Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Обзор литературы 12
1.1 Пероксидаза из растительного сырья: структура, свойства и применение 12
1.1.1 Строение и механизм действия пероксидаз 12
1.1.2 Влияние кальция в структуре на активность пероксидаз 14
1.1.3 Свойстваи области применения пероксидаз 14
1.1.4 Источники и технологии получения растительных пероксидаз 17
1.2 Получение ферментов 20
1.2.1 Селективные сорбенты для выделения белков 20
1.2.2 Методы выделения и очистки белков 25
1.2.3 Хроматографические методы 26
1.3 Современные подходы к созданию модифицированных форм ферментов .29
1.3.1 Носители для иммобилизации 30
Глава 2 Материалы и методы исследования 39
2.1 Материалы исследования 39
2.1.1 Растительная пероксидаза 39
2.1.2 Физико-химические характеристики применяемых сорбентов 39
2.1.3 Носители для иммобилизации 42
2.1.4 Свойства хлоргексидина биглюконата 44
2.1.5 Структура и свойства гентамицина и азитромицина 44
2.1.6 Структура и свойства нипагина 45
2.1.7 Структура и свойства нипазола 46
2.1.8 Свойства альгината натрия 46
2.1.9 Свойства карбопола 47
2.1.10 Устройство и технические характеристики установки Vivaflow фирмы Sartorius Stedim Biotech для ультрафильтрации в тангенциальном режиме 47
2.2 Методы исследования 49
2.2.1 Определение концентрации белка по методу Лоури з
2.2.2 Метод определения ферментативной активности пероксидазы по пирогаллолу 51
2.2.3 Определение концентрации гентамицина 53
2.2.4 Подготовка сорбентов к работе 54
2.2.5 Гельхроматографический метод определения молекулярной массы белков 55
2.2.6 Методика постановки опытов по изучению кинетики диффузии через пористые мембраны 57
2.2.7 Методы работы с ультрафильтрационной мембранной установкой Vivaflow200 59
2.2.8 Методика определения активности пероксидазы в геле 61
2.2.9 Определение цветности раствора 61
2.2.10 Подготовка растительного сырья 64
2.2.11 Методика проведения процесса экстрагирования 64
2.2.12 Деминерализация экстрактов 65
2.2.13 Депигментация экстрактов 65
2.2.14 Определение рН оптимум сорбции в статических условиях 66
2.2.15 Изучение специфичности пероксидазы из корнеплодов редьки черной 66
2.2.16 Изучение влияния носителей и эксципиентов на активность пероксидазы 67
2.2.17 Изучение влияния носителей на активность пероксидазы в комплексе с антибиотиком 68
2.2.18 Микробиологические методы исследования 68
2.2.19 Математические методы обработки результатов 69
Глава 3 Условия сорбционно-хроматографического выделения и очистки пероксидазы из экстрактов с последующим концентрированием полученных элюатов на мембранных модулях 71
3.1 Исследование экстрактов из корней хрена и корнеплодов редьки черной, содержащих пероксидазу 71
3.1.1 Подбор условий экстрагирования пероксидазы из растительного сырья 71
3.1.2 Кинетика стабильности пероксидазы в экстрактах 73
3.1.3 Исследование зависимости активности пероксидазы от рН и температуры 74
3.1.4 Гельхроматографический анализ исходного экстракта 76
3.2 Изучение процесса депигментации экстракта на различных анионитах в динамических условиях 78
3.2.1 Гельхроматографический анализ депигментированного экстракта 82
3.3 Исследование рН оптимум сорбции в статических условиях 84
3.4 Исследование процесса сорбции пероксидазы на различных сорбентах в статических условиях 87
3.5 Подбор условий выделения и очистки пероксидазы из экстрактов в динамических условиях 93
3.6 Гельхроматографический анализ элюата, полученного после процесса десорбции 100
3.7 Подбор мембран для концентрирования элюата, содержащего пероксидазу 102
3.8 Изучение специфичности пероксидазы из корнеплодов редьки черной... 104
3.9 Сравнительная характеристика физико-химических свойств пероксидаз из различного растительного сырья 108
Глава 4 Разработка фармацевтической композиции с модифицированной пероксидазой 111
4.1 Исследование активности пероксидазы из корнеплодов редьки черной при модификации различными носителями 111
4.1.1 Влияние антибиотиков гентамицина, азитромицина и антисептика хлоргексидина биглюконата на активность пероксидазы 111
4.1.2 Изучение влияния а, Р и у циклодекстринов на активность пероксидазы из корнеплодов редьки черной 113
4.1.3 Изучение влияния р - циклодекстринов на активность пероксидазы в комплексе с антибиотиком 116
4.1.4 Изучение процесса связывания фермента с антибиотиком и циклодекстринами 117
4.2 Разработка состава фармацевтической композиции в виде геля 118
Заключение 127
Список сокращений и условных обозначений 129
Список литературы
- Источники и технологии получения растительных пероксидаз
- Устройство и технические характеристики установки Vivaflow фирмы Sartorius Stedim Biotech для ультрафильтрации в тангенциальном режиме
- Гельхроматографический анализ исходного экстракта
- Влияние антибиотиков гентамицина, азитромицина и антисептика хлоргексидина биглюконата на активность пероксидазы
Источники и технологии получения растительных пероксидаз
К настоящему времени изучены пероксидазы хрена, сои, дыни, картофеля, брюссельской капусты, ячменя, брюквы, апельсина, полыни, плодов перца, моркови, табака, люцерны, ростков пшеницы, огурца, зелёной груши, плодов папайя, верблюжьей колючки, редиса, шпината, мякоти кокоса, риса, хлопка, арахиса, томата, клубники и пальмы [2, 9, 21, 22]. При этом единственным промышленным источником выделения пероксидазы является корень хрена.
Компания «ВВІ Enzymes» - один из крупнейших мировых производителей природных ферментов, полученных из растительных и животных тканей (компания расположена в Кейптауне, Южной Африке). Ежегодно «ВВІ Enzymes» продает более 10 миллиардов единиц пероксидазы из корней хрена (метод измерения по гваяколу). Пероксидазу из корней хрена впервые извлекли и очистили в Лабораториях «Seravac» (сегодня «ВВІ Enzymes») в 1958 году. С тех пор компания «ВВІ Enzymes» являлась массовым производителем пероксидазы из корней хрена в течение 53 лет [138].
Существующая технология производства пероксидазы из корней хрена компанией «ВВІ Enzymes» и возможная оптимизация методов выделения и очистки представлены в работе Almero Barnard [138]. Оригинальный метод производства пероксидазы из корней хрена в компании «ВВІ Enzymes» разделяют на первичные и вторичные процессы. Первичные процессы включают размачивание корней хрена и извлечение фермента из растительного сырья. Отработанное сырье отделяют центрифугированием, супернатант очищают, используя кизельгур. Очищенный экстракт концентрируют ультрафильтрацией на мембране с отсекающей молекулярной массой 10 кДа [138].
Вторичные процессы начинают с солевого фракционирования, снижающего концентрацию балластных белков. Ионную силу полученного раствора уменьшают диализом. Раствор пероксидазы из корней хрена очищают сериями ионнообменной и гидрофобной хроматографии. Конечный продукт -обессоленный лиофилизированный порошок [138]. «ВВІ Enzymes» сотрудничает с производителями хрена и в Северном, и в
Южных полушариях, дающих непревзойденную круглогодичную поставку специально отобранных и культурных корней. Завод в Южной Африке обрабатывает по две тонны корней в день, позволяя производить мульти килограммовые партии пероксидазы из корней хрена сорта клинической химии и мульти - стограммовые партии иммунохимического сорта [139]. В течение многих десятилетий компания «Sigma-Aldrich» производит пероксидазу мультикилограммовыми партиями. За этот промежуток времени они непосредственно сотрудничали с производителями специально отобранных и культурных корней хрена и непрерывно осуществляли совершенствование процесса, что гарантирует качество [140].
Пероксидаза компании «Sigma-Aldrich» признана во всем мире промышленным стандартом для диагностического производства и применения в исследованиях лабораторного масштаба. «Sigma-Aldrich» предлагает разнообразие продуктов, основанных на чистоте, содержании изоформ и ковалентных модификациях [140].
В настоящее время актуальным является поиск альтернативного источника получения пероксидазы в промышленных условиях [23, 24, 141].
В качестве промышленного объекта интерес представляет пероксидаза сои ввиду высокой термостабильности, стабильности при низких значениях рН и высокой реакционной способности. В своей статье Федулов А.Л., Спиридович Е.В. и Рахманько Е.М. представили результаты по разработке возможной методики получения пероксидазы из оболочек семени сои [25]. Предложенная методика включает в себя водную экстракцию, обработку спирто-хлоформной смесью, постадийное фракционирование сульфатом аммония и этиловым спиртом. В результате получен лиофильно высушенный порошок пероксидазы сои с активностью 276 ЕД/мг (по ABTS) и RZ 0,9 [25].
На ряду с пероксидазой сои высокой термостабильностью обладают пероксидазы пальм, выделенные И.Ю. Сахаровым [21, 26, 141]. В диссертационной работе Алпеева Инна Сергеевна разработала метод выделения и очистки пероксидазы из кожуры клубней батата, включающий в себя экстрагирование, депигментацию, гидрофобную хроматографию на колонке с Сефарозой, ионообменную хроматографию на ДЭАЭ-тоеперле; провела сравнительный анализ пероксидаз из батата, сои и пальмы [27]. Сотрудниками института ботаники АН Казахстана разработан метод выделения пероксидазы из листьев полыни [8]. Описано получение пероксидазы чайного листа [28]. Процесс экстрагирования пероксидазы из корнеплодов редьки черной и механизм сорбции на подложках различной природы в своих работах исследует Вяткина О.В. [24, 29].
На основании проведенного анализа литературных источников и патентных технологий [30, 31, 32] составили типовую технологическую схему получения пероксидазы. Типовая технологическая схема (рисунок 1.3) получения пероксидазы из промышленного источника - корней хрена состоит из стадий измельчения, экстракции, ультрафильтрации, осаждения, гель-фильтрации, гидрофобной хроматографии, диализа и лиофилизации. Недостатками подобных технологий являются длительность процесса (от 3 до 11 суток), связанная с многостадийностью, низкий выход фермента (менее 3 г с 1 кг сырья). Недостатком представленной схемы также является использование смол на основе Сефарозы/целлюлозы, что непрактично в крупномасштабном производстве фермента из-за низкой пропускной способности, стоимости матрицы, низкой рН-стабильности и их относительно короткого жизненного цикла, который может быть всего 20-30 производственных циклов.
Устройство и технические характеристики установки Vivaflow фирмы Sartorius Stedim Biotech для ультрафильтрации в тангенциальном режиме
В работе исследовали пероксидазу, выделенную из корней хрена (Armoracia rusticana) и корнеплодов редьки черной (Raphanus sativus). Основные физико-химические свойства ферментов получены экспериментально, и часть взята из литературных источников [2, 8, 13, 162] (Глава 3, таблица 3.9).
Для изучения процесса депигментации растительных экстрактов в работе использовали аниониты, характеристика которых представлена в таблице 2.1. Показано, что они обладают высокой обменной ёмкостью в диапазоне рН от 0 до 12-14, термической и химической стабильностью, легко регенерируются [38]. Таблица 2.1- Аниониты, используемые для депигментации КУ-23 представляет собой макропористый сильнокислотный полистирол-дивинилбензольный сульфированный сополимер-катионит. Обладает большой удельной поверхностью 300 - 400 м7г ионита. Сшивающего агента дивинилбензола содержится около 15-20 %. Отличительные свойства катионита: малая набухаемость, высокая проницаемость для крупных органических молекул, устойчивость структуры в широком диапазоне значений рН, высокая обменная ёмкость [6, 37]. Сверхсшитый сулъфокатионит С-150
Стиросорб - сверхсшитый макропористый (изопористый) сульфокатионит на основе стирола с дивинилбензолом. Получают не традиционным путем сополимеризации мономера сшивающим агентом, а сшиванием макроцепей стирола, находящихся в растворе в набухшем состоянии бифункциональными соединениями, образующими в конечной сетке мостики жесткой структуры. Такой подход позволяет получать контролируемое число сшивок [163].
Макропористый неионогенный сорбент Полисорб-1 Полисорб-1 - неионогенный стирол-дивинилбензольный сополимер макропористой структуры отечественного производства. Обладает высокой стойкостью к кислотам, щелочам и окислителям, термостабильностью и осмотической стабильностью. Макропористая структура обеспечивает хорошую кинетику ионного обмена, а также улучшенную диффузию во внутрь и из частиц. Широко используют в газовой хроматографии и для выделения многих органических веществ, в том числе и лекарственных (например, для выделения цефалоспориновых антибиотиков) [6, 36]. Таблица Физико-химические свойства сорбентов нкюои Функциональная группа Насыпной вес,г/мл Средний радиус зерна, мкм Средний диаметр пор, Е Удельная поверхность, м2/г кГ)о Тип полимерной матрицы
ДМЭГ представляет собой сополимер метакриловой кислоты с этиленгликольдиметакрилатом - длинноцепочечным сшивающим агентом. Сорбент гелевой структуры, с хорошей набухаемостью. Одна из особенностей сорбента - высокая степень проницаемости по отношению к различным ионам крупных органических веществ. Карбоксильные катиониты БДМ-18 и БДМ-24 Карбоксильные катиониты на основе метакриловой кислоты и ДМЭГ. Представляют собой молекулярно импринтированные сорбенты синтезированные в ИВС РАН. Молекулярный импринтинг представляет собой способ получения синтетических полимеров-носителей, в которых имеются специфические центры связывания, обладающие высокой селективностью по отношению к целевой молекуле [99].
Сулъфокатионит гелевого типа КУ-2-20 КУ-2-20 представляет собой полистирол-дивинилбензольный сульфированный сополимер-катионит гелевого типа. Содержит 20 % сшивающего агента дивинилбензола. КУ-2-20 - сорбент с жёстким каркасом, действует как «ионитовое сито». Применяется для очистки растворов антибиотиков от минеральных солей (деминерализации) и для очистки растворов гальванических производств [6].
В качестве носителей для иммобилизации пероксидазы использовали цикло декстрины (производства Xian Hong Chang Pharmaceuticals Co., Ltd.) и молекулярно импринтинговые полимерные наночастицы (МИП НЧ, Крэнфилдский Университет, Великобритания).
На сегодняшний день циклодекстрины производят высокоселективным ферментативным синтезом. Специфическое соединение глюкозных единиц обеспечивает циклодекстрину жесткую коническую структуру с внутренней полостью специфического объема [13, 100]. МИТІ НЧ получали матричным синтезом на базе Крэнфилдского Университета (Cranfield University, UK). Являются специфическими рецепторами для иммобилизации ферментов. Размер 70 нм (определяли при 25 С, используя DLS Zetasizer Nano (Nano-S) from Malvern Instruments Ltd (Malvern, UK)), концентрация в растворе 0,1 мг/мл (рисунок 2.1).
Электронная микроскопия МИП НЧ Синтезировали МИП НЧ с использованием нового подхода, который включает в себя иммобилизацию ферментного образца (матрицы) на твердой фазе, а последующий синтез полимера выступает в роли аффинной основы для отделения высокоаффинных фракций наночастиц [13, 164]. Этот подход учитывает быстрый синтез, контролируемое отделение и очистку высокоафинных (близкородственных) веществ с одним производственным циклом продолжительностью 2,5 часа. В зависимости от метода иммобилизации (случайный или направленный, с защищенным активным центром), используемого во время импринтинга, включение свободного фермента в МИП НЧ приводит либо к его ингибированию, либо к стабилизации (ингибирования не наблюдается). МИП НЧ можно рассматривать как искусственные эквиваленты естественных рецепторов/антител [165-168].
К стеклянным шарикам (d=45-90MKM), прошедшим предварительную обработку, добавляли толуол и аминопропилтриметоксисилан. Смесь оставляли на несколько часов при комнатной температуре. После этого добавляли фосфатный буфер (рН=7,2) и глутаровый альдегид. Реакция протекала в течение суток при температуре 0-5С, после чего смесь промывали водой, добавляли раствор фермента и снова оставляли на сутки. По истечении этого времени снова промывали водой и добавляли полимеризационную смесь. Реакция полимеризации протекала в течение нескольких часов при комнатной температуре. Затем проводили элюцию наночастиц водой. Получили водный раствор с концентрацией наночастиц 0,1 мг/мл.
В качестве антисептика в работе использовали хлоргексидина биглюконат (рисунок 2.2) раствор 0,05 % 100 мл, производитель ООО «Росбио», Россия. Хлоргексидин - местное антисептическое средство, оказывает бактерицидное действие на грамположительные и грамотрицательные бактерии, не действует на вирусы и споры [101, 102].
Гельхроматографический анализ исходного экстракта
Как видно из данных, представленных в таблице 3.3, на всех сорбентах, кроме Purolite С150, сорбция идет с выходом в пределах от 60 до 97 %. Однако десорбция с достаточным выходом возможна лишь на КУ-23 (87%). При десорбции на Полисорбе-1 в состав элюента входит ацетон, который может оказывать ингибирующее действие на активность фермента. Для сильных катионитов как, например, КУ-23 присутствие ионов кальция не сказалось на выходе по десорбции, которую проводили с помощью сдвига рН. А на карбоксильных катионитах ДМЭГ И БДМ-18 наблюдается необратимость сорбции в этих же условиях. Увеличение ионной силы (добавление NaCl) не дает результата. Несмотря на регулярность режима сорбции (Х 0,35) на карбоксильных катионитах, высокую емкость и коэффициент распределения (для ДМЭГ 84 мл/г, для БДМ-18 170 мл/г), десорбция не может быть достигнута. Поэтому для разработки технологии выделения, очистки и модификации пероксидазы использовали сильный макропористый сульфокатионит КУ-23.
Гельхроматографический анализ элюата, полученного после процесса десорбции Для оценки эффективности сорбционной очистки была проведена гельхроматография элюата, полученного после проведения сорбционного процесса на КУ-23, по методике, описанной в разделе 2.2.5. Экспериментальные данные представлены на рисунках 3.19 и 3.20.
Гельхроматограмма элюата пероксидазы из корней хрена Как видно из данных, представленных на рисунках 3.19 и 3.20, положение максимумов по активности пероксидазы (Vi-V0)/VKO]I = 0,28 (хрен), (Vi-V0)/VKO]I = 102 0,45 (редька) и по общему белку (Vi-Vo)/VK(M = 0,3 (хрен), (Vi-Vo)/VK(M = 0,45 (редька), что соответствует молекулярной массе около 20000 Да по калибровочной кривой (раздел 2.2.5), сместилось в сравнении с гельхроматограммами исходных экстрактов [3, 6, 13]. Методом электрофореза найдены молекулярные массы отдельных фракций пероксидазы: 26000±1100, 45000±1200, 52000±1100 Да [8]. Молекулярная масса зависит от степени чистоты образца фермента. На основании этого можно сделать предположение о том, что в ходе проведенной сорбционной очистки удалось выделить низкомолекулярную фракцию пероксидазы. Удельная активность пероксидазы из корнеплодов редьки черной в элюате превосходит в 10 раз удельную активность пероксидазы в исходном экстракте [6, 118, 119]. Удельная активность пероксидазы из корней хрена в элюате превосходит в 2 раза удельную активность пероксидазы в исходном экстракте. Цветность раствора изменилась от Y3 до Y5, раздел 2.2.9.
Подбор мембран для концентрирования элюата, содержащего пероксидазу Исследование ультрафильтрации элюата, содержащего пероксидазу, из корнеплодов редьки черной с использованием мембран с номинальным отсечением по молекулярной массе 5, 30 и 50 кДа Эксперименты проводили с использованием трех модулей с полиэфирсульфоновыми мембранами, различающимися между собой по указанным в каталоге фирмы-производителя «Sartorius Stedim Biotech» номинальным отсечениям по молекулярной массе: 50, 30 и 5 кДа, физико-химические характеристики которых представлены в разделе 2.1.9. Работу на установке проводили в соответствии с методикой, представленной в разделе 2.2.7.
После проведения опыта определяли концентрацию общего белка и активность фермента в концентрате и фильтрате по методикам, описанным в разделах 2.2.1 и 2.2.2. В таблицах 3.5, 3.6 и 3.7 представлены экспериментальные данные. Из данных, представленных в таблице 3.5 видно, что активность фермента присутствует в концентрате и в фильтрате, что объясняется слишком большим диаметром пор мембраны, вследствие чего пероксидаза переходит в фильтрат. Концентрирования не произошло. По всей вероятности, это связано с тем, что пероксидаза в данной области концентраций не склонна к образованию ассоциатов, которые могли бы быть задержаны мембраной с отсечением по молекулярной массе 50 кДа.
На основании полученных экспериментальных данных можно сделать вывод, что для концентрирования элюата, содержащего пероксидазу из корнеплодов редьки черной целесообразно применять ультрафильтрационный модуль с отсекающей способностью 30 кДа, так как при его использовании концентрирование раствора по общему белку происходит в 2,23 раза, по активности в 1,43 раза, что выше, чем при использовании для ультрафильтрации модуля с отсекающей способностью 5 кДа, а также наблюдается нулевая активность пероксидазы в фильтрате [13]. Цветность раствора изменилась от Y5 до Y3, раздел 2.2.9.
Для деминерализации концентрированного раствора использовали ультрафильтрационный модуль с отсекающей способностью 5 кДа с проведением последовательно ультрафильтрации и диафильтрации (остаточная концентрация соли не более 2%).
Расчет константы Михаэлиса - Мэнтен для пероксидазы из корнеплодов редьки черной проводили методом «двойных обратных величин». Метод «двойных обратных величин» Лайнуивера-Берка заключается в построении графика зависимости обратных величин скорости реакции и концентрации субстрата. При пересечении прямой оси ординат и абсцисс находятся обратные значения максимальной скорости и константы Михаэлиса - Мэнтен. Полученные данные представлены на рисунке 3.22.
По методике, описанной в разделе 2.2.15, изучали кинетические параметры окисления пирогаллола при различном рН и t, а также при изменении концентрации пероксида водорода в реакционной смеси. Расчетные данные для пероксидазы из корнеплодов редьки черной (п.р.ч.) и пероксидазы из корней хрена (п.х.) представлены в таблице 3.8. Как видно из данных, представленных в таблице 3.8, пероксидазы, выделенные из разных растительных источников, имеют небольшую разницу в значениях Vmax и Кт. Чем меньше Кт, тем больше сродство фермента к данному субстрату [123]. По значениям кинетических характеристик можно сделать вывод, что пероксидаза из корней хрена имеет большее сродство к пирогаллолу, выбранному в качестве субстрата, чем пероксидаза из корнеплодов редьки черной, при этом они имеют одинаково высокое сродство к пероксиду водорода, как окислителю.
Влияние антибиотиков гентамицина, азитромицина и антисептика хлоргексидина биглюконата на активность пероксидазы
Как видно из данных, представленных на рисунке 4.4, добавление Р-циклодекстринов к комплексу антибиотик/пероксидаза р.ч. позволяет увеличить активность пероксидазы в 1,4 раза [172]. В виду уникальных свойств гентамицина: термостабильность при высоких температурах и широкий спектр бактерицидного действия, его использовали в дальнейшей работе для создания комплекса с пероксидазой [127]. Для создания фармацевтической композиции использовали тройной комплекс пероксидазы из корнеплодов редьки черной, гентамицина и Р-циклодекстринов (в весовом соотношении 1:0,33:2).
Можно предположить, что влияние гентамицина и циклодекстринов на активность пероксидазы из корнеплодов редьки черной происходит вследствие связывания антибиотика с ферментом и комплекса гентамицин/фермент с циклодекстрином. Чтобы подтвердить это была исследована кинетика диффузии пероксидазы через пористую мембрану [127].
Эксперименты проводили на специальных ячейках по методике, представленной в разделе 2.2.6. Камеру №1 заполняли исследуемым раствором: комплекс гентамицин/пероксидаза или комплекс/циклодекстрины, камера №2 -фосфатным буферным раствором с рН=6,0. Параллельно для каждого опыта ставили контроль, в роли которого выступал раствор пероксидазы из корнеплодов редьки черной в фосфатном буфере с той же концентрацией, что и в опытной ячейке. Экспериментальные данные представлены на рисунке 4.5.
Как видно из данных, представленных на рисунке 4.5, кинетическая кривая антибиотик/фермент проходят ниже кинетической кривой чистого раствора пероксидазы из корнеплодов редьки черной, что говорит о возможном образовании ассоциатов. Кинетическая кривая комплекс/цикло декстрин проходит ниже кинетической кривой чистого раствора пероксидазы из корнеплодов редьки черной и ниже кинетической кривой антибиотик/фермент, 118 что подтверждает наличие связывания фермента с антибиотиком и цикло декстрином. В камере №1 количество свободной пероксидазы уменьшилось, соответственно, резко снизилась и скорость проникновения ее через мембрану в камеру №2, то есть произошло уменьшение угла наклона кривой к оси X. Чем меньше угол наклона кривой, тем больше происходит связывание в комплекс.
Расчеты показали, что процент связывания пероксидазы из корнеплодов редьки черной с гентамицином составил 33 %, а пероксидазы с гентамицином и циклодекстринами 67 %.
Практически все фармацевтические композиции содержат в своем составе вспомогательные вещества (эксципиенты). Определенный набор эксципиентов оказывает влияние на фармакокинетику, фармакодинамику и качество фармацевтической композиции. Все эксципиенты должны быть разрешены к применению соответствующей нормативной документацией [128, 129, 130].
При создании фармацевтической композиции необходимо подобрать оптимальные весовые соотношения фермент/компонент, так как известно, что ферменты являются лабильными веществами и могут терять активность при взаимодействии с высокомолекулярными и низкомолекулярными вспомогательными веществами.
К наиболее применяемым в сфере фармации и медицины готовым формам относят такие мягкие лекарственные формы, как гели. Гели способствуют легкому высвобождению активного компонента, что приводит к увеличению терапевтического эффекта. Они образуют на поверхности кожи пленку, обеспечивающую пролонгированное действие активного компонента. Кроме этого, они стабильны при хранении [128, 129, 130].
В предыдущем разделе подобраны оптимальные весовые соотношения компонентов и условия для образования тройного комплекса, при которых активность пероксидазы сохраняется полностью. На основе полученных данных пероксидазы из корнеплодов редьки черной Как видно из данных, представленных на рисунке 4.6, при весовом соотношении карбопол/фермент 0,5/1 и более наблюдается инактивирование пероксидазы - активность пероксидазы на 90% ниже исходной. При весовом соотношении альгинат натрия/фермент 2/1, 4/1 и 8/1 наблюдается инактивирование пероксидазы на 22%, а при весовом соотношении 12/1 и более наблюдается снижение активности пероксидазы на 18% по сравнению с исходной. На основании полученных результатов исключается возможность использования карбопола в составе фармацевтической композиции. Поэтому в качестве гелеобразователя выбрали альгинат натрия в весовом соотношении с пероксидазой 12/1.
Основным преимуществом применения природных эксципиентов является биологическая безвредность. Но при этом есть и существенный недостаток: микробная контаминация, которая обуславливает обязательное добавление антимикробных веществ (консервантов) [128, 129, 130].
В качестве консервантов для включения в состав фармацевтической композиции выбрали нипагин и нипазол. Наиболее эффективным является применение консервантов в весовом сотношении нипагин/нипазол от 2/1 до 4/1 при концентрации не более 0,8% от массы фармацевтической композиции [107]. Экспериментальные данные представлены на рисунке 4.7.
Как видно из данных, представленных на рисунке 4.7, оба консерванта оказывают инактивирующее действие на пероксидазу. При весовом соотношении нипазол/фермент 0,086/1 активность пероксидазы на 16% ниже исходной. При весовом соотношении нипагин/фермент 0,26/1 и более наблюдается снижение активности пероксидазы на 17% по сравнению с исходной.
На основании полученных результатов подобрали весовое сотношение нипагин/пероксидаза 0,26/1, нипазол/пероксидаза 0,086/1 при весовом соотношении нипагин/нипазол 3/1 и их концентрации 0,2% от массы геля.
Изменение содержания любого компонента в сторону уменьшения ведет к дестабилизации системы, что проявляется в помутнении геля, падении его вязкости. Увеличение концентрации компонентов ведет к увеличению вязкости геля, что затрудняет нанесение препарата на кожу и его экструзию из туб.
Получены опытные образцы, которые заложили на хранение. Разработанный гель расфасовывали по 15 г в тубы алюминиевые с мембраной по ТУ 9467-004-32807885-2008, ТУ У 28.7-25463020-006-2003, ТУ У 28.7-32030717-001-2008 с внутренним лаковым покрытием (допуски по объему ± 5 %).
Для оценки стабильности пероксидазы в составе фармацевтической композиции разработали методику определения активности пероксидазы в геле (раздел 2.2.8) [172]. По этой методике определяли активность пероксидазы в геле в течение двух с половиной лет хранения при комнатной температуре. При изучении стабильности оценивали внешний вид геля, рН извлечения, подлинность, количественное содержание пероксидазы и микробиологическую чистоту.