Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Обзор литературы 13
1.1 Понятие и роль эндотелиальной дисфункции в патогенезе заболеваний сердечно-сосудистой системы 13
1.2 Маркеры и методы оценки эндотелиальной дисфункции 20
1.3 Препараты для коррекции эндотелиальной дисфункции 22
1.4 Перспективные направления в лечении эндотелиальной дисфункции 26
1.5 Тиоктовая кислота (ТК, альфа-липоевая кислота, -ЛК): свойства, возможные механизмы коррекции ЭД, перспективы клинического применения 27
Глава 2 Материалы и методы 36
2.1 Моделирование L-NAME-индуцированного дефицита оксида азота и оценка эндотелийзависимых и эндотелийнезависимых сосудистых реакций 36
2.2 Моделирование гипоэстроген-L-NAME-индуцированного дефицита оксида азота и оценка эндотелийзависимых и эндотелийнезависимых сосудистых реакций 37
2.3 Проведение функциональных проб в острых экспериментах на наркотизированных крысах 38
2.4 Биохимические маркеры эндотелиальной дисфункции 39
2.5 Морфологические методы оценки сердечно-сосудистых изменений при моделировании L-NAME- и гипоэстроген-L-NAME-индуцированной ЭД 40
2.6 Интегральный векторный анализ гемодинамических, биохимических и морфологических показателей в комплексной оценке эндотелио- и кардиопротективных эффектов исследуемых препаратов 40
2.7 Исследуемые химические соединения и дизайн эксперимента 41
2.8 Статистическая обработка результатов исследования 46
Глава 3 Результаты собственных исследований 47
3.1 Разработка комплекса методических подходов для количественной оценки развития эндотелиальной дисфункции при L-NAME-индуцированной модели дефицита NO в эксперименте с использованием результатов функциональных проб, биохимических маркеров и результатов морфологических исследований 47
3.2 Разработка комплекса методических подходов для количественной оценки развития гипоэстроген-L-NAME-индуцированной эндотелиальной дисфункции в эксперименте с использованием результатов функциональных проб, биохимических маркеров и результатов морфологических исследований 73
3.3 Исследование эндотелиопротективной активности тиоктовой кислоты и розувастатина и при L-NAME- индуцированной модели дефицита NO с использованием результатов функциональных проб 96
3.4 Исследование кардиопротективной активности тиоктовой кислоты и розувастатина и при L-NAME-индуцированной модели дефицита NO с использованием результатов функциональных проб, биохимических маркеров и морфологических исследований 101
3.5 Изучение эндотелиопротективной активности тиоктовой кислоты и розувастатина и при гипоэстроген-L-NAME-индуцированной модели дефицита NO с использованием результатов функциональных проб 116
3.6 Изучение кардиопротективной активности тиоктовой кислоты и розувастатина при гипоэстроген-L-NAME-индуцированной модели дефицита NO с использованием результатов функциональных проб, биохимических маркеров и морфологических исследований 120
Заключение 133
Выводы 150
Благодарности 152
Список сокращений 154
Список литературы
- Препараты для коррекции эндотелиальной дисфункции
- Тиоктовая кислота (ТК, альфа-липоевая кислота, -ЛК): свойства, возможные механизмы коррекции ЭД, перспективы клинического применения
- Проведение функциональных проб в острых экспериментах на наркотизированных крысах
- Исследование кардиопротективной активности тиоктовой кислоты и розувастатина и при L-NAME-индуцированной модели дефицита NO с использованием результатов функциональных проб, биохимических маркеров и морфологических исследований
Введение к работе
Актуальность темы исследования. В Российской Федерации, как и в большинстве развитых стран, основной причиной смертности являются сердечно-сосудистые заболевания, являющиеся причиной 56,5% фатальных исходов в общей структуре смертности, которые связаны с развитием атеросклероза, ишемической болезнью сердца, цереброваскулярной болезнью и артериальной гипертензией (Оганов Р.Г., 2011; Шальнова С.А., 2012; Бойцов С.А., 2014), предиктором развития которых является эндотелиальная дисфункция (ЭД) (Chiu J.J., 2008; Тарасенко Н.В., 2011; Бокерия Л.А., 2013; Булаева Н.И., 2013).
Эндотелиальные клетки, выстилая сосудистое русло, синтезируют локально действующие медиаторы, регулирующие органный кровоток. Среди выделяемых эндотелиоцитами активных веществ одним из главных является оксид азота (NO), являющийся эндотелиальным вазодилататором (Покровский В.И, 2005). На сегодняшний день ЭД рассматривают как нарушение баланса между медиаторами, обеспечивающими в норме оптимальное течение всех эндотелийзависимых процессов (Беленков Ю.Н., 2009; Карпов Ю.А., 2010; Чазова И.А., 2014; Zhao Y., 2015; Papageorgiou N., 2015).
Общеизвестна определяющая роль окислительного стресса (ОС) в развитии атеросклероза и ЭД, в частности, вследствие того, что свободные радикалы кислорода являются едва ли не главными в процессе деградации одного из самых мощных вазодилататоров – локального NO. Уменьшение времени непосредственного действия «на месте» образования оксида азота неизбежно приводит к развитию ЭД (Mason J.C., 2016; Vanhoutte P.M., 2016).
Степень разработанности темы. Учитывая роль снижения синтеза NO и повышения его биодеградации вследствие ОС в развитии сердечно-сосудистой патологии (Тюренков И.Н., 2013; Воронков А.В., 2013; Звягина В.И., 2013; Калинин Р.Е., 2014, 2015; Sukhovershin R.A., 2015), нам представляется актуальным поиск новых путей фармакологической коррекции ЭД. На сегодня достаточно активно изучаются плейотропные эффекты статинов, связанные с активацией eNOS (Gomez-Garsia A., 2007; Zhao L., 2009; Sadowitz B., 2010; Оганов Р.Г, 2010; Аронов Д.М., 2013; Шкловский Б.Л., 2013) и антиоксидантным действием. В литературе есть некоторые данные об антиоксидантном эффекте розувастатина (Ridker P.M., 2008; Agouridis A.P., 2011), связанном со снижением в плазме крови содержания интерлейкина-6, фактора некроза опухоли, глутатионредуктазы, глутатионпероксидазы, супероксиддисмутазы.
Однако такой антиоксидантный плейотропный эффект мы считаем недостаточным в связи с отсутствием коррекции патогенетических звеньев ОС в развитии ЭД, связанных с восстановлениием НАДФ, необходимого для синтеза NO, а также отсутствием восстановления важнейшего компонента антиоксидантной защиты – глутатиона (Писаренко О.И., 2009; Hayes J.D., 2010; Драпкина О.М., 2011; Звенигородская Л.А., 2012; Кураян К.М., 2012; Толпыгина О.А., 2012; Меньщикова Е.Б., 2013; Степанова Ю.И., 2014).
По данным литературы, такими характеристиками обладает тиоктовая кислота (ТК) (Smith A.R., 2008; Tardif J.C., 2008; Мохорт Т.В., 2011; Ansar H., 2011; Fedin A.I., 2013; Rochette L., 2013; Журавлёва Л.В., 2014; Камчатнов П. Р., 2014; Anderson G., 2014; Park S., 2014; Kornfeld O.S., 2015; Sharma S., 2016; Shi C., 2016). Поэтому в настоящее время достаточно большое внимание уделяется изучению ТК, обладающей антиоксидантными свойствами для лечений нейропатии, патологии печени, тогда как изучение её потенциальных эндотелиопротективных свойств, а также исследование комбинации розувастатина с тиоктовой кислотой при снижениии активности эндотелиальной NO-синтазы (eNOS) на фоне гипоэстрогенемии при экспериментальном моделировании ЭД в литературе нами не обнаружено.
Цель исследования. Повышение эффективности фармакологической коррекции эндотелиальной дисфункции с использованием тиоктовой кислоты и её комбинации с розувастатином при различных экспериментальных моделях дефицита оксида азота.
Задачи исследования. Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:
-
Оценить развитие эндотелиальной дисфункции при гипоэстроген-L-NAME-индуцированной модели дефицита NO в эксперименте с использованием функциональных проб, биохимических маркеров и результатов морфологических исследований.
-
Изучить эндотелио- и кардиопротективную активность тиоктовой кислоты и розувастатина при L-NAME- индуцированной модели дефицита NO.
-
Оценить эндотелио- и кардиопротективную активность сочетанного применения тиоктовой кислоты и розувастатина при L-NAME-индуцированной модели дефицита NO.
-
Изучить эндотелио- и кардиопротективную активность тиоктовой кислоты и розувастатина при гипоэстроген-L-NAME-индуцированной модели дефицита NO.
-
Оценить эндотелио- и кардиопротективную активность сочетанного применения тиоктовой кислоты и розувастатина при гипоэстроген-L-NAME-индуцированной модели дефицита NO.
Научная новизна исследования. В работе впервые предложен способ моделирования гипоэстроген-L-NAME-индуцированной NO-дефицитной ЭД. Продемонстрировано, что ЭД характеризуется изменениями соотношений сосудистых реакций на ацетилхолин (эндотелийзависимая вазодилатация) и нитропруссид (эндотелийнезависимая вазодилатация) при гипоэстроген-L-NAME-индуцированной модели дефицита NO с увеличением коэффициента эндотелиальной дисфункции (КЭД), резким снижением показателей биохимических маркеров, а также отрицательной динамикой исчерпания миокардиального резерва и морфологических показателей сердечно-сосудистой системы.
В работе впервые показано, что тиоктовая кислота в дозе 50 мг/кг при введении однократно внутрижелудочно в течение 7 суток при моделировании
L-NAME-индуцированной эндотелиальной дисфункции и при введении однократно внутрижелудочно в течение всего периода моделирования (6 недель) гипоэстроген-L-NAME-индуцированной эндотелиальной дисфункции, используемая в монотерапии, оказывает эндотелио- и кардиопротективное действие; при этом тиоктовая кислота проявляет аддитивные эндотелио- и кардиопротективные эффекты в комбинации со статином нового поколения – розувастатином.
Таким образом, впервые показана высокая эффективность тиоктовой кислоты 50 мг/кг и в комбинации с розувастатином 0,85 мг/кг на моделях L-NAME-индуцированного и гипоэстроген-L-NAME-индуцированного дефицита NO, вводимого также однократно внутрижелудочно в течение 7 суток и в течение 6 недель соответственно.
Научная новизна подтверждается получением патента РФ (Пат. 2568365 Российская Федерация, МПК51 A61K 31/495 «Способ коррекции эндотелиальной дисфункции комбинацией розувастатина и тиоктовой кислоты при гипоэстроген-L-NАMЕ-индуцированном дефиците оксида азота»).
Номер государственной регистрации темы: АААА-А16-116041310090-8.
Теоретическая и практическая значимость работы. В работе обоснована эффективность сочетанного применения розувастатина и тиоктовой кислоты для коррекции L-NAME-индуцированной и гипоэстроген-L-NAME-индуцированной NO-дефицитной ЭД в эксперименте. Показано, что их сочетанное использование позволяет нормализовать изменение соотношения сосудистых реакций на ацетилхолин (эндотелийзависимая вазодилатация) и нитропруссид (эндотелийнезависимая вазодилатация) со снижением коэффициента эндотелиальной дисфункции (КЭД), предотвратить снижение показателей биохимических маркеров, а также добиться положительной динамики морфофукциональных показателей сердечно-сосудистой системы (диаметр кардиомиоцитов и прирост давления при пробе на нагрузку сопротивлением).
Полученные данные позволяют рекомендовать целенаправленные клинические испытания комбинации розувастатина и тиоктовой кислоты при артериальной гипертензии, особенно в менопаузальном периоде.
Реализация результатов исследования. Разработанная модель ЭД используется для изучения эндотелиопротективных свойств других лекарственных средств и фармакологических веществ. Результаты проведенного исследования включены в материалы лекций и практических занятий для студентов на кафедрах фармакологии Белгородского государственного национального исследовательского университета, Курского и Воронежского государственных медицинских университетов. Полученные данные о неоднозначном эндотелиопротекторном действии исследуемых веществ и их комбинации при эндотелиальной дисфункции, вызванной блокадой эндотелиальной NO-синтазы, в том числе и в условиях экспериментально вызванного дефицита эстрогенов, принято учитывать в научно-исследовательской работе кафедры фармакологии НИУ «БелГУ» при
изучении влияния веществ на функцию эндотелия в условиях нормы и экспериментальной патологии.
Материалы диссертационного исследования, касающиеся
антигипертензивной и эндотелиопротективной активности препарата «Октолипен» (300 мг) производства ОАО «Фармстандарт-Лексредства», а также розувастатина в форме препарата «Крестор» (10 мг), относящегося к группе статинов, производства АстраЗенека ЮК Лимитед, Великобритания, используются в работе кардиологического отделения МБУЗ «Городская больница № 1» г. Белгорода.
Диссертация выполнена в соответствии с планом научно-исследовательской работы кафедры фармакологии медицинского института ФГАОУ ВО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет».
Методология и методы исследования. В исследовании использован комплексный подход к изучению эндотелиотропного и кардиотропного влияния веществ на животных с эндотелиальной дисфункцией, моделированной блокадой эндотелиальной NO-синтазы, в том числе и в условиях экспериментально вызванной недостаточности половых гормонов. В качестве объектов исследования использованы крысы-самцы и самки линии Wistar массой 200-250 г. Изучение влияния тиоктовой кислоты (препарат «Октолипен», 300 мг, производства ОАО «Фармстандарт-Лексредства», Россия) и розувастатина (препарат «Крестор», 10 мг, производства АстраЗенека ЮК Лимитед, Великобритания), а также их комбинации на функциональное состояние эндотелия и показатели сердечно-сосудистой реактивности в условиях нагрузочных тестов, проводилось с использованием методических рекомендаций по доклиническому изучению лекарственных средств и с применением рекомендованных методов статистической обработки данных.
Положения, выносимые на защиту:
1. Гипоэстроген-L-NAME-индуцированная NO-дефицитная ЭД
характеризуется изменениями соотношений сосудистых реакций на
ацетилхолин (эндотелийзависимая вазодилатация) и нитропруссид
(эндотелийнезависимая вазодилатация) с увеличением коэффициента
эндотелиальной дисфункции в 5,75 раз, резким снижением показателей
биохимических маркеров (суммарная концентрация нитрит-ионов), а также
характерной динамикой морфофункциональных показателей сердечно
сосудистой системы (диаметр кардиомиоцитов и прирост левожелудочкокого
давления при пробе на нагрузку сопротивлением, адренореактивности и т.д.).
2. Тиоктовая кислота и розувастатин обладают выраженными эндотелио-
и кардиотропными эффектами, восстанавливая показатели функциональной
активности эндотелия сосудов и нагрузочных сердечных проб, биохимических
маркеров эндотелиальной дисфункции, морфофункциональных показателей
сердечно-сосудистой системы в условиях L-NAME-индуцированной
эндотелиальной дисфункции и при моделировании дефицита оксида азота в
условиях эстрогендефицитного состояния.
3. Тиоктовая кислота является дополнительной патогенетической опцией
коррекции эндотелиальной дисфункции в сочетании со статином нового
поколения – розувастатином. Тиоктовая кислота потенциирует эндотелио- и
кардиопротективные эффекты розувастатина при моделировании L-NAME-
индуцированной эндотелиальной дисфункции и в наибольшей степени в
условиях дополнительного, экспериментально вызванного
эстрогендефицитного состояния.
Личный вклад. Автор принимал участие в формулировке задач, выводов и научно-практических рекомендаций. При его участии проведен подбор методов исследования, разработаны протоколы экспериментов, дизайн исследования. Автором самостоятельно обобщены и проанализированы данные литературы по проблеме, выполнены экспериментальная часть работы, статистическая обработка и описание результатов исследования.
Степень достоверности и апробация результатов. Высокая степень достоверности полученных результатов подтверждается достаточным объемом экспериментальных данных, проведенных на животных с использованием современного высокотехнологичного оборудования, адекватных общепринятых методов и критериев статистической обработки данных.
Материалы работы представлены на 5-й ежегодной научно-практической конференции «Лабораторные животные: наука, фармакология, ветеринария» (Белгород, 2015), докладывались и обсуждались на итоговых научных сессиях и конференциях молодых ученых НИУ «БелГУ» (Белгород, 2013-2014 гг.), Всероссийской научной конференции студентов и молодых ученых с международным участием «Молодежная наука и современность» (Курск, 2013). Апробация диссертации проведена на научно-практической конференции кафедр фармакологии, акушерства и гинекологии, биохимии, центра доклинических и клинических исследований НИУ «БелГУ».
Публикация результатов. По материалам диссертации опубликовано десять печатных работ, три из которых в изданиях, рекомендуемых ВАК РФ, две – в издании, входящем в базу данных Scopus.
Объём и структура работы. Диссертация изложена на 180 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, главы собственных исследований с четырьмя подглавами, обсуждения результатов, заключения, выводов и списка литературы, включающего 60 отечественных и 189 иностранных источников. Работа проиллюстрирована 15 таблицами, 60 рисунками.
Препараты для коррекции эндотелиальной дисфункции
В России, как и в большинстве развитых стран, основной причиной смертности являются сердечно-сосудистые заболевания (ССЗ), являющиеся причиной 56,5% фатальных исходов в общей структуре смертности в Российской Федерации. В трудоспособном возрасте сердечно-сосудистая патология составляет более трети всех смертей, составляя 18,8% в общей структуре заболеваний, занимая, таким образом, первое место. Согласно статистике последних лет, в структуре смертности от ССЗ наиболее важное значение имеют ишемическая болезнь сердца (ИБС), цереброваскулярная болезнь и гипертоническая болезнь [4]. Высокая смертность от ССЗ обуславливает значительный экономический ущерб, который в 2008–2009 г. превысил 1 трлн. руб. и составил 3% от ВВП страны [38]. Этим видам патологии, во многом обусловленным атеросклерозом, и отдается приоритет, когда разрабатывается программа профилактики ССЗ.
Ежегодный прирост заболеваемости и смертности от осложнений артериальной гипертензии (АГ) и ИБС давно диктует необходимость изучений механизмов развития данной патологии и возможностей её коррекции путём воздействия на определённые патогенетические звенья. Одним из революционных открытий на данном пути явилось доказательство роли эндотелиальных клеток в развитии сердечно-сосудистых заболеваний: АГ [16, 15, 217], атеросклероза [16, 107, 99], ИБС [37], кардиомиопатии [49], хронической сердечной недостаточности [51, 55], метаболических расстройств: гиперлипидемии [22,81], гипергомоцистеинемии [143, 203], а также в патогенезе диабетических сосудистых поражений, венозной трансформации, нарушении функции лимфангиона как предиктора развития лимфедемы [53, 247]. В 1998 г. профессора Ф. Мюрад, Р. Фарчготт и Л. Игнарро получили Нобелевскую премию в области медицины за открытие сигнальной молекулы в кардиоваскулярной системе – окиси азота, дефицит которого является следствием развития явления, называемой эндотелиальной дисфункцией (ЭД). В цикле работ, посвящённых данному вопросу, ими было выяснено, что изолированная артерия способна изменять свой мышечный тонус под действием ацетилхолина без участия центральных (нейрогуморальных) механизмов. В сосудах, где монослой эндотелия отсутствовал, такой ответ был резко снижен. Таким образом, учёные сделали вывод, что именно эндотелий определяет ответную реакцию на данный стимул [136].
Эндотелий играет важную роль в процессах гомеостаза, гемостаза и воспаления. Он поддерживает гомеостаз путём регуляции равновесия противоположных процессов: тонуса сосудов, отвечая за вазодилатацию и вазоконстрикцию; анатомического строения сосудов, регулируя синтез и ингибирование факторов пролиферации; гемостаза, участвуя в синтезе и ингибировании факторов фибринолиза и агрегации тромбоцитов; местного воспаления, вырабатывая про- и противовоспалительные цитокины [17, 218]. Эндотелий выстилает все сосуды вне зависимости от их органной локализации, поэтому эндотелиальная дисфункция, в основе развития которой лежит снижение синтеза оксида азота (NO), является предиктором заболеваний не только артерий и вен, но и компонентов микроциркуляторного русла [31, 28].
Главным механизмом регуляции эндотелием сосудистого тонуса является секреция вазоактивных веществ: вазодилататоров (оксида азота (NO), эндотелиального гиперполяризующего фактора релаксации (ЭГФР) [100], а также простациклина и эндотелийзависимого фактора гиперполяризации [166] и вазоконстрикторов (АТ II, эндотелин, свободные радикалы недоокисленных жирных кислот, простагландин F2-альфа и тромбоксан А2) [191]. Помимо этого, эндотелиоциты продуцируют ряд факторов, отвечающих за атромбогенность сосудистой стенки (NO, PGI 2, t-PA, экто-АДФаза, тромбомодулин) и в то же время за её тромбогенность (PAI-1, PAI-2, фактор Виллебранда, тканевый тромбопластин) [30]. Адгезия лейкоцитов регулируется путём выделения эндотелиальными клетками Р-селектина [204], Е-селектина, ICAM-1, VCAM-1 [46,144]. Регуляция роста сосудов осуществляется через продукцию ими ангиостатинов, эндотелиального фактора роста (VEGF) [173].
В миокарде оксид азота увеличивает диастолическую растяжимость левого желудочка, что наиболее важно при формировании гипертрофии сердца. Также NO поддерживает инотропный и хронотропный 1-адреномиметические эффекты [26].
Но ведущая роль в развитии ЭД отводится недостатку NO. Основные эффекты NO, к которым относится, прежде всего, вазодилататорный, антиагрегантный, реализуются посредством активации К+ Са2+-каналов. Открытие многочисленных калиевых и кальциевых каналов, находящихся на клеточной мембране, опосредуется цГМФ-зависимой протеиназой, активизирующейся под действием цГМФ, образование которой стимулируется оксидом азота [14,184].
Кроме того, цГМФ снижает концентрацию ионов кальция в гладкомышечных клетках, тромбоцитах, влияя, таким образом, на все фазы гемостазы и процессы сокращения миофибрилл [100].
Синтез NO в организме происходит из L-аргинина при участии синтазы оксида азота (СОА). Три формы данного фермента (нейрональная, эндотелиальная, индуцибельная) катализируют присоединение кислорода к конечному атому азота в гуанидиновой группе L-аргинина [172].
Нейрональная (I тип) и эндотелиальная (III тип) изоформы СОА относятся к конститутивным формам. Индуцибельная форма секретируется макрофагами и эндотелиальными клетками при патологии под действием стимулирующих факторов, таких как эндотоксины, цитокины. Все три формы катализируют образование NO и L-цитруллина из L-аргинина и O2 [63, 105].
Таким образом, недостаток NO может быть связан с его недостаточной выработкой из L-аргинина, ускоренной его деградацией либо снижением его биодоступности, снижением активности СОА в результате воздействия различных ингибиторов [161]. Концентрация L-аргинина в клетках эндотелия зависит не только от поступления с пищей, но и от его метаболизма в организме, одним из звеньев которого является превращение L-аргинина в орнитин и мочевину под действием аргиназы. Количество аргинина, проникающего в ЭК, зависит от активности мембраносвязанной транспортной системы – высокоактивного Na-независимого переносчика щелочных аминокислот и других факторов [205].
Снижение биодоступности NO возможно в результате оксидантного стресса, при котором свободные радикалы кислорода (СРК), соединяясь с NO, образуют избыточное количество такой реактивной формы кислорода (РФК), как пероксинитрит (ONOO-) [29, 127]. Пероксинитрит – это токсичное соединением, которое повреждает мембраны и ДНК клетки, вызывает мутации и перекисное окисление липидов низкой плотности [188, 190]. Кроме того, происходит активизация оксидантчувствительных факторов транскрипции, повышающих экспрессию адгезивных молекул эндотелия (ICAM-1, VCAM-1), что способствует развитию атеросклероза и артериальной гипертензии [128, 188]. Одним из факторов, способствующим повышению активности окислительного стресса, является дефицит эстрогенов [140].
Высокие уровни Р2-изопростана или малондиальдегида (маркеры окислительного стресса) в плазме у женщин менопаузального периода свидетельствуют о повышении активности окислительного стресса. Кроме того, чем больше времени прошло от момента наступления менопаузы, тем более высокая активность окислительного стресса отмечается. Установлено, что у женщин в период менопаузы уровни глутатионпероксидазы в плазме снижены, в то время как уровни супероксиддисмутазы либо не изменены, либо значительно повышены [61]. Установлено множество патогенетических механизмов, которые могут играть важную роль в стимуляции окислительного стресса у женщин в период менопаузы. Одним из главных факторов является гиперактивация ренин-ангиотензин-альдостероновой системы (РААС), продуктом которой является ангитензин -2 (АТ-II) - один из ключевых звеньев в развитии ЭД [92, 134]. АТ-II, вводимый как в высоких [75], так и в физиологических дозах [86], способен стимулировать окислительный стресс, о чем свидетельствует повышение плазменных уровней Р2-изопростанов. Кроме того, исследования показали, что Р2-изопростан, помимо того, что он сам является почечным вазоконстриктором [135], усиливает сосудосуживающее действие АТ-II [154]. АТ-II повышает синтез супероксида посредством стимуляции субъединиц НАДФН оксидазы. Супероксид соединяется с оксидом азота (NO), что приводит к подавлению его вазодилататорной активности [198]. Помимо активации окислительного стресса, АТ-II способен непосредственно влиять на уровни АД, поскольку является мощным вазоконстриктором и, как было показано в экспериментах с его хронической инфузией, приводит к стимуляции синтеза другого мощного вазоконстриктора – препроэндотелина [93], поэтому активация РАС – обязательный компонент эндотелиальной дисфункции [98, 147, 194].
Тиоктовая кислота (ТК, альфа-липоевая кислота, -ЛК): свойства, возможные механизмы коррекции ЭД, перспективы клинического применения
Опыты выполнены на самцах белых нелинейных крыс массой 220–250 г. Животные содержались в стандартных условиях вивария, согласно правилам GLP при проведении доклинических исследований в РФ (ГОСТ 3 51000.3-96 и 51000.4-96). Экспериментальная деятельность регламентирована следующими нормативными актами: ГОСТ Р 53434-2009 «Принципы надлежащей лабораторной практики», ГОСТ Р 51000.4-2011 «Общие требования к аккредитации испытательных лабораторий», Приказ МЗ и СР РФ от 23.08.2010 № 708н «Об утверждении правил лабораторной практики», Международные рекомендации «Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях» (The European Convention, 1986). Выведение животных из эксперимента и болезненные манипуляции и проводились с использованием наркоза (хлоралгидрат 400 мг/кг, золетил 150 мг/кг). Результаты экспериментальных исследований получены под руководством и совместно с д.м.н. В.И. Кочкаровым [21].
Животных рандомизировали по полу, возрасту и массе для формирования экспериментальных групп.
Ингибитор NO-синтазы N-нитро-L-аргинин метиловый эфир (L-NAME, Sigma) вводился внутрибрюшинно один раз в сутки в дозе 25 мг/кг в объеме 1 мл/кг в течение 7 дней (n=10 животных). Животным интактной группы вводился физиологический раствор NaCl в том же объеме (n=10 животных) [83].
Исследование показателей гемодинамики в группах животных проводили под наркозом (хлоралгидрат 300 мг/кг и золетил 150 мг/кг, внутрибрюшинно) посредством введения в сонную артерию катетера. Фармакологические агенты вводили болюсно в правую бедренную вену. Регистрировали систолическое артериальное давление (САД), диастолическое артериальное давление (ДАД) и частоту сердечных сокращений (ЧСС) с помощью датчика Р23ID «Gould» США, АЦП L-154 и компьютерной программы «Bioshell».
Осуществляли сосудистые пробы на эндотелийзависимую вазодилатацию (ЭЗВ) – внутривенное введение ацетилхолина (АХ) в дозе 40 мкг/кг и эндотелийнезависимую вазодилатацию (ЭНЗВ) – внутривенное введение нитропруссида натрия (НП) в дозе 30 мкг/кг. Для оценки степени развития эндотелиальной дисфункции у экспериментальных животных и ее коррекции исследуемыми препаратами произведен расчет коэффициента эндотелиальной дисфункции (КЭД).
Выполнялись функциональные пробы путём внутривенного введения ацетилхолина (40 мкг/кг) и нитропруссида натрия (30 мкг/кг) [34].
Опыты выполнены на самках белых крыс массой 200–250 г линии Wistar в возрасте 16 недель. На первом этапе для моделирования эндотелиальной дисфункции крыс наркотизировали хлоралгидратом (300 мг/кг) и проводили билатеральную овариэктомию. Для этого в асептических условиях вскрывали переднюю брюшную стенку, перевязывали трубный и брюшинный отделы яичников, используя атравматический шовный материал, после чего производили эксцизию последних. Рана послойно ушивалась. На втором этапе на 43 день (через 6 недель после проведения операции) внутрибрюшинно вводился ингибитор NO-синтазы N-нитро-L-аргинин метиловый эфир (L-NAME, Sigma) один раз в сутки в дозе 25 мг/кг в объеме 1 мл/кг в течение 7 дней. Животным интактной группы вводится физиологический раствор NaCl в том же объеме.
На 8 сутки после начала введения L-NAME под наркозом (хлоралгидрат 300 мг/кг и золетил 150 мг/кг внутрибрюшинно) животное брали в эксперимент и на первом этапе оценивали артериальное давление и реакции артериального давления на эндотелийзависимую (ацетилхолин в дозе 40 мкг/кг) и эндотелийнезависимую (нитропруссид в дозе 30 мкг/кг) вазодилатацию путём введения катетера в сонную артерию. Фармакологические агенты вводили болюсно в правую бедренную вену.
Регистрировали систолическое артериальное давление (САД), диастолическое артериальное давление (ДАД) и частоту сердечных сокращений (ЧСС) с помощью датчика TSD104A и аппаратно-программного комплекса MP150, производства Biopac System, Inc., США [34].
Исследование сократимости миокарда после моделирования патологии проводили у наркотизированных крыс, находящихся на управляемом дыхании. Полость левого желудочка зондировали иглой через верхушку сердца и посредством датчика Р23ID «Gould», США, АЦП L-154 и компьютерной программы «Bioshell» регистрировали показатели кардиогемодинамики: левожелудочковое давление (ЛЖД), максимальную скорость сокращения (+dp/dt max), максимальную скорость расслабления (-dp/dt max), частоту сердечных сокращений (ЧСС).
Нами использована модификация метода определения стабильных метаболитов NO, позволяющая после депротеинизации сыворотки крови проводить одноэтапное количественное определение суммарных нитратов и нитритов [33, 58]. Принцип метода заключается в одновременном восстановлении нитратов в нитриты в присутствии хлористого ванадия и реакции диазотирования с последующим развитием окраски, интенсивность которой определяли спектрофотометрически при длине волны 540 нм. Анализ 100 мкл депротеинизированной сыворотки проводили в 96 луночных планшетах с плоским дном. Чувствительность метода на приборе Labsystems Multiskan MCC/340 составляет 1,7 мкМ. Для колориметрического определения нитрит-иона использовали реактив Грисса, состоящий из равных частей раствора I (0,05-процентный раствор N-нафтилэтилендиамина в воде) и раствора II (1-процентный раствор сульфаниламида в 30-процентной уксусной кислоте) [33]. Оба раствора хранятся в темноте при температуре 4 оС в течение нескольких месяцев. Для приготовления раствора хлористого ванадия 400 мг VCl3 растворяли в 50 мл 1N HCl c последующим фильтрованием через бумажный фильтр. Всегда использовали свежеприготовленный раствор.
Уровень метаболитов NO (то есть суммарную концентрацию нитратов и нитритов NOx) определяли колориметрическим методом по развитию окраски в реакции диазотирования нитритом сульфаниламида, входящего в состав реактива Грисса. Для построения калибровочной кривой использовали 1М раствор NaNO2 в воде, который хранили при температуре –20оС; перед употреблением его разводили в 1000 раз и готовили серию разведений для построения кривой.
Проведение функциональных проб в острых экспериментах на наркотизированных крысах
Согласно протоколу исследования, эндотелиальную дисфункцию моделировали ежедневным в/б введением L-NAME в течение 7 суток. На восьмые сутки наркотизированное животное брали в эксперимент и на первом этапе оценивали реакции артериального давления на эндотелийзависимую (ацетилхолин) и эндотелийнезависимую (нитропруссид) вазодилатацию. Экспериментальные данные получены под руководством и совместно с д. м. н. В.И. Кочкаровым [21].
Основным недостатком данных проб является то, что степень снижения в абсолютных цифрах определяется исходным уровнем артериального давления. Более того, функциональная проба с введением ацетилхолина помимо сосудистого компонента имеет выраженный кардиальный компонент, заключающийся в брадикардии и снижении сердечного выброса, что не позволяет использовать точку максимального снижения артериального давления для оценки действия препаратов, имеющих холинергическую активность.
На рисунках 3.1, 3.2, 3.3 и 3.4 изображена динамика АД при проведении функциональных проб эндотелийзависимой вазодилатации с введением ацетилхолина 40 мкг/кг и эндотелийнезависимой вазодилатации с введением нитропруссида в дозе 30 мкг/кг у интактных животных, крыс с L-NAME-индуцированным дефицитом оксида азота.
При оценке результатов функциональной пробы на эндотелийзависимую вазодилатацию (ЭЗВД) с введением ацетилхолина 40 мкг/кг нами использована площадь треугольника над кривыми восстановления АД. При этом за меньший из катетов данного треугольника принималась разность между точкой окончания кардиального компонента и точкой восстановления артериального давления после сосудистой реакции (рисунки 3.1, 3.2).
При оценке результатов функциональной пробы эндотелийнезависимой вазодилатации (ЭНВД) с введением нитропруссида в дозе 30 мкг/кг использовали также площадь треугольника над кривой восстановления артериального давления, точками меньшего катета являлись точка максимального падения артериального давления при сосудистой реакции и точка выхода уровня артериального давления на «плато» (рисунки 3.3, 3.4). Более длинными катетами в этих треугольниках являлись показатели времени восстановления сосудистой реакции на введение ацетилхолина и нитропруссида, выражаемое в секундах. Площадь исчисляемых треугольников выражали в условных единицах (усл. ед.).
У интактных животных исходное САД составило 137,7 ±3,7 мм.рт.ст, ДАД – 101,9 ± 4,3 мм.рт.ст. (рисунок 3.5). Математическая обработка результатов серий экспериментов показала, что болюсное внутривенное введение ацетилхолина в течение 3–5 сек приводило к резкому падению артериального давления достигающего пика у интактных животных для систолического давления (САД) 84,3±4,5 мм рт.ст., для диастолического давления (ДАД) – 38,7± 2,8 мм рт. ст. и для среднего артериального давления (СрАД) 59,9±2,9 мм рт. ст., при этом в течение первых 2–3 сек развивалась резкая брадикардия до 130–150 ударов в минуту. Восстановление АД происходило в среднем за 42,2±0,8 сек после нормализации сердечного ритма. Именно эта площадь треугольника нами принималась как сосудистый компонент ЭЗВД на АХ, использовалась для дальнейших расчётов и составляла 1268,0±74,8 усл.ед. (таблица 3.1). File Edit Transform Analysis Display MP 150 Window Help Media
Эндотелийнезависимая вазодилатация (ЭНВД) оценивалась посредством функциональной пробы с введением нитропруссида (НП) в дозе 30 мкг/кг и также характеризовалась снижением САД до 83,0 ±3,7, ДАД до 42,1±4,4 и СрАД до 61,0±3,0 мм рт. ст. с последующим полным восстановлением в среднем в течение 45,1±1,0 сек. При этом площадь треугольника над кривой восстановления, используемая нами в дальнейших расчётах, составляла 1375,3±93,7 усл. ед.
Моделирование эндотелиальной дисфункции путём блокады NO-синтазы с помощью длительного, ежедневного, в течение 7 суток внутрибрюшинного введения L-NAME (N-нитро-L-аргинин метилового эфира) в дозе 25 мг/кг в сутки приводило к достоверному снижению площади над реакцией восстановления АД при проведении ЭЗВД после введения АХ до 695,3±87,6 усл.ед. по сравнению с интактной группой животных (рисунок 3.2). Напротив, ЭНВД, являющаяся отражением реакции на введение НП, увеличилась у животных с блокадой NO-синтазы по сравнению с интактными до 3322,7±116,7 усл.ед. (рисунок 3.4). Такая принципиальная разница в ЭЗВД и ЭНВД реактивности интактных животных и животных с блокадой NO-синтазы (L-NAME-зависимой) закономерно привела нас к необходимости введения показателя, отражающего степень эндотелиальной дисфункции – далее коэффициент эндотелиальной дисфункции (КЭД), являющегося отношением площади ЭНВД восстановления АД в ответ на введение НП к площади ЭЗВД восстановления АД в ответ на введение АХ (таблица 3.1). S АД НП КЭД = (1) . S АД АХ Мы рассчитывали КЭД у каждого животного интактной группы и крыс после моделирования блокады NO-синтазы и получили разницу КЭД в 5 раз: соответственно 1,1±0,1 – у интактных и 5,4±0,6 – у животных, получавших L-NAME. (рисунок 3.6).
Значения коэффициента эндотелиальной дисфункции при моделировании L-NAME (25 мг/кг внутрибрюшинно однократно в течение 7 дней) -индуцированного дефицита NO. Сравнение показателей абсолютных значений снижения САД, ДАД, СрАД, а также динамика ЧСС при проведении функциональных проб ЭЗВД с АХ выявили достоверные различия в абсолютных значениях показателей АД между собой. Однако, вследствие развития значительной артериальной гипертензии (рисунок 3.5) при данной экспериментальной модели эндотелиальной дисфункции, снижение абсолютных показателей АД при проведении ЭЗВД с АХ не выявляет объективную оценку вклада именно нарушения продукции оксида азота (таблица 3.1).
Таким образом, приведенные результаты наглядно демонстрируют, что для оценки эндотелиальной дисфункции наиболее информативным в объективной оценке степени эндотелиальной дисфункции является предлагаемый нами коэффициент, являющийся отношением площади восстановления над кривой реакции на нитропруссид к площади восстановления над кривой реакции на ацетилхолин.
Оценка функциональных резервов миокарда при проведении нагрузочных проб у интактных животных
Результаты экспериментов в группе интактных животных представлены в абсолютных значениях ЛЖД, +dp/dt, -dp/dt, ЧСС. Реактивность миокарда на нагрузочные пробы оценена в % от абсолютных значений инотропного резерва (прирост показателей сократимости на 5 секунде пережатия аорты). Исходные значения показателей сократимости миокарда наркотизированных интактных животных представлены в таблице 3.2. Для оценки функциональных возможностей миокарда интактных и гипертензивных животных проводились нагрузочные пробы. Результаты экспериментов на интактных животных с проведением нагрузочных проб представлены в таблице 3.3. Динамика показателей сократимости при проведении нагрузки объемом (внутривенное введение физиологического раствора натрия хлорида 0,3 мл/100 грамм массы) у интактных животных показала прирост ЛЖД, +dp/dt и ИФС в среднем более чем на 20%.
Исследование кардиопротективной активности тиоктовой кислоты и розувастатина и при L-NAME-индуцированной модели дефицита NO с использованием результатов функциональных проб, биохимических маркеров и морфологических исследований
В условиях сниженного содержания восстановленного глутатиона и активности супероксиддисмутазы (фермент, катализирующий реакцию взаимодействия двух супероксидных радикалов с образованием перекиси водорода и молекулярного кислорода, конкурирует с NO, поскольку скорость реакции NO с супероксиданионом в три раза выше, чем скорость реакции супероксиданиона с супероксиддисмутазой) изменяется редокс-статус клетки и, вероятно, образуется пероксинитрит, который обладает универсальной биоагрессивностью, может вступать в реакции с нуклеиновыми кислотами, липидами и белками, подавлять митохондриальное дыхание, вызывая тем самым нарушение функции клетки и повреждение тканей, усугубляя ОС [131]. Активное образование метилглиоксаля и иных веществ, синтезируемых в альтернативных путях метаболизма, также является фактором, содействующим развитию ОС (рисунок 2) [96, 91].
Вторым компонентом патогенетического обоснования развития нейропатии и снижения эндоневрального кровотока, как одной из причин её развития, является сосудистая теория. Общим звеном обеих теорий является оксид азота (NO). Высокоактивный и живущий недолго радикал NO играет роль нейронального мессенджера в центральной нервной системе, а также является эндотелиальным релаксирующим фактором, который опосредует вазодилатацию.
НАДФH является не только облигатным кофактором превращения глюкозы в сорбитол, а также и необходимым кофактором для синтеза NO. Ключевой момент обеих теорий – истощение запасов НАДФН в результате активации полиолового шунта на фоне окислительного стресса, что приводит к соответствующему уменьшению образования NO (рисунок 4.2). Это, в свою очередь, приводит к снижению эндоневрального кровообращения и ишемии нерва, что отражается на скорости проведения возбуждения по нервным волокнам [9].
Как известно, тиоктовая кислота является препаратом выбора для коррекции полинейропатии диабетического генеза, одним из механизмов развития которой является эндотелиальная дисфункция и снижение эндоневрального кровотока. Использование тиоктовой кислоты основывается на значении этого вещества как биокатализатора энергетического обмена. Экспериментальных и клинических данных по комплексному изучению комбинированного использования розувастатина, препарата с доказанными эндотелиопротективными эффектами, и тиоктовой кислоты на функциональные, биохимические и морфологические показатели нитроксидергической системы при L-NAME- и гипоэстроген-L-NAME-индуцированной эндотелиальной дисфункции в доступной литературе нами не было обнаружено, что и явилось целью исследования.
Значение тиоктовой кислоты как биокатализатора состоит в коэнзимной функции относительно ключевых ферментов цикла Кребса и гликолиза. Одним из ключевых ферментов гликолиза, активность которого снижается в результате окислительного стресса, является глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназа (ГАФДГ), катализирующая последовательность превращений после образования трехуглеродных фосфопродуктов. Тиоктовая кислота, обладая липофильными свойствами, накапливается в нервных волокнах и снижает содержание свободных радикалов, активируя таким образом ГАФДГ (рисунок 4.2).
На фоне окислительного стресса активность ГАФДГ уменьшается и, как следствие, происходит повышение активности двух других метаболических путей, которые практически неактивны в норме, – активации диацилглицерол (ДАГ) – опосредованной протеинкиназы С и синтеза продуктов гликозилирования (AGE), индуцированных метилглиоксалем и другими активными веществами [248]. Гликозилированные белки повышают активность NF-kB и продукцию нескольких сигнальных белков, таких как митоген-активируемая протеинкиназа, а также вазоактивных факторов, а именно эндотелина-1, цитокинов, интерлейкинов-1 и -6 и фактора некроза опухоли-альфа, что способствует развитию эндотелиальной дисфункции.
Таким образом, повышенное образование супероксидных анионов вследствие различных причин и, как следствие, целый каскад процессов, которые при этом запускаются: ускоренный гликолиз, активация полиолового и гексозаминового метаболических путей по принципу обратной связи увеличивают образование свободных радикалов, уменьшают антиоксидантную защиту клеток, приводя к развитию эндотелиальной дисфункции, сопровождающейся увеличением экспрессии и продукции вазоконстрикторов, таких как эндотелин-1 и ангиотензин II, а также снижению выработки вазодилататоров – простациклина (PGI2), субстанции P, генерируемого эндотелием гиперполяризующего фактора (EDHF), брадикинина [125, 7, 232]. Предполагают, что следующий этап в каскаде повреждающих реакций – нарушения в системе гемостаза, возникающие при взаимодействии сосудистой стенки и тромбоцитов [248]. Микроповреждения сосудистой стенки и повышенная активность системы свертывания крови предположительно участвуют в развитии вазоконстрикции, отеков и ишемии, которые ведут к уменьшению эндоневрального кровотока [91, 247, 13].
Тиоктовая кислота активирует митохондриальные ферменты, снижает содержание свободных радикалов и, таким образом, противодействует потере энергии, предотвращая активацию энергозатратных альтернативных путей метаболизма глюкозы при нарушении окислительно-восстановительного равновесия, которое имеет место при введении L-NAME и на фоне гипоэстрогении, увеличивает эндоневральный кровоток, нормализуя содержание NO – регулятора расслабления сосудистой стенки, а также, способствует восстановлению глутатиона (рисунки 4.2 и 4.3) [15, 23, 16, 175].