Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 13
1.1 Введение 13
1.2 Полимеры, используемые для получения микрочастиц с НПВС 18
1.3 Методы получения микрочастиц с НПВС 20
1.3.1 Метод распылительной сушки 20
1.3.2 Метод эмульгирования/сшивания 21
1.3.3 Метод двойного эмульгирования 23
1.3.4 Метод коацервации 23
1.3.5 Метод кристаллизации из расплава 25
1.3.6 Метод одностадийного диспергирования с последующей экстракцией/испарением растворителя 26
1.4 Заключение 28
1.5 Выводы по обзору литературы 28
Глава 2. Объекты и методы исследований 30
2.1 Физико-химические свойства субстанции диклофенака натрия 30
2.2 Вспомогательные вещества, использованные при разработке состава и технологии приготовления лекарственного препарата диклофенака 30
2.3 Оборудование 32
2.4 Методы исследования 35
2.4.1 Получение (2-(2,6-дихлоранилино) фенилуксусной кислоты 35
2.4.2 Количественное определение основного вещества в диклофенаке .35
2.4.3 Потеря в массе при высушивании диклофенака 37
2.4.4 Получение полимерных микрочастиц с инкапсулированным диклофенаком 38
2.4.5 Количественное определение диклофенака, инкапсулированного в полимерные микрочастицы 38
2.4.6 Количественное определение диклофенака перешедшего в среду растворения из микрочастиц (Тест «Высвобождение») 41
2.4.7 Определение распределения частиц по размеру 44
2.4.8 Количественное определение остаточных растворителей 44
2.4.9 Идентификация сополимера молочной и гликолевой кислот 50
2.4.10 Идентификация маннитола 50
2.4.11 Идентификация Полисорбат - 80 51
2.4.12 Идентификация карбоксиметилцеллюлозы натрия 53
2.4.13 Определение однородности дозирования 53
2.4.14 Определение родственных примесей 53
2.4.15 Потенциометрическое определение рН 54
2.4.16 Определение вязкости 55
2.4.17 Определение содержания воды 55
2.4.18 Проходимость через иглу 55
2.4.19 Седиментационная устойчивость 56
2.4.20 Температура плавления 56
2.4.21 Спектрометрия в инфракрасной области 56
2.4.22 Спектроскопия ядерного магнитного резонанса 56
2.4.23 Статистическая обработка полученных результатов 56
2.4.24 Определение степени включения диклофенака в полимерные частицы 57
Глава 3. Разработка состава и технологии получения пролонгированного лекарственного препарата диклофенака 58
3.1 Выбор оптимальных условий получения полимерных микрочастиц на основе СМГК, содержащих инкапсулированный диклофенак 58
3.2 Разработка состава и технологии получения инъекционной лекарственной формы «Диклофенак пролонгированного действия» 71
3.2.1 Разработка состава лекарственной формы «Диклофенак пролонгированного действия» 71
3.2.2 Выбор упаковочных материалов для лекарственной формы «Диклофенак пролонгированного действия» 72
3.2.3 Разработка технологии получения лекарственной формы «Диклофенак пролонгированного действия» 73
3.3 Заключение 76
Глава 4. Разработка методик химико-фармацевтического анализа лекарственной формы диклофенака. Стандартизация лекарственной формы диклофенака 79
4.1 Методика хроматографического определения содержания диклофенака в лекарственной форме 79
4.1.1. Количественное определение диклофенака 79
4.1.2. Валидация методики количественного определения диклофенака. 81
4.2 Стандартизация лекарственной формы диклофенака 85
4.3 Исследование стабильности препарата «Диклофенак пролонгированного действия» 93
4.4 Изучение острой токсичности разработанной новой лекарственной формы «Диклофенак пролонгированного действия» 97
4.5 Заключение 98
Общие выводы 99
Список используемых сокращений 101
Список литературы 103
- Полимеры, используемые для получения микрочастиц с НПВС
- Количественное определение остаточных растворителей
- Выбор оптимальных условий получения полимерных микрочастиц на основе СМГК, содержащих инкапсулированный диклофенак
- Исследование стабильности препарата «Диклофенак пролонгированного действия»
Полимеры, используемые для получения микрочастиц с НПВС
В качестве носителей лекарственных средств в настоящее время используют природные и синтетические биоразлагаемые полимеры. Природные полимеры, например, белки и полисахариды, являются естественными продуктами жизнедеятельности живых организмов, они безопасны, легко доступны и относительно недороги. Преимуществами синтетических биоразлагаемых полимеров являются высокая чистота, возможность получать стандартизованные продукты с требуемыми свойствами (молекулярная масса, мономерный состав, природа концевых групп и т.д.).
Характер высвобождения НПВВ из микрочастиц зависит от кристалличности, гидрофобности, мономерного состава и молекулярной массы (ММ) синтетических полимеров [13, 79, 95, 101], в качестве которых чаще всего используют алифатические сложные полиэфиры, такие как полимолочная кислота, полигликолевая кислота, сополимеры молочной и гликолевой кислот, поли--капролактон [6, 54, 64, 92]. Безопасность таких полимеров определяется их способностью к биоразложению на нетоксичные продукты, при контакте с биологическими средами после введения в организм [3]. Инкапсулирование различных НПВВ и других ЛС в полимерные микрочастицы на основе сополимера молочной и гликолевой кислот (СМГК) позволяет получить пролонгированный терапевтический эффект и свести к минимуму их побочные эффекты.
Одним из природных полимеров, применяемых в качестве материала для получения микрочастиц, содержащих НПВС, является альбумин [77, 117]. Скорость высвобождения ЛС из таких микрочастиц и скорость, с которой микрочастицы разлагаются в организме, зависят от их степени сшивки. Сшивку осуществляют путем тепловой денатурации альбумина или при использовании химических сшивающих агентов, таких как формальдегид или глутаровый альдегид.
Также для получения полимерных частиц применяют целлюлозоподобный положительно заряженный и мукоадгезивный полисахарид – хитозан, который обладает ранозаживляющим, противоязвенным действием. Использование хитозана в составе пероральных лекарственных форм позволяет удерживать ЛС в ЖКТ за счет его мукоадгезивных свойств, что продлевает время прохождения ЛС через ЖКТ и способствует улучшению биодоступности [22, 23, 56, 105].
Количественное определение остаточных растворителей
Определение остаточного этилацетат и этилового спирта
Остаточные этилацетат и этиловый спирт в полимерных микрочастицах определяют методом ГЖХ с помощью хроматографа, состоящего из кварцевой капиллярной колонки размером 30 м х 0,53 мм, нанесённой стационарной фазой типа Restek Rtx - 1301 (цианопропилфенил - 6%, диметилполисилоксан - 94%) с толщиной 3 мкм и пламенно-ионизационного детектора. В качестве газа - носителя используют гелий. При анализе газ -носитель подают в колонку при постоянном давлении 24 кПа. Испытуемую пробу вводят в устройство ввода пробы при режиме деления потока с коэффициентом деления 15:1 и температуре 200 С. Температуру хроматогафической колонки регулируют термостатом в градиентном режиме со скоростью 30 С/мин. Начальная температура колонки составляет 90 С (выдержка при данной температуре составляет 6 минут), конечная температура - 220 С (выдержка при данной температуре составляет 6 минут). В детектор подают водород с потоком 40 мл/мин, воздух - 400 мл/мин и гелий - 30 мл/мин. Температура в детекторе составляет 250 С. Анализ проводят в течение 20 минут с объемом испытуемой пробы 1 мкл.
Методика:
Внутренний градуировочный раствор с концентрацией пропилацетата 0,0222 мг/мл, 2-фенилэтанола 0,150 мг/мл. В мерную колбу на 1000 мл, содержащую 900 мл ІЧДЯ-диметилформамида вносят 25 мкл пропилацетата и 150 мкл 2-фенилэтанола и перемешивают. Доводят объем раствора тем же растворителем до метки и перемешивают.
Градуировочные растворы
Исходный градуировочный раствор с концентрацией пропилацетата около 0,0222 мг/мл, 2-фенилэтанола около 0,153 мг/мл, спирта этилового около 0,9 мг/мл, этилацетата около 0,3 мг/мл и бензилового спирта около 1,2 мг/мл: около 180 мг спирта этилового, 60 мг этилацетата и 240 мг бензилового спирта вносят в мерную колбу на 200 мл, содержащую 60 мл внутреннего градуировочного раствора и перемешивают. Доводят объем раствора внутренним градуировочным раствором до метки и перемешивают.
Градуировочный раствор №1 с концентрацией пропилацетата 0,0222 мг/мл, 2-фенилэтанола 0,153 мг/мл, этилового спирта 0,018 мг/мл, этилацетата около 0,006 мг/мл и бензилового спирта 0,024 мг/мл: в мерную колбу на 50 мл вносят 1 мл исходного градуировочного раствора, доводят объем раствора внутренним градуировочным раствором до метки и перемешивают.
Градуировочный раствор №2 с концентрацией пропилацетата около 0,0222 мг/мл, 2-фенилэтанола около 0,153 мг/мл, этилового спирта 0,036 мг/мл, этилацетата около 0,012 мг/мл и бензилового спирта 0,048 мг/мл: в мерную колбу на 50 мл вносят 2 мл исходного градуировочного раствора, доводят объем раствора внутренним градуировочным раствором до метки и перемешивают.
Градуировочный раствор №3 с концентрацией пропилацетата около 0,0222 мг/мл, 2-фенилэтанола около 0,153 мг/мл, этилового спирта 0,09 мг/мл, этилацетата около 0,03 мг/мл и бензилового спирта 0,12 мг/мл: в мерную колбу на 50 мл вносят 5 мл исходного градуировочного раствора, доводят объем раствора внутренним градуировочным раствором до метки и перемешивают.
Градуировочный раствор №4 с концентрацией пропилацетата около 0,0222 мг/мл, 2-фенилэтанола около 0,153 мг/мл, этилового спирта 0,18 мг/мл, этилацетата около 0,06 мг/мл и бензилового спирта 0,24 мг/мл: в мерную колбу на 50 мл вносят 10 мл исходного градуировочного раствора, доводят объем раствора внутренним градуировочным раствором до метки и перемешивают.
Пробоподготовка. Около 100 мг препарата вносят в мерную колбу на 10 мл, прибавляют 7 мл внутреннего градуировочного раствора и обрабатывают ультразвуком 10-15 минут для полного растворения препарата. Колбу выдерживают при комнатной температуре до достижения термического равновесия. Прибавляют в колбу внутренний градуировочный раствор до метки и перемешивают.
Раствор холостого опыта. В качестве раствора холостого опыта используют N,N-диметилформамид.
Для проверки пригодности хроматографической системы последовательно в колонку хроматографа вводят по 3 мкл растворов в соответствии с таблицей 3:
На основании хроматограмм градуировочного раствора 3 вычисляют:
– коэффициент асимметрии пиков этилового спирта (T1), этилацетата (T2) и пропилацетата (T3);
- коэффициент разрешения пика этилового спирта и пика этилацетата (R1)
– коэффициент разрешения пика этилацетата и пропилацетата (R2);
– относительное стандартное отклонение отношения площадей пиков этилового спирта и этилацетата к площади пика пропилацетата (S1 и S2, соответственно).
Хроматографическая система считается пригодной, если T1 не более 2%, T2 не более 2%, T3 не более 2 %, R1 не менее 1,5%, R2 не менее 1,5%, S1 не более 2% и S2 не более 2%.
На хроматограммах раствора холостого опыта должны отсутствовать пики, перекрывающиеся с пиками этилового спирта и этилацетата.
На основании хроматографирования градуировочных растворов строят калибровочный график зависимости отношения площади пика этилацетата к площади пика внутреннего градуировочного раствора от относительной концентрации этилацетата в соответствующем растворе. Коэффициент корреляции полученной прямой должен быть не менее 0,995.
Затем трижды хроматографируют испытуемую пробу, результаты усредняют. Концентрация этилацетата (этилового спирта) в препарате (X) в процентах по массе определяют по формуле
Определение бензилового спирта
Определение остаточного количества бензилового спирта в лекарственном препарате диклофенака на основе полимерных микрочастиц определяют методом ГЖХ с помощью хроматографа, состоящего из кварцевой капиллярной колонки размером 30 м х 0,53 мм, нанесённой стационарной фазой типа Restek Rtx – 1301 (6 % цианопропилфенил; 94% диметилполисилоксан) с толщиной 3 мкм и пламенно-ионизационного детектора. В качестве газа – носителя используют гелий. При анализе газ – носитель подают в колонку при постоянном давлении 34,5 кПа. Пробу вводят в устройство ввода пробы при режиме деления потока с коэффициентом деления 40:1 и температуре 230 С. Температуру хроматографической колонки регулируют термостатом в градиентном режиме со скоростью 30 С/мин. Начальная температура колонки составляет 190 С (выдержка при данной температуре составляет 5 минут), конечная температура - 240 С (выдержка при данной температуре составляет 3 минут). В детектор подают водород с потоком 40 мл/мин, воздух - 400 мл/мин и гелий - 30 мл/мин. Температура в детекторе составляет 250 С. Анализ проводят в течение 10 минут с объемом анализируемой пробы 1 мкл.
Методика:
Приготовление раствора внутреннего градуировочного, градуировочных растворов, испытуемой пробы и холостого раствора описано выше в разделе определения этилового спирта и этилацетата. Для проверки пригодности хроматографической системы вводят по 3 мкл растворов в соответствии с таблицей 4.
На основании хроматограмм градуировочного раствора 3 вычисляют:
– коэффициент асимметрии пиков бензилового спирта T1 и 2- фенилэтанола T2;
– коэффициент пика бензилового спирта и 2 - фенилэтанола (R);
– относительное стандартное отклонение отношения площадей пика бензилового спирта к площади пика 2 - фенилэтанола (S).
Выбор оптимальных условий получения полимерных микрочастиц на основе СМГК, содержащих инкапсулированный диклофенак
Представленные в литературе данные о результатах экспериментов по инкапсулированию натриевой соли (2-(2,6-дихлоранилино) фенилуксусной кислоты (диклофенака натрия) в микрочастицы из сополимера молочной и гликолевой кислот свидетельствуют о малой пригодности такого подхода для создания пролонгированного препарата. Полученные микрочастицы характеризовались высокой скоростью высвобождения диклофенака натрия из микрочастиц. Так при выдержке микросфер в фосфатный буферный раствор в первые 4 часа высвобождалось около 80% диклофенака натрия [64].
В связи с этим из диклофенака натрия нами была получена свободная (2-(2,6-дихлоранилино) фенилуксусная кислота (диклофенак), изучен процесс инкапсулирования диклофенака в микрочастицы, исследованы физико-химические свойства полученных микрочастиц и возможность их использования для создания пролонгированного препарата.
Получение диклофенака было осуществлено обработкой водного раствора диклофенака натрия раствором соляной кислоты (Рисунок 3) с последующей промывкой полученного осадка диклофенака водой и высушиванием.
Подробная методика получения диклофенака описана в разделе 2.3.2.
Полученный диклофенак представляет собой порошок белого цвета, практически нерастворимый в воде, растворимый в этилацетате и хорошо растворим в бензиловом спирте (Таблица 5). Температура плавления диклофенака - 180 С.
В ИК спектре (Рисунок 4) наблюдаются характерные полосы поглощения, отвечающие валентным колебаниям NH-группы при 3340 и 3320 см-1, колебаниям НО- при 3100-3500 см-1 и колебаниям С=О при 1700 см-1 в карбоксильной группе.
В ЯМР спектре (Рисунок 5) наблюдаются характерные сигналы протонов карбоксильной группы -12.66 м.д., -NH группы – 7.22 м.д. семи ароматических протонов в области 6.3-7.53 м.д. и синглета -СН2-группы при 3.7 м.д.
Методом ВЭЖХ анализа установили, что содержание и характер примесей в полученном диклофенаке аналогичны для исходной субстанции диклофенака натрия (Рисунок 6).
Получение микрочастиц было осуществлено методом одинарного эмульгирования органического раствора диклофенака и СМГК (дисперсная фаза) в водной дисперсионной среде с последующей экстракцией/испарением органических растворителей [18].
В качестве растворителей для приготовления дисперсной фазы были использованы этилацетат и бензиловый спирт, которые мало смешиваются с водой, обладают хорошей взаимной растворимостью, а их смесь способна хорошо растворять диклофенак и СМГК. Соотношения диклофенака и СМГК в дисперсной фазе составляло 0,6/1 г/г, тогда как соотношение бензилового спирта и этилацетата – 2,4/7 мл/мл
В качестве дисперсионной среды для эмульгирования при получении полимерных микрочастиц, часто применяют водный раствор поливинилового спирта (0,5-2%) или его смесь с метилцеллюлозой [13]. Нами в качестве дисперсионной среды был использован водный раствор, содержащий смесь поливинилового спирта (1,5% масс./масс.) и метилцеллюлозы (2% масс./масс.)[12].
Мы изучили процесс образования полимерных частиц при различных условиях эмульгирования, которое осуществлялось с использованием ультразвукового диспергатора, высокоскоростного гомогенизатора и верхнеприводной лопастной мешалки.
Для созревания полученные дисперсии микрочастиц смешивали с пятикратным количеством воды охлаждённой до 10 С (среда созревания) и выдерживали при перемешивании в течение 8 часов, позволяя дисперсии нагреться до температуры окружающей среды (18-20 С), после чего суспензию концентрировали центрифугированием в течение 15 мин при 8000 об/мин, удаляли надосадочную жидкость, промывали водой при температуре 20С в течение 1 часа, повторно концентрировали центрифугированием, лиофильно высушивали и анализировали.
На основании полученных данных о распределении микрочастиц по размерам, содержания в них диклофенака, степени его включения, выходу микрочастиц и скорости высвобождения из них диклофенака в эксперименте in vitro, были выбраны условия для получения микрочастиц, пригодных для создания пролонгированной лекарственной формы.
Использование ультразвукового гомогенизатора (Таблица 6, Рисунок 7) и высокоскоростного диспергатора (Таблица 7, Рисунок 8) позволило получить с выходом около 80 % полимерные микрочастицы, имеющие достаточно близкие средний размер и другие характеристики. В связи с тем, что данные микрочастицы имели высокую скорость высвобождения диклофенака в среду растворения, более 80% за первые сутки, их использование для создания пролонгированного препарата невозможно.
Исследование стабильности препарата «Диклофенак пролонгированного действия»
Условия хранения разработанной лекарственной формы были выбраны на основе данных об условиях хранения зарегистрированных лекарственных препаратов содержащие полимерные микрочастицы, например, «Соматулин» (Beaufour Ipsen International, Франция) и «Вивитрол» («Джонсон & Джонсон»). Данные препараты предписано хранить в холодильнике при 2–8C.
Результаты исследования стабильности при хранении показали, что отсутствуют изменения показателей качества лекарственного препарата диклофенака в течение двух лет (таблица 24).
Для разработанной инъекционной ЛФ «Диклофенак пролонгированного действия» проведено исследование острой токсичности разработанного препарата (Приложение 6). Острую токсичность оценивали на мышах (самках). Распределение по группам проводили рандомизированно. В качестве критерия принимали массу тела. Препарат вводили животным внутрижелудочно в дозах: 300 мг/кг и 2000 мг/кг. Дозы рассчитывали индивидуально для каждого животного по массе тела. ЛД50 для мышей при пероральном введении составляет 170 мг/кг, исходя из этого, уровень начальной дозы был выбран 300 мг/кг.
За животными наблюдали в течение 15 суток. Результаты токсометрии показали, что препарат в условиях однократного внутрижелудочного введения оказал дозозависимое токсическое действие на организм лабораторных животных (мышей). Гибель животных была зафиксирована при введении первоначальной дозы 300 мг/кг.
Разработана и валидирована методика количественного определения диклофенака в полимерных микрочастицах.
В соответствии с ОФС «Лиофилизаты», ОФС «Лекарственные формы для парентерального применения», ОФС «Суспензии» ГФ ХIV установлены показатели и нормы качества, необходимые для стандартизации новой лекарственной формы диклофенака по показателям: описание, подлинность, значение pH, вода, размер частиц, однородность дозирования, проходимость через иглу, седиментационная устойчивость, вязкость, высвобождение, остаточные органические растворители, родственные примеси, пирогенность, стерильность и количественное определение.
Изучена безопасность и стабильность разработанной лекарственной формы диклофенака. Полученные результаты показали, что отсутствуют изменения показателей качества в течение двух лет хранения в естественных условиях.