциогенных структур, прежде всего, структур медиального переднемозгового пучка, включая гипоталамус и структуры расширенной миндалины, которые опосредуют их действие на эффекторные органы (Шабанов П.Д., 2008; Шабанов П.Д. и др, 2014). Прилежащее ядро (n.accumbens), точнее ее медиальная часть (shell), традиционно рассматривалось как одна из ключевых структур в механизмах подкрепления, в том числе и активируемых различными наркогенами (Koob G.F., 2009, 2012). Долгое время складывалось впечатление, что это основной механизм, посредством которого реализуются подкрепляющие эффекты опиатов (морфин, героин) и психостимуляторов (кокаин, амфетамин), активирующих дофаминергическую систему мозга (Hormes D., 2010). Однако выделение системы расширенной миндалины (extended amygdala), куда вошли ядро ложа конечной полоски, центральное ядро миндалины, медиальная часть (shell) прилежащего ядра и безымянная субстанция, как структурно-функциональной системы обеспечения эмоционально-мотивационных эффектов разных наркогенов, заставило пересмотреть главенствующую роль прилежащего ядра в механизмах подкрепления. Следует напомнить, что структуры системы расширенной миндалины состоят из стриатоподобных ГАМК-ергических клеток и содержат большое количество кортиколиберина (кортикотропинрилизинг гормона; КРГ). Она рассматривается как основа экстрагипоталамической системы КРГ, влияя на стресс-зависимое поведение, инициируя эмоционально-мотивированные ответы и опосредуя анксиогенные эффекты КРГ (Shabanov P.D., 2008; Koob G.F., 2009; Шабанов П.Д. и др., 2014). С этих позиций прилежащее ядро, иннерви-руемое дофаминергическими терминалями, идущими из вентральной области покрышки, может рассматриваться как регулятор, прежде всего, положительных эффектов (потребления пищи, воды, самораздражения мозга, самовведения веществ, иного действия наркогенов). С другой стороны, как часть экстрагипо-таламической системы КРГ, прилежащее ядро регулирует главным образом негативные эмоциональные реакции.

С целью уточнения значения прилежащего ядра в механизмах первичного (безусловного) и вторичного (условного) подкрепления, активируемых разными психотропными веществами, в настоящей работе был проведен нейрофар-макологический анализ этих эффектов посредством блокады рецепторов дофамина, ГАМК, опиодов и КРГ в медиальной части прилежащего ядра и анализом реакции самостимуляции и условной реакции предпочтения места. Тем самым, мы попытались вскрыть не только значение самого прилежащего ядра в эмо-циогенных эффектах психотропных средств, но и проанализировать механизмы сопряжения безусловных и условноподкрепляющих свойств наркогенов при реализации эмоциогенных реакций.

Степень разработанности темы. Традиционно прилежащее ядро, иннер-вируемое дофаминергическими терминалями, рассматривалось как регулятор, прежде всего, положительных эффектов подкрепления (Koob G.F., 2009, 2012). В то же время работ, рассматривающих данную структуру как часть экстраги-поталамической системы КРГ, и регуляции главным образом негативных эмоциональных реакций, явно недостаточно, да они и не укладываются в общую концепцию ключевой роли прилежащего ядра в положительном подкреплении, особенно при введении психостимуляторов и опиатов. Кроме того, ощущается недостаток нейрофармакологического анализа центральных механизмов сопряжения безусловных и условноподкрепляющих свойств наркогенов при реализации эмоциогенных реакций.

Цель исследования: изучить значение прилежащего ядра в механизмах безусловного и условного подкрепления для реализации механизмов подкрепления и зависимости от наркогенов у крыс.

Задачи исследования:

1. Исследовать участие прилежащего ядра в структурно-функциональной организации безусловного (реакция самостимуляции) и условного (реакция предпочтения места) подкрепления у крыс.

2. Исследовать реакцию самостимуляции латерального гипоталамуса при блокаде рецепторов КРГ, дофамина, ГАМК и опиоидов в прилежащем ядре у крыс.

3. Исследовать влияние блокады рецепторов дофамина, ГАМК и опиои-дов в прилежащем ядре на выработку и экспрессию условной реакции предпочтения места (УРПМ) у крыс.

4. Исследовать реакцию самостимуляции латерального гипоталамуса и условную реакцию предпочтения места при функциональном выключении входящих ионных токов Na⁺ в нейронах прилежащего ядра у крыс.

5. Провести фармакологический анализ с участием психоактивных средств стимулирующей и гипноседативной направленности для выяснения значения прилежащего ядра в реализации подкрепляющих эффектов наркогенов (фенамин, фентанил, этаминал-натрий, лей-энкефалин).

Научная новизна. В результате проведенных исследований получены новые данные об общих механизмах формирования зависимости от психоактивных средств в эксперименте на основе изучения и сравнения наркогенных свойств психостимуляторов (фенамин), препаратов опийной группы (фента-нил), гипноседативных средств (этаминал-натрий) и опиоидных нейропептидов (лей-энкефалин). Функциональное выключение прилежащего ядра лидокаином препятствовало проявлению первичных подкрепляющих свойств (самостимуляция) наркогенов стимулирующей и гипноседативной направленности (фенамин, фентанил, этаминал-натрий, лей-энкефалин) и проявлению (экспрессии) вторичных подкрепляющих свойств (УРПМ) наркогенов преимущественно стимулирующей направленности (фенамин). В то же время выключение струк-

туры при формировании условного подкрепления в большей степени сказывалось на действии опиатов и опиоидов (фентанил, лей-энкефалин). Показано, что блокада D2 рецепторов прилежащего ядра сульпиридом препятствовало проявлению подкрепляющих свойств (самостимуляция, УРПМ) наркогенов преимущественно стимулирующей направленности (фенамин). При этом блокада D1 рецепторов прилежащего ядра SCH23390 препятствовало проявлению первичных и вторичных подкрепляюших свойств преимущественно опиатов и опиои-дов (фентанил, лей-энкефалин). Показано, что блокада ГАМК-А рецепторов прилежащего ядра бикукуллином препятствовало проявлению первичных подкрепляющих свойств (самостимуляция) наркогенов стимулирующей и гипносе-дативной направленности. В то же время блокада ГАМК-А рецепторов прилежащего ядра бикукуллином препятствовало проявлению вторичных подкрепляющих свойств (УРПМ) наркогенов стимулирующей и гипноседативной направленности (фенамин, этаминал-натрий), не влияя на эффекты опиатов и опиоидов (фентанил и лей-энкефалин). Включение отдельных нейрохимических механизмов прилежащего ядра (дофамина, ГАМК и опиоидов), реализующих подкрепляющие эффекты наркогенов, зависит от их направленного действия на процессы безусловного подкрепления (самостимуляция), формирования или воспроизведения условного подкрепления (УРПМ).

Теоретическая и практическая значимость. Полученные результаты позволяют обосновать и адекватно оценить подкрепляющие (наркогенные) свойства синтетических наркогенов и нейропептидов в экспериментальных условиях с помощью относительно простых поведенческих тестов, основанных на изучении безусловного подкрепления (самостимуляция латерального гипоталамуса) и условного (УРПМ) у крыс. Функциональное выключение прилежащего ядра независимо от действующих нейрохимических звеньев в наибольшей степени препятствует проявлению подкрепляющих свойств наркогенов стимулирующей и гипноседативной направленности. Блокада ГАМК рецепторов, рецепторов дофамина, опиоидных рецепторов, а также рецепторов КРГ в прилежащем ядре угнетают реакцию самостимуляции латерального гипоталамуса и УРПМ наркогенов у крыс. Доказано, что первичные и вторичные подкрепляющие эффекты разных наркогенов (психостимуляторов, препаратов опийной группы, гипноседативных средств и нейропептидов) имеют свои особенности включения эмоциогеннных и мнестических компонентов обшего интегративно-го механизма подкрепления и опосредуются центральными механизмами стресса, связанными с участием рецепторов КРГ, дофамина и ГАМК. Эти эффекты можно снизить путем блокады соответствующих рецепторов их антагонистами. Полученные данные открывают перспективу поиска средств, обладающих антагонистической активностью в отношении рецепторов дофамина, опиоидов, ГАМК и КРГ для коррекции алкогольной и наркотической зависимости.

Методология и методы исследования. Методология исследования состояла в изучении у крыс подкрепляюших эффектов наркогенов (медиаторных

веществ и пептидов) при блокаде рецепторов дофамина, опиоидов, ГАМК и КРГ с целью поиска подходов и средств для коррекции алкогольной и наркотической зависимости. В связи с этим предварительно в мозг крысам вживляли электроды для стимуляции и микроканюли для введения веществ в хроническом эксперименте. В дальнешем изучали подкрепляюшие механизмы психотропных средств различного механизма действия на реализацию реакции самостимуляции латерального гипоталамуса при активации или торможении прилежащего ядра головного мозга. Исследования выполнены с соблюдением всех правил доказательной медицины.

Основные положения, выносимые на защиту:

6. Прилежащее ядро занимает одно из центральных мест в структурно-функциональной организации безусловного (реакция самостимуляции) и условного (реакция предпочтения места) подкрепления у крыс.

7. Функциональное выключение прилежащего ядра лидокаином препятствует проявлению первичных подкрепляющих свойств (самостимуляция) наркогенов стимулирующей и гипноседативной направленности (фенамин, фента-нил, этаминал-натрий, лей-энкефалин). В то же время выключение структуры при формировании условного подкрепления в большей степени сказывается на блокаде действия опиатов и опиоидов (фентанил, лей-энкефалин).

8. Блокада D2 рецепторов прилежащего ядра сульпиридом препятствует проявлению подкрепляющих свойств (самостимуляция, УРПМ) наркогенов преимущественно стимулирующей направленности (фенамин). При этом блокада D1 рецепторов прилежащего ядра SCH23390 препятствовует проявлению первичных и вторичных подкрепляюших свойств преимущественно опиатов и опиоидов (фентанил, лей-энкефалин).

9. Блокада ГАМК-А рецепторов прилежащего ядра бикукуллином пре-пятствовует проявлению первичных подкрепляющих свойств (самостимуляция) наркогенов стимулирующей и гипноседативной направленности. В то же время блокада ГАМК-А рецепторов прилежащего ядра бикукуллином препятствует проявлению вторичных подкрепляющих свойств (УРПМ) наркогенов, не влияя на эффекты опиатов и опиоидов (фентанил и лей-энкефалин).

Степень достоверности и апробация материалов исследования Степень достоверности определяется большим количеством экспериментальных животных (352 крысы), рандомизацией и формированием групп сравнения и активного контроля, адекватными поведенческими, токсикологическими, морфологическими, биохимическими и фармакологическими методами исследования, длительными сроками наблюдения и корректными методами статистической обработки.

Реализация результатов работы. Материалы исследования используются в лекционном курсе кафедры фармакологии и кафедры нормальной физиологии Военно-медицинской академии имени С.М.Кирова, кафедры психиатрии с курсом наркологии Северо-Западного государственного медицинского университета им. И.И. Мечникова, кафедры нервных болезней и психиатрии и ка-

федры специализированной терапии Института медицинского образования Новгородского государственного университета им. Ярослава Мудрого. Работа выполнена в соответствии с плановыми научно-исследовательскими разработками Военно-медицинской академии им. С.М.Кирова. Материал диссертации вошел в грантовые разработки Российского фонда фундаментальных исследований РАН (проект №13-04-00186а).

Апробация результатов. Материалы, вошедшие в диссертацию, доложены на 5-й международной конференции «Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам» (Москва, 2010), 23-м международном конгрессе Европейского общества нейропсихофармакологии (Амстердам, 2010), международной конференции «Новые технологии в медицине и экспериментальной биологии» (Рио-де-Жанейро, 2011), Всероссийской научной конференции «Экспериментальная и клиническая фармакология: научные чтения», посвященной 90-летию со дня рождения профессора А.А. Никулина (Рязань, 2013), Всероссийской научной конференции с международным участием «Фармакологическая нейропротекция», посвященная 90-летию Отдела ней-рофармакологии им. С.В. Аничкова Института экспериментальной медицины СЗО РАМН Санкт-Петербург (Санкт-Петербург, 2013), 26-м международном конгрессе Европейского общества нейропсихофармакологии (ECNP, Барселона, 2013), научных заседаниях отдела нейрофармакологии им. С.В. Аничкова ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины» (2014-2015). По теме диссертации опубликованы 16 научных работ, в том числе 7 работ в журналах, рекомендованных ВАК.

Работа рассмотрена и одобрена комитетом по этике Военно-медицинской академии им. С.М.Кирова МО РФ.

Апробация диссертации прошла на совместном заседании кафедр фармакологии и нормальной физиологии Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова МО РФ.

Личный вклад автора. Осуществлялся на всех этапах работы и состоял

в планировании экспериментов, их непосредственном выполнении, обработке полученных результатов, обсуждении результатов, написании статей и тезисов, написании диссертации и автореферета. Участие автора в выполнении, сборе и анализе – 95-97%, статистической обработке – 95-100%, в написании статей и тезисов – 85-90%, написании диссертации и автореферата – 90-95%.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения,

главы обзора литературы, материалов и методов исследования, двух глав результатов собственных исследований, обсуждения результатов, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы. Работа изложена на 102 страницах машинописного текста, иллюстрирована 5 рисунками и 15 таблицами. Библиографический указатель содержит 173 наименований, в том числе 36 отечественных и 137 иностранных.

Участие прилежащего ядра в механизме положительного подкрепления

Как известно, у нокаутных мышей, лишенных D2-подобных рецепторов дофамина, обычно снижена чувствительность к подкрепляющим эффектам кокаина (Welter M. et al., 2007). У этих животных также уменьшаются подкрепляющие свойства морфина, по-видимому, в результате снижения способности препарата стимулировать дофамин через механизмы вентральной области покрышки и латерального гипоталамуса (Leone P. et al., 1991; Johnson S.W., R.A. North, 1992; Maldonado R. et al., 1997; Elmer G.I. et al., 2005). По-видимому, потеря D2-подобных рецепторов в NAc снижает способность дофамина тормозить непрямой путь, необходимый для реализации механизма подкрепления. В частности, было показано, что у лиц, принимающих наркотики, в NAc наблюдается снижение связывания с D2-подобными рецепторами дофамина. Это позволяют предположить, что D2-рецепторы дофамина играют важную роль в механизмах подкрепления (Volkow N.D. et al., 2007).

Успехи в молекулярной биологии также позволили обнаруживать тонкие нейроадаптивные процессы, разворачивающиеся в определенных областях мозга после принятия наркотика. Эти изменения заключаются главным образом в экспрессии генов рецепторов глутамата AMPA-типа, которые экспрессируются очень широко в головном мозге и состоят из различных комбинаций субъединиц рецептора GluR1-4 (Hollmann M. et al., 1991; Malinow R., Malenka R.C., 2002). Наркотики могут вызвать изменения экспрессии GluR в NAc. Например, многократное и периодическое введение кокаина повышает экспрессию GluR1 в NAc (Churchill L. et al., 1999). Исследования, в которых использовались вирусные векторы для селективного повышения GluR1 в NAc, показали, что кокаин начинал вызывать условную реакцию избегания места. В тоже время повышенный уровень GluR2 в NAc, наоборот, увеличивает подкрепляющие свойства кокаина (Kelz M.B. et al., 1999). Возможные объяснения этих наблюдений, скорее всего, связаны с внутриклеточным Ca2+ и его влиянием на нейрональную активность и внутриклеточную передачу сигналов. Повышенная экспрессия GluR1 благоприятствует формированию GluR1-гомомерных (или GluR1-GluR3 гетеромерных) AMPA рецепторов, которые проницаемы для Ca2+ (Hollman M. et al., 1991; Malinow R., Malenka R.C., 2002). Напротив, активация GluR2 рецепторов предотвращает входящий ток Ca2+.

Таким образом, увеличенная экспрессия GluR2 благоприятствует формированию GluR2-содержащих непроницаемых для Ca2+ AMPA рецепторов и сокращает число Ca2+-проницаемых AMPA рецепторов. Следовательно, GluR2-содержащие AMPA рецепторы обладают свойствами, которые делают их функционально отличными от рецепторов, не имеющих данную субъединицу, особенно в отношении их взаимодействия с Ca2+.

Если ранние исследования в этом направлении включали в большей степени тесты условного предпочтения места, требующие многократных введений наркотика и, по-видимому, отражающие процессы нейроадаптации, то в более поздних исследованиях изучали влияние изменения экспрессии GluR, моделирующего приобретенную экспрессию при многократном воздействии препарата, на внутримозговую самостимуляцию (Wise R.A., 1996). Повышенная экспрессия GluR1 в NAc увеличивает пороги самостимуляции, тогда как повышенный уровень GluR2 их снижает (Todtenkopf M.S. et al., 2006). Тот факт, что эффект GluR2 на реакцию самостимуляции подобен таковому после введения наркотиков (Wise R.A., 1996), позволяет предположить, что это отражает увеличение подкрепляющего эффекта стимуляции. Напротив, эффект GluR1 подобен вызываемому депрессантами, включая отмену препарата (Mark G.P. et al., 1992), и введение -опиодных агонистов (Pfeiffer A. et al., 1986; Wadenberg M.L., 2003; Todtenkopf M.S. et al., 2004; Carlzon W.A. et al., 2006). Это позволяет допустить, что в данном случае наблюдается снижение подкрепляющих свойств самостимуляции. Данные наблюдения указывают на то, что повышенная экспрессия GluR1 и GluR2 в NAc заметно различаются по их действию на поведение. Более того, они подтверждают более ранние наблюдения, согласно которым повышенный уровень экспрессии GluR1 и GluR2 в NAc вызывает противоположные эффекты в исследованиях условного предпочтения места кокаина (Kelz M.B. et al., 1999). Следовательно, вовлечение тока Ca2+ в пределах NAc снижает положительное подкрепление и увеличивает отвращение. Изменения экспрессии рецепторов Glu и субъединиц AMPA рецепторов в NAc, вероятно, инициируют физиологические и молекулярные реакции, которые, по-видимому, взаимодействуют, изменяя уровень мотивации.

Электрофизиологические исследования также подтверждают положение о том, что снижение импульсной активности нейронов в NAc может быть связано с механизмом подкрепления. Во-первых, подкрепляющие стимулы вызывают торможение NAc, при этом увеличиваются их подкрепляющие свойства. Во-вторых, торможение ГАМК-ергических срединных шипиковых нейронов NAc может растормаживать структуры, расположенные каудально, такие как вентральный паллидум (бледный шар) и связанные с положительными подкрепляющими свойствами стимулов структуры.

В настоящее время проводятся исследования по изучению активности одиночного нейрона NAc в ответ на подведение наркогенов на грызунах. В этих исследованиях было показано, что наиболее часто наблюдается именно торможение (а не возбуждение) импульсной активности нейронов NAc. Торможение импульсной активности нейронов NAc наблюдаются во время самовведения ряда подкрепляющих агентов, включая кокаин (Peoples L.L., West M.O., 1996), героин (Chang J.Y. et al., 1997), этанол (Janak P.H. et al., 1999), сахарозу (Nicola S.M. et al., 2004), пищу (Carelli R.M. et al., 2000) и электростимуляцию медиального пучка переднего мозга (Cheer et al., 2005). Эффект торможения наблюдался не только на модели самовведения, инструментального рефлекса, но и у животных в свободном поведении (Roitman M.F. etal., 2005; Wheeler R.A. et al., 2008). Эти исследования указывают на то, что тормозное действие наркогенов в меньшей степени связано с двигательной реакцией, а непосредственно относится к подкрепляющему или мотивационному эффекту. В тоже время, S.A. Taha и H.L. Fields (2005) показали, что у нейронов NAc, которые реагировали на вкусовое предпочтение в тесте различения раствора сахарозы, наоборот, импульсная активность увеличивалась. Это несоответствие с представленными данными о типичном характере активности NAc говорит, прежде всего, о необходимости стандартизации условий регистрации импульсной активности нейронов головного мозга (биохимического состава клеток, регистрируемых in vivo). Поскольку эти методики становятся доступными, наиболее вероятно, что в дальнейшем будут выявлены новые функциональные подклассы нейронов NAc и может быть построена более детализированная модель функции NAc.

Вживление электродов и канюль в структуры мозга

Для фармакологического анализа использовали психомоторный стимулятор фенамин (1 мг/кг), синтетический опиатный аналгетик фентанил (0,1 мг/кг), барбитурат этаминал-натрий (5 мг/кг), опиоид лей-энкефалин (1 мг/кг), которые вводили внутрибрюшинно за 30 мин до изучения самостимуляции (после определения фоновых ее значений). Бикукуллин (антагонист ГАМКА-рецепторов), лидокаин (блокатор входящих Na+ каналов), SCH23390 (антагонист D1 рецепторов дофамина), сульпирид (антагонист D2 рецепторов дофамина) и асстрессин (неизбирательный антагонист КРГ), все по 1 мкг (Sigma, США) вводили внутриструктурно в прилежащее ядро через вживленную в эту мозговую структуру канюлю (Лебедев А.А., Шабанов П.Д., 2014). Субстанции веществ растворяли в дистиллированной воде и вводили в объеме 1 мкл с помощью микроинъектора СМА-100 (Швеция) в течение 30 с за 10-15 мин до тестирования после определения исходных значений самораздражения латерального гипоталамуса. Учитывая хронический характер эксперимента (продолжительность опыта в среднем 30-40 дней для каждой крысы), фармакологические агенты вводили через канюли каждому животному повторно с интервалом не менее 5 дней между введениями таким образом, что одна прооперированная крыса получала одно и то же фармакологическое вещество 3-4 раза. Каждый раз перед введением вещества определяли фоновые значения реакции самостимуляции, которые квалифицировали как контрольные значения для данного опыта. В целом, учитывали общее число опытов (их было 10-12 для каждого вещества), а не число исследованных животных. Такой принцип введения веществ повсеместно распространен для подобного рода исследований (Елисеева А.П. 2005; Шабанов П.Д., Лебедев А.А., 2011, 2014).

Условную реакцию предпочтения места (УРПМ) вырабатывали в установке размером 60х30х30 см, состоящей из двух одинаковых квадратных камер (отсеков), соединенных дверцей размером 10х10 см. Внутренняя поверхность камер была окрашена в белый цвет. Текстура пола отличалась: в одной камере она представляла мелкую решетку, в другой – гладкий темно-коричневый пол. Выработку УРПМ производили в течение 8 дней. В 1-й день крысу помешали на 10 мин в установку при открытой дверце для ознакомления и определения исходного предпочтения одного из отсеков установки. Начиная со 2-го дня опыта, каждой крысе вводили либо один из фармакологических препаратов (на 2-й, 4-й и 6-й дни), либо физиологический раствор (на 3-й, 5-й и 7-й дни) и сразу же помещали на 60 мин в установку: в непредпочитаемый отсек в случае введения наркогена и в предпочитаемый отсек в случае введения физиологического раствора. Дверца между отсеками установки в этом случае была закрыта. На 8-й день опыта дверцу открывали и помещали животное на 10 мин в непредпочитаемый отсек без введения препарата. Регистрировали время нахождения в каждом из отсеков и число переходов из отсека в отсек. Увеличение времени в исходно непредпочитаемом отсеке камеры трактовали как условное предпочтение места (основной критерий – увеличение времени пребывания в непредпочитаемом отсеке выше 50% от всей экспозиции). Дополнительным критерием предпочтения служило общее увеличение числа переходов из отсека в отсек.

По окончании всех опытов производили морфологический контроль локализации кончиков канюль на серии фронтальных срезов мозга, которые окрашивали по методу Ниссля.

Для фармакологического анализа использовали психомоторный стимулятор фенамин (1 мг/кг), синтетический опиатный аналгетик фентанил (0,1 мг/кг), барбитурат этаминал-натрий (5 мг/кг), опиоид лей-энкефалин (0,1 мг/кг), которые вводили внутрибрюшинно за 30 мин до изучения самостимуляции (после определения фоновых ее значений). Бикукуллин (антагонист ГАМКА-рецепторов), лидокаин (блокатор входящих Na+ каналов), SCH23390 (антагонист D1 рецепторов дофамина), сулпирид (антагонист D2 рецепторов дофамина) и налоксон (избирательный антагонист опиоидных рецепторов), все по 1 мкг (Sigma, США) вводили внутриструктурно в прилежащее ядро через вживленную в эту мозговую структуру канюлю (Лебедев А.А. и др., 2013). Субстанции веществ растворяли в дистиллированной воде и вводили в объеме 1 мкл с помощью микроинъектора СМА-100 (Швеция) в течение 30 с за 3-5 мин до введения наркогена. Каждую крысу обучали УРПМ один раз, то есть она получали 3 внутримозговые инъекции (блокатора рецепторов или физиологического раствора) и 6 внутрибрюшинных инъекций (3 наркогена + 3 физиологического раствора).

Статистическая обработка полученных материалов

Если представить, как прилежащее ядро регулирует подкрепление, то схематически можно придти к следующему (Carlezon W.A., 2009) Нейроны прилежащего ядра тонически угнетают процессы, связанные с подкреплением (наградой). При обычных условиях существует баланс между кортикальными (медиальная префронтальная кора, миндалина) возбуждающими влияниями, опосредуемыми глутаматом через АМРА- и NMDA-рецепторы, и тормозными влияниями среднего мозга (вентральная область покрышки), опосредуемыми дофамином через D2-рецепторы. Прилежащее ядро обеспечивает сравнительно низкий базальный уровень нейрональной активности, при этом деполяризационный вход Са2+ через NMDA-рецепторы и кальциевые каналы существенно не меняют экспрессию генов. Деполяризация нейронов прилежащего ядра, содержащих D2-рецепторы дофамина и опиоидные (энкефалиновые) рецепторы, тормозит ниже лежащие области мозга, участвующие в подкреплении (то есть вентральный паллидум) и обусловливающие аверсивные реакции. Это также ведет к повышению входа Са2+ в клетки, что может запускать процесс нейроадаптации (то есть активацию цАМФ-зависимых внутриклеточных белков, например CREB, повышение экспрессии GluR1-рецепторов) или запускать поисковое поведение (например, поиск пищи). С этих позиций становится понятным, почему лидокаин, блокирующий входящие Na+ каналы, повышает самостимуляцию латерального гипоталамуса. И, наоборот, антагонист D2-рецепторов дофамина сульпирид, равно как бикукуллин, ее угнетает.

Не совсем понятным остается вопрос влияния астрессина на самостимуляцию. В наших опытах он на 23% ее угнетал. Это означает, что через рецепторы КРГ реализуются активирующие влияния со стороны прилежащего ядра на латеральный гипоталамус. Вследствие блокады рецепторов КРГ эти влияния устраняются (блокируются). Возникает вопрос: в какой степени именно прилежащее ядро определяет активацию самостимуляции через соответствующие рецепторы КРГ? В наших исследованиях с выключением центрального ядра миндалины (Шабанов П.Д., Лебедев А.А., 2011, 2014; Shabanov P.D., Lebedev A.A., 2006) было найдено, что астрессин, введенный в эту структуру, более значимо (на -55%) в сравнении с прилежащим ядром (-23%) угнетает базальную самостимуляцию, равно как самостимуляцию, активируемую фентанилом. В данной работе астрессин усугублял тормозящее действие лей-энкефалина на самостимуляцию (с -11% до -34%) и трансформацию положительного эффекта опиоидного аналгетика фентанила на негативный (с +18% до -21%). Это предполагает, что влияние системы экстрагипоталамического КРГ на самостимуляцию в большей степени реализуется через опиоидные механизмы. Подтверждением этого факта является отсутствие действия астрессина на подкрепляющие эффекты психомоторного стимулятора фенамина и барбитурата этаминала-натрия.

Полученные результаты демонстрируют, что УРПМ, как и реакцию самостимуляции латерального гипоталамуса, можно рассматривать как достаточно адекватную модель для изучения межструктурных взаимодействий в головном мозге и для оценки подкрепляющих свойств фармакологических агентов, обладающих подкрепляющим действием (наркогенов). Особенностью реализации данной методики является формирование под влиянием наркогенов устойчивого предпочтения одного из отсеков установки, в обычных условиях не(мало)предпочитаемого. В этом случае препараты, обладающие функциональным антагонизмом к наркогенам (в наших опытах бикукуллин, лидокаин, налоксон, SCH23390 и сулпирид) действуют противоположным образом, устраняя это стойкое предпочтение места. На этом основании можно заключить, что исследуемые препараты подавляют подкрепляющие свойства наркогенов на условнорефлекторное подкрепление (УРПМ).

В наших исследованиях большинство примененных блокаторов уменьшало или устраняло подкрепляющие эффекты фенамина. То же самое можно отметить и для агониста -опиоидных рецепторов фентанила (активны были бикукуллин, лидокаин и налоксон). Сопоставление этих двух феноменов указывает на то, что подкрепляющие эффекты психостимуляторов и опиатов имеют общие механизмы, несмотря на их нейрохимическую неодинаковость. Если фенамин проявляет свойства типичного непрямого агониста рецепторов дофамина и норадреналина, усиливая их высвобождение из пресинаптических терминалей, то фентанил активирует -опиоидные рецепторы. Следовательно, исходящие из прилежащего ядра аксоны нейронов, контролирующие выработку УРПМ, так же как и самостимуляцию латерального гипоталамуса, имеют неоднородную (гетерогенную) нейрохимическую организацию, включающую рецепторы дофамина (подтверждается действием антагонистов дофамина SCH23390 и сулпирида), ГАМК (действие бикукуллина) и опиоидные рецепторы (действие налоксона). Тогда становится понятным факт, что подкрепляющие эффекты фенамина, как и ожидалось, блокируются его антагонистами (SCH23390 и сулпирид), но не только: активными оказываются бикукуллин (ГАМК), лидокаин (входящие Na-каналы) и налоксон (опиоидные рецепторы). В случае действия фентанила активными также оказываются бикукуллин, лидокаин и налоксон, но не антагонисты дофамина. Аналогично этому было и действие лей-энкефалина, которое устраняется налоксоном. Важно отметить, что подкрепляющие эффекты этаминал-натрия на УРПМ практически не устранялись ни одним из исследованных блокаторов рецепторов, за исключением бикукуллина, ее снижавшую. Наконец, эффекты лей-энкефалина устранялись налоксоном и SCH23390, но усиливались бикукуллином. Сулпирид и лидокаин в этом случае не влияли на УРПМ лей-энкефалина.

Нейрохимические механизмы прилежащего ядра, участвующие в воспроизведение условной реакции предпочтения места психотропных веществ у крыс

Полученные результаты демонстрируют, что экспрессия УРПМ, также как его выработка (Лебедев А.А., Любимов А.В., 2011; Шабанов П.Д., 2008; Шабанов П.Д., Бородкин Ю.С., 1989), можно рассматривать как достаточно адекватную модель для изучения межструктурных взаимодействий в головном мозге и для оценки подкрепляющих свойств фармакологических агентов, обладающих подкрепляющим действием (наркогенов). Особенностью использованной в настоящей работе методики является исследование уже сформированного предпочтения места, то есть, выработанного условного рефлекса места. Отметим, что ранее мы изучали формирование УРПМ при введении разных наркогенов (Лебедев А.А., Любимов А.В., 2011). В обоих случаях препараты, обладающие функциональным антагонизмом к наркогенам (в наших опытах бикукуллин, лидокаин, налоксон, SCH23390 и сулпирид) действуют противоположным образом, устраняя выработанное в ходе опыта предпочтение места (воспроизведение УРПМ). На этом основании можно заключить, что исследуемые препараты подавляют подкрепляющие свойства наркогенов на экспрессию условнорефлекторного поведения (УРПМ). Условно-подкрепляющее действие психоактивного вещества (в нашем случае психомоторного стимулятора фенамина, синтетического опиатного аналгетика фентанила, барбитурата этаминал-натрия или опиоида лей-энкефалина) наблюдается после ряда сочетаний препарата с окружающей обстановкой, но без его введения в последний день эксперимента (Бородкин Ю.С., Шабанов П.Д., 1986; Лебедев А.А., Шабанов П.Д., 1992). В наших исследованиях именно в этот тестовый день (8-й день опыта), к которому УРПМ уже была выработана, вводили фармакологические блокаторы в прилежащее ядро: бикукуллин (антагонист ГАМКА-рецепторов), лидокаин (блокатор входящих Na+ каналов), SCH23390 (антагонист D1 рецепторов дофамина), сулпирид (антагонист D2 рецепторов дофамина) и налоксон (избирательный антагонист опиоидных рецепторов). В соответствии с представлении о формировании условного рефлекса, при повторных сочетаниях фармакологического препарата с обстановочными стимулами между ними возникает ассоциация, и сигналы обстановки становятся условными сигналами, вызывающими условнорефлекторную реакцию. Хотя давно сложились представления о том, что энграмма памяти делокализована, тем не менее, передние отделы новой коры и гиппокамп являются именно теми структурами, которые в бльшей степени вовлекаются в процесс формирования памятного следа (Carlezon W.A., Thomas M.J., 2009). По-видимому, можно думать и о преимущественном включении определенных нейрохимических систем или их отдельных компонентов в формирование отсроченных реакций, ассоциированных с подкрепляющим действием препарата или иного биологически значимого стимула (Shabanov P.D., Lebedev A.A., 2013; Feltenstein M.W., See R.E., 2008). Так, УРПМ наблюдается при сочетаниях обстановки как с электрической стимуляцией положительных эмоциогенных зон головного мозга, так и с подачей пищи ( Feltenstein M.W., See R.E., 2008).

В наших исследованиях большинство примененных блокаторов уменьшало или устраняло как выработку, так и воспроизведение подкрепляющих эффектов фенамина (настоящее исследование). Это в меньшей степени относится к эффектам SCH23390 и налоксона. То же самое можно отметить и для агониста -опиоидных рецепторов фентанила. Экспрессия УРПМ фентанила снималось только налоксоном. В тоже время выработка УРПМ фентанила блокировалась также бикукуллином и лидокаином. В обоих случаях антагонисты рецепторов дофамина (SCH23390 и сулпирид) были не эффективны. При этом бикукуллин не действовал на воспроизведение УРПМ фентанила, в отличие от его выработки, и не растормаживал УРПМ лей-энкефалина. Лидокаин, ингибитор входящих Na+ каналов, при введении в прилежащее ядро, снижая воспроизведение вторично-подкрепляющих эффектов фенамина, не влиял на выработку УРПМ фентанила и лей-энкефалина. Антагонист опиоидных рецепторов налоксон (1 мкг), как и ожидалось, блокировал воспроизведение подкрепляющих эффектов фентанила, но не лей-энкефалина (в отличии от эффектов его выработки) и не влиял на экспрессию УРПМ фенамина и этаминала-натрия. При сопоставлении этих данных можно сделать вывод, что подкрепляющие эффекты психостимуляторов и опиоидов имеют общие механизмы, несмотря на их нейрохимическую неодинаковость. Если фенамин проявляет свойства типичного непрямого агониста рецепторов дофамина и норадреналина, усиливая их высвобождение из пресинаптических терминалей (Менделевич В.Д., Зобин М.Л., 2012; Feltenstein M.W., See R.E., 2008), то фентанил и лей-энкефалин активируют -опиоидные рецепторы. В частности, экспрессия УРПМ фенамина блокируется его антагонистом сулпиридом, но не SCH23390 (в отличии от эффектов его выработки). Активными также оказываются бикукуллин (ГАМК), лидокаин (входящие Na+-каналы), но не налоксон (опиоидные рецепторы).

Следовательно, исходящие из прилежащего ядра аксоны нейронов, контролирующие выработку и воспроизведение УРПМ, имеют неоднородную (гетерогенную) нейрохимическую организацию, включающую рецепторы дофамина. УРПМ является типичной условнорефлекторной реакцией, в формировании которой задействованы не только системы дофамина и ГАМК, но и норадренергические и холинергические структуры. К последним можно отнести структуры вентрального паллидума и голубое пятно (Alheid G.F., Heimer L., 1996) Обе эти структуры осуществляют двигательный (реализационный) контроль условнорефлекторной деятельности. Приведенные рассуждения предполагают возможность модуляции УРПМ разными фармакологическими агентами. Действительно, в случае активации УРПМ фенамином и фентанилом наиболее активны бикукуллин (антагонист ГАМК), налоксон (антагонист опиоидных рецепторов) и лидокаин, неспецифически блокирующий входящие Na+-каналы. Антагонисты дофамина обладали невысокой активностью при введении большинства исследованных наркогенов, что указывает на меньшее значение рецепторов дофамина в осуществлении условнорефлекторной деятельности, подобной УРПМ.

Таким образом, реализация единого механизма внутримозгового подкрепления зависит как от включения механизмов как выработки, так и воспроизведения эмоционально-мотивационных и мнестических компонентов единого интеграционного процесса подкрепления. Использование различных аспектов функционирования подкрепляющего механизма головного мозга, преимущественно связанных с формированием (консолидацией) энграммы или с ее воспроизведением, позволяет выявлять нейрохимические звенья обеспечения условнорефлекторной деятельности. Реализация механизма внутримозгового подкрепления обеспечивается взаимосвязанной работой ряда нейрохимических систем мозга (ДА-, норадреналин-, серотонин-, ГАМК-, глутаматергической, опиоидной) (Шабанов П.Д., Лебедев А.А., 2002; Carlezon W.A., Thomas M.J., 2009; Koob G.F., 2009). Степень вовлечения нейрохимической системы зависит от ее включения в функциональный компонент единого механизма подкрепления (Ikemoto S., 2010; Shabanov P.D., Lebedev A.A., 2013). Патологические изменения функционирования подкрепляющих систем мозга, по-видимому, связаны с нарушением и с разобщением связи между описанными условнорефлекторными компонентами. В этих условиях может наблюдаться дисбаланс нейрохимических систем, изменение чувствительности рецепторов, синтеза медиаторов и их выделения из пресинаптической терминали (Лебедев А.А., Шабанов П.Д., 1992; Шабанов П.Д., Лебедев А.А., 2012 )