Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 12
1.1 Дисбаланс цинка в организме человека как ключевое звено в нарушении ряда обменных процессов 12
1.2 Анализ перспектив использования соединений цинка в коррекции дефицита Zn2+. Выбор Zn(OH)2 как фармакологической субстанции 21
1.3 Сравнительный анализ методик получения наноразмерных соединений цинка и обоснование выбора способа синтеза 30
1.4 Фармакокинетические характеристики традиционных и наноразмерных соединений цинка. 36
Глава 2. Материалы и методы 44
2.1 Материалы исследования 44
2.1.1 Соответствие работы правилам и рекомендациям к проведению экспериментальных исследований 44
2.1.2 Перечень используемых реактивов 45
2.2 Методы исследования 47
2.2.1 Методика синтеза наноразмерного гидроксида цинка 47
2.2.2 Оценка морфологии, структуры и размера полученных соединений 49
2.2.3 Исследование in vitro активности наноразмерного гидроксида цинка на культуре S.cerevisiae 50
2.2.4 Дизайн исследования фармакокинетических параметров гидроксида цинка in vivo 53 2.2.4.1 Фармакокинетические параметры, используемые для интерпретации данных 62
2.2.5 Дизайн исследования динамики накопления гидроксида цинка in vivo 63
2.2.6 Методика пробоподготовки и количественного анализа цинка 67
2.2.6.1 Метрологическая характеристика методики определения цинка в
биоматериале 69
2.2.7 Статистический анализ результатов исследования 70
Глава 3. Результаты собственных исследований 71
3.1 Сравнительная оценка морфометрических показателей наночастиц Zn(OH)2 и ZnO 71 Резюме 78
3.2 Исследование биологической активности наночастиц Zn(OH)2 in vitro 80 Резюме 84
3.3 Сравнительное изучение фармакокинетики наночастиц гидроксида цинка и растворимого сульфата цинка in vivo введенного энтерально и внутривенно 85
Резюме 101
3.4 Сравнительное исследование динамики накопления наноразмерного гидроксида цинка, введенного энтерально в органах и тканях в опыте in vivo 103
Резюме 112
Глава 4. Обсуждение результатов 114
4.1 Подбор параметров методики синтеза, характеризация полученных материалов 114
4.2 Особенности взаимодействия наночастиц гидроксида цинка с культурой дрожжей in vitro 117
4.3 Сравнительная фармакокинетика наночастиц гидроксида цинка in vivo введенных энтерально и внутривенно 122
4.4 Особенности распределения наночастиц Zn(OH)2 в органах и тканях в эксперименте in vivo 126
Заключение 132
Выводы 134
Благодарности 135
Список сокращений 136
Список литературы
- Анализ перспектив использования соединений цинка в коррекции дефицита Zn2+. Выбор Zn(OH)2 как фармакологической субстанции
- Исследование in vitro активности наноразмерного гидроксида цинка на культуре S.cerevisiae
- Сравнительное изучение фармакокинетики наночастиц гидроксида цинка и растворимого сульфата цинка in vivo введенного энтерально и внутривенно
- Сравнительная фармакокинетика наночастиц гидроксида цинка in vivo введенных энтерально и внутривенно
Введение к работе
Актуальность проблемы. Цинк является одним из важнейших
эссенциальных микроэлементов, определяющих нормальное протекание
большинства ключевых процессов в организме человека (Сальникова Е.В.,
2012; Хабаров А.А., 2012; Roohani N., 2013). В мире более 6% всех случаев
смертности и заболеваемости так или иначе ассоциированы с
микроэлементозами (Kumssa D.B., 2015), по оценкам специалистов более 1,1 млрд населения подвержены дефициту цинка (Lim S.S., 2012). Впервые зарегистрированные в 60-ых годах XX века случаи заболевания гипоцинкозами, получили широкое распространение, и к 2011 году было выявлено, что 17,3% населения мира (Wessels K.R., 2012) недополучают со своим рационом достаточного количества Zn. Важно заметить, что дефицит цинка возникает не из-за недостаточного поступления с пищей, а вследствие малой биологической доступности в пищевых источниках.
Основные пути коррекции микроэлементарного статуса сводятся к двум
направлениям - к комбинированию уже известных веществ с другими
компонентами для увеличения эффекта и поиску новых соединений цинка,
обладающих повышенной биодоступностью (Халиуллина С.В., 2013). Первое
направление не дает значительных преимуществ перед уже известными
препаратами цинка, в то время как второе значительно эффективнее. Развитие
современных технологий получения наноматериалов обеспечивает
результативный подход к повышению биологической доступности уже известных препаратов, что преимущественно связано с изменением их физико-химических свойств - размера, морфологии поверхности и кристаллической структуры (Khadka P., 2014).
Основные соединения цинка, используемые для обогащения продуктов питания, а также в препаратах для коррекции дисбаланса Zn2+ в организме человека – это сульфат и оксид цинка (Brown K.H., 2002; Whittaker P., 1998), которые, как правило, включены в состав поливитаминных комплексов. Вследствие сравнительно низкой биодоступности, препараты сульфата цинка при превышении дозировок могут вызывать ряд побочных эффектов, среди которых – диспепсические явления, изжога, а также гематологические нарушения, связанные с развивающимся дефицитом меди. Уменьшение неблагоприятного воздействия может корректироваться только путем повышения биологической доступности источника цинка, что, в свою очередь, позволит достигнуть снижения дозировки.
Результаты фармакокинетических и биофармацевтических исследований (Baek M., 2012; Choi J., 2014, Paek H.J., 2013; Kim M.K., 2016; Распопов Р.В.,
2010) свидетельствуют о том, что наночастицы (далее – НЧ) цинка демонстрируют более высокие параметры биодоступности, чем у сульфата цинка.
Таким образом, разработка соединения, обладающего повышенными параметрами биологической доступности, является актуальной с точки зрения снижения побочных эффектов препаратов цинка и повышения доступности для организма последнего.
Степень разработанности проблемы. Исследования биологического
ответа модельной системы in vivo и in vitro проведены по большей части для НЧ
оксида цинка и представлены в работах (Kasemets K., 2009; Ban D.K., 2014), где
наиболее полно проведены исследования in vitro на культуре S.cerevisiae.
Выявлено позитивное влияние на продуцирование ферментов хлебопекарными
дрожжами и повышенная биологическая активность наноразмерных
соединений в отношении клеток.
В экспериментах на животных широко освещено биологическое влияние, распределение в организме, а также параметры токсичности для НЧ оксида цинка (Распопов Р.В., 2010; Baek M., 2012; Choi S.J., 2014). Описана бльшая эффективность наноразмерного препарата цинка сравнительно с растворимыми соединениями в купировании искусственно созданного микроэлементоза, а также значительный уровень накопления в плазме, эритроцитарной массе, тканях печени, почек и др.
Зарубежными исследователями (Poul L., 2000; Hale P.S., 2005; Xiu-rong et
al., 2009) предложены ряд конденсационных методов получения НЧ гидроксида
и оксида цинка, различающихся в используемых прекурсорах и примененных
осадителях. Представленные методики позволяют воспроизводимо получать
наночастицы гидроксида цинка с размером не более 20 нм. Из
синтезированного наноразмерного Zn(OH)2 при различных вариациях
параметров сушки и отжига получают ZnO с размером частиц до 300 нм. Тем
не менее, для синтеза данных соединений используются токсичные
прекурсоры, что создает риски для применения продукта в
биофармацевтических целях.
Данные об исследованиях токсикологических характеристик,
биораспределения и биологической доступности наноразмерного гидроксида цинка отсутствуют.
Цель исследования. Экспериментальное исследование in vitro
биологического действия, in vivo фармакокинетических характеристик и распределения между органами и тканями наноформы гидроксида цинка в сравнительном аспекте с традиционной активной фармацевтической субстанцией сульфатом цинка.
Задачи исследования. Для достижения указанной цели необходимо решение следующих задач:
-
Провести in vitro изучение биологического действия наноформы гидроксида цинка с целью определения активности в сравнении с сульфатом цинка.
-
Изучить на кроликах фармакокинетику Zn2+ при введении наноформы гидроксида цинка в условиях энтерального и внутривенного введения и сравнить полученные параметры с традиционной активной фармацевтической субстанцией - сульфатом-цинка.
-
Изучить на крысах динамику накопления полученного наноразмерного соединения цинка в крови, печени, семенниках и бедренной кости в условиях многократного введения.
-
Модифицировать и метрологически охарактеризовать методику измерения концентраций ионов цинка в биологическом материале (тканях и жидкостях) методом атомно-абсорбционной спектрометрии с предварительной пробоподготовкой.
Научная новизна исследования. В работе впервые:
-
Для наноформы гидроксида цинка проведено исследование взаимодействия с модельной системой хлебопекарных дрожжей, в ходе которого установлена высокая биологическая активность соединения, проявляющаяся в ингибировании ферментов дрожжевой клетки;
-
Для наночастиц гидроксида цинка проведено изучение фармакокинетики на кроликах в условиях внутривенного и энтерального введения. Обнаружена высокая абсолютная биодоступность;
-
Для наночастиц гидроксида цинка получены данные о бионакоплении в крови, печени, семенниках и бедренных костях крыс Wistar в эксперименте in vivo. По сравнению с соединением сравнения (цинка сульфат) выявлена более интенсивная динамика накопления в эритроцитарной массе и семенниках.
Научно-практическая значимость. Проведено изучение
фармакокинетических параметров НЧ гидроксида цинка на кроликах в
условиях внутрисосудистого и энтерального введения при трех уровнях доз.
Выявлены линейные зависимости фармакокинетических параметров от дозы.
Сравнение с сульфатом цинка показало увеличение абсолютной
биодоступности для полученных НЧ. Выявленные закономерности могут быть использованы при клинических испытаниях после завершения доклинических исследований и оценки токсикологических параметров.
Показан более высокий уровень накопления цинка в плазме и эритроцитарной массе крови по сравнению с растворимым сульфатом цинка при исследовании динамики накопления Zn(OH)2 на крысах. Наноформа имеет более интенсивную динамику накопления в тканях семенников. Отмечается сравнительно низкий уровень накопления в тканях печени. Выявленные закономерности могут быть использованы для разработки препарата, обладающего направленным действием.
Методология и методы исследования. Для оценки параметров полученных малоразмерных соединений применены современные физико-химические методы: малоугловое рентгеновское рассеяние, рентгенофазовый метод анализа и метод сканирующей электронной микроскопии. Для количественного анализа цинка применен высокочувствительный метод атомно-абсорбционной спектрометрии.
Оценка активности клеток хлебопекарных дрожжей производилась согласно методике, регламентированной ГОСТ Р 54731-2011 "Дрожжи хлебопекарные прессованные. Технические условия".
Методология исследования на лабораторных животных (крысы и
кролики) заключалась в использовании комплексного поэтапного
фармакокинетического подхода в оценке биодоступности при различных путях введения. Изучение фармакокинетических свойств и параметров накопления проводили на крысах линии Wistar и кроликах породы Шиншилла согласно действующему руководству по проведению доклинических исследований лекарственных средств.
Экспериментальная работа была выполнена на базе лаборатории доклинических исследований лекарственных средств НИИ Экологической медицины ФГБОУ ВО КГМУ Минздрава России и на базе кафедры Общей и биоорганической химии ФГБОУ ВО КГМУ Минздрава России, исследования наноразмерных материалов и аналитические измерения цинка были проведены на базе Регионального центра нанотехнологий при ФГБОУ ВО ЮЗГУ.
Положения, выносимые на защиту:
-
Наночастицы гидроксида цинка оказывают ингибирующее влияние на ферменты зимазного комплекса культуры S.cerevisiae, демонстрируя повышенную биологическую активность в опыте in vitro;
-
Наноформа гидроксида цинка, введенная энтерально однократно, имеет высокое значение абсолютной биодоступности;
-
Наноформа гидроксида цинка, введенная энтерально многократно, вызывает более интенсивное накопление цинка в эритроцитарной массе крови, а также в тканях семенников у экспериментальных крыс;
4. Наночастицы гидроксида цинка, введенные в дозе 100 мг/кг, обладают низкой способностью к накоплению в тканях печени крыс по сравнению с сульфатом цинка;
Степень достоверности и апробация работы. Расчеты выполнены в соответствии с требованиями, изложенными в главах 57 и 61 «Руководства по проведению доклинических исследований лекарственных средств». Работа проведена на достаточном экспериментальном материале с использованием современных методов, высокотехнологичного оборудования, а также параметрических и непараметрических критериев статистической обработки данных.
Основные результаты работы были доложены на международной научно-
практической конференции «Физика и технология наноматериалов и структур»
(Курск, 2013); на XXXV международной научно-практической конференции
«Инновации в науке» (Новосибирск, 2014); на международной научно-
практической конференции «Современная наука: теоретический и
практический взгляд» (Уфа, 2014); на международной научно-практической
конференции «Общество, наука, инновации» (Уфа, 2014); на XXXVI-XXXVII
международной научно-практической конференции «Естественные и
математические науки в современном мире» (Новосибирск, 2015); на
международной научно-практической конференции «Научные горизонты»
(Белгород, 2015); на международной научно-практической конференции,
посвященной 81-летию Курского государственного медицинского университета
и 50-летию фармацевтического факультета «Университетская наука, взгляд в
будущее» (Курск, 2016); на XI международной научно-технической
конференции «Актуальные вопросы биологической физики и химии БФФХ-
2016» (Севастополь, 2016).
Апробация диссертации проведена на межкафедральном совещании
кафедр общей и биоорганической химии, фармакологии, фармакогнозии и
ботаники, фармацевтической технологии федерального бюджетного
образовательного учреждения высшего образования «Курский
государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации.
Личный вклад автора. Личный вклад автора состоит в подготовке
аналитического обзора литературы, непосредственном участии в составлении
программы исследований, проведении экспериментов, обработке и
интерпретации данных, подготовке публикаций по диссертационной работе.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 14 печатных работ, в том числе 3 публикации в изданиях, рекомендованных ВАК
Минобрнауки России, 1 публикация в журнале, включенном в международную базу цитирования Scopus.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 153 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, четырех глав собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Список литературы включает 168 источников, в том числе 35 на русском и 133 на иностранных языках. Работа содержит 15 таблиц и 36 рисунков.
Анализ перспектив использования соединений цинка в коррекции дефицита Zn2+. Выбор Zn(OH)2 как фармакологической субстанции
Гипоцинкозы обычно сопровождаются нарушениями гомеостаза организма, которые возникают из-за дефектной агрегации тромбоцитов, нарушениями работы иммунной системы, проявляющимися в снижении числа Т-клеток и в снижении активности Т-лимфоцитов. Серповидно-клеточная анемия, алкоголизм, ожоги, некоторые виды рака и СПИД, а также ряд других заболеваний приводят к снижению общего уровня Zn2+ в организме.
В организме цинк играет три ключевые роли: каталитическую, структурную и регуляторную. Являясь эссенциальным микроэлементом, Zn вовлечен в процессы катализа и сокатализа совместно с ферментами, посредством которых контролируются синтез ДНК, процессы роста, развитие мозга, образование костной ткани, заживление ран и др. [95]. Физико-химические особенности пространственного строения Zn2+ позволяют этому микроэлементу являться кофактором более чем 3000 ферментов, среди которых присутствуют энзимы, контролирующие ключевые функции организма: экспрессию генов, синтез и работу пептидных гормонов, поддержание структуры хроматина и др. [141]. Регуляторная роль цинка проявляется в активации либо ингибировании ферментов, за счет изменения свободных концентраций ионов цинка внутри клетки. Такая возможность достигается наличием металлотионеинов, которые могут быстро связать или высвободить Zn2+ в цитоплазме.
Организм человека содержит 2-3 г Zn2+, из которых 0,1% ежедневно необходимо восполнять по причине естественных потерь с калом, мочой и потом [92]. Цинк, содержащийся в клетке, в основном распределен между ядром (30 40%), плазматической мембраной (10%) и цитоплазмой (до 50%). Последняя имеет специализированные мембранно-заключенные структуры, называемые цинкосомами, которые служат «буфером» обмена для свободных ионов цинка в клетке. Цинк необходим для роста и развития на клеточном уровне, он участвует в процессах пролиферации, дифференцировки и апоптоза. Примерами функций, напрямую зависимых от уровня Zn2+, являются репарация и репликация ДНК, сперматогенез, восприятие вкуса, зрение, нейрогенез и синаптогенез. Иммунная система особенно восприимчива к дефициту Zn2+ [108]. Ярким примером, подтверждающим этот факт, может служить аутосомно-рецессивное заболевание – энтеропатический акродерматит. Болезнь связана с мутацией одного из транспортных белков – Zip4 и приводит к серьезному дефициту цинка. Такое нарушение микроэлементарного баланса приводит к тяжелому поражению иммунной системы – часто у пациентов обнаруживается иммунодефицит с атрофией лимфоидных тканей, уменьшением содержания лимфоцитов, нарушением пролиферативной активности лимфоцитов и иммунного ответа [39]. Впоследствии это приводит к атрофии вилочковой железы, снижению уровня активности и количества лимфоцитов, повышению восприимчивости к бактериальным и вирусным инфекциям. Таким образом, недостаток цинка отражается, главным образом, в нарушении процессов пролиферации и дифференцировки, т.е. на неспецифической стадии при развитии иммунного ответа [78].
Имеется подтвержденная информация о связи дефицита цинка с сердечнососудистыми заболеваниями. Установлена корреляция между возрастными изменениями концентрации цинка в плазме крови и заболеваемостью атеросклерозом, что связано со способностью Zn2+ к поддержанию целостности эндотелиальных клеток – прямой причиной развития атеросклероза [161]. При гипертонических состояниях также обнаруживается сниженная активность некоторых цинк-зависимых ферментов таких, как щелочная фосфатаза, лактатдегидрогеназа и супероксиддисмутаза. Существует значимая обратно-пропорциональная зависимость между активностью лизилоксидазы и уровнем кровяного давления [4].
Концентрация Zn2+ в ткани серого вещества мозга варьируется от 150 до 200 мкмоль/г, а в терминальных окончаниях отростков нейронов содержание достигает 300–600 мкмоль/г [10]. В мозге человека представлены три фракции цинка: везикулярная (заключенная в синоптических пузырьках нервных окончаний), мембраносвязанная (цинксодержащие энзимы и протеины) и цитоплазматическая, представленная несвязанным Zn2+. Везикулярный цинк, связанный с протеогликанами периферических нейронов, высвобождается в синоптическую щель при электростимуляции и способен модулировать активность рецепторов различных нейромедиаторов (в частности NMDA- и GABA-рецепторов) [30]. Дисбаланс цинка играет важную роль в течении некоторых нейроденеративных заболеваний, например, болезни Альцгеймера [165]. Одним из паталогических признаков болезни Альцгеймера является образование в мозге бляшек из -амилоида. При посмертных вскрытиях больных было обнаружено значительное накопление цинка в бляшках. Такая тенденция объясняется наличием цинк-связывающего участка в -амилоиде и вызывает дисбаланс Zn вследствие процесса осаждения и формирования бляшек [72].
Цинк играет важную роль в процессах пролиферации в различных тканях и типах клеток [162]. Влияние на новообразование клеток осуществляется на нескольких уровнях: прямой (потребность в Zn2+ ферментов, вовлеченных в синтез ДНК и РНК (например, дезокситимидинкиназа)) и опосредованный (через воздействие на активность ферментов, участвующих в механизмах клеточного деления). Такая роль Zn2+ напрямую отражается на процессах роста всего организма. Гипофиз, главный источник гормона роста, является первичным эндокринным регулятором соматического роста. Авторами [118] в эксперименте на крысах было установлено, что в группе, в которой моделировалось цинк-дефицитное состояние, достоверно снижалась концентрация гормона роста в крови по сравнению с контрольной группой.
Любая живая система требует наличия специального механизма антиоксидантной защиты для избегания вредного воздействия активных форм кислорода (ROS – reactive oxygen species). Существуют данные о способности Zn2+ защищать клеточные структуры от свободных радикалов. Такой механизм достигается несколькими факторами: стабилизацией структуры клеточной мембраны, поддержанием постоянного уровня металлотионеинов (которые являются поглотителями свободных радикалов) и присутствием в структуре фермента супероксиддисмутаза (ключевое звено в структуре антиоксидантной защиты организма) [115, 141].
Исследование in vitro активности наноразмерного гидроксида цинка на культуре S.cerevisiae
Для синтеза наноразмерных соединений цинка использовался золь-гель метод [77]. В основе способа получения лежит реакция между ацетатом цинка и гидроксидом лития (3) в среде этилового спирта. среда Zn2+ + 2 СН3СОО- + Li+ + ОН" a6c3ro » ZnO + СН3СООН + Li+ + СН3СОО" (3) Использование абсолютированного этанола связано с повышенной способностью к суспендированию оксида цинка, а удаление лишней влаги из реакционной смеси повышает седиментационную устойчивость системы с полупродуктом, позволяя получить частицы меньшего размера. Другая причина замены растворителя – использование продукта в биомедицинских целях, что накладывает ограничения на использование изопропанола, метанола и других токсичных органических растворителей.
На первом этапе навески 0,55 г ацетата цинка и 0,15 г гидроксида лития растворяются в 25 мл абсолютированного этанола, после чего раствор Zn(OAc)2 кратковременно подвергается кипячению. Такая процедура позволяет дополнительно к перемешиванию диспергировать ацетат цинка. Оба раствора охлаждаются до 0oC и медленно сливаются со скоростью 2-3 капли в секунду при постоянном перемешивании. На данном этапе формируется промежуточный интермедиат – смесь устойчивой формы гидроксида цинка (-Zn(OH)2) и гидроксиацетата, характеризующегося формулой Znx(CH3COO)yOz. Основываясь на литературных данных, определено, что соединение имеет структурную форму Zn5(OH)8(CH3COO)22H2O и представляет собой агрегированные частицы без выраженной структуры [107].
Роль влияния катиона гидроксида, используемого для осаждения промежуточного продукта, подробно описана в литературе [116]. Установлено, что используемая в золь-гель методе щелочь не влияет на сингонию формирующихся кристаллов, но оказывает прямое влияние на размер получаемых наночастиц. Вследствие высокой плотности заряда, ионы Li+ замедляют процесс адсорбции Zn(OH)42- на поверхности формирующихся кристаллов ZnO. Это замедляет процесс роста кристаллов цинка гидроксида и оксида, позволяя получать меньшие по размеру структуры. Именно это послужило основным критерием при выборе осадителя.
Полученный интермедиат хранился при температуре 2-8оС, по причине равновесного перехода -Zn(OH)2 в оксид цинка при температурах выше 39оС [6]. На финальном этапе полученный промежуточный продукт центрифугировался для отделения избытка растворителя, отмывался несколько раз абсолютированным спиртом и сушился в муфельной печи при 600-800оС. Подбор температуры основывался на данных о сублимации оксида цинка (не должна превышать 1800 оС), а также на основании температуры потери воды некоторыми устойчивыми гидроксоцинкатами (например, для гидроксоцинката натрия - 465 оС).
Малоугловое рассеяние рентгеновских лучей является одним из наиболее эффективных методов изучения надатомной структуры вещества при разрешении 1 – 100 нм. Полученный после центрифугирования гелеобразный гидроксид цинка исследовали методом малоуглового рентгеновского рассеяния на энергодисперсионном рентгенофлуоресцентном спектрометре для определения распределения по размерам. Измерения проводились с использованием позиционно-чувствительного детектора и при фиксированной длине волны . Максимальный размер частиц определялся согласно кривой распределения по расстояниям p(r), которая была рассчитана с помощью косвенного Фурье-преобразования в программе GNOM.
Оценку элементарного состава полученного после отжига соединения проводили на рентгеновском порошковом дифрактометре, оснащенном высоковольтным генератором, мощностью 3 кВт. Источником рентгеновского излучения служила рентгеновская трубка с антикатодом из меди с излучаемой мощностью 2,2 кВт. Размер фокального пятна – 0,412 мм. В качестве устройства для регистрации рассеянного Х-излучения использовался пропорциональный детектор для фокусирующей геометрии с графитовым монохроматором. Рефлексы фиксировались с помощью гониометра радиусом 180-250 мм с диапазоном измерения 2: -30-160о с минимальным шагом по каждой оси – 0,002. Порошок оксида цинка, полученный на заключительном этапе синтеза, также подвергался изучению на электронном сканирующем микроскопе для определения пространственной структуры и размеров кристаллов. Микроскоп имеет пространственное разрешение 3 нм (30 кВ, HV), ускоряющее напряжение от 0,3 до 30 кВ и диапазон увеличений до 300000.
Транспорт цинка в дрожжевых клетках имеет сходный механизм с транспортом в млекопитающих, что впервые было показано в работе [158]. Необходимость постоянного потребления дрожжами ионов цинка обуславливает нормальное протекание их процессов жизнедеятельности и может быть использовано как индикатор активности потребления этого эссенциального микроэлемента. Одним из простейших цинкзависимых процессов, отражающих жизнедеятельность клетки, является брожение, регуляция которого проявляется в угнетении или активации ферментов зимазного комплекса различными концентрациями Zn2+. Все это обуславливает возможность использования S. cerevisiae как тест-системы для определения биологической активности синтезированных оксида и гидроксида цинка.
Активность дрожжей определялась по ускоренному методу определения подъемной силы по ГОСТ Р 54731-2011 «Дрожжи хлебопекарные прессованные. Технические условия». От средней пробы дрожжей хлебопекарных прессованных «Премиум» (ОАО «Комбинат пищевых продуктов», Россия) отбирается навеска дрожжей массой 0,31 г, которую переносят в фарфоровую чашку и добавляют 4,8 см3 2,5%-го раствора поваренной соли, нагретого до 35оС. После тщательного перемешивания добавляли 7 г муки, замешивали тесто с приданием ему формы тестяного шарика, который опускали в стакан с водой и термостатировали при 35оС. Подъемная сила характеризовалась временем, прошедшим до момента всплытия шарика в минутах, умноженным на эмпирический коэффициент 3,5. При сопоставлении эффекта различных соединений цинка, подъемная сила контрольной (без добавления вещества) группы принималась равной 100%, изменение подъемной силы в других группах рассчитывалось относительно 100%. При этом увеличение значения характеризовало отрицательный эффект (увеличение времени всплытия тестяного шарика), а уменьшение положительный (уменьшение времени всплытия). Для сравнительного исследования биологического эффекта были использованы традиционные и наноразмерные соединения цинка, их характеристика представлена в таблице 2.1.
Сравнительное изучение фармакокинетики наночастиц гидроксида цинка и растворимого сульфата цинка in vivo введенного энтерально и внутривенно
Исследование морфологических и размерностных характеристик продукта (ZnO) и промежуточного соединения (-Zn(OH)2), полученных модифицированным золь-гель методом, позволили установить физико-химические параметры (элементарный и фазовый состав, размер) и геометрическую структуру веществ.
Конечный продукт синтеза - кристаллический оксид цинка практически полностью идентичен коммерческому образцу, отличаясь лишь наличием незначительных включений кремния и алюминия (0,34% и 0,44% соответственно). Электронное микроскопирование выявило частицы со средним размером 955,6 нм, которые кристаллизовались в гексагональной сингонии, характерной для структуры цинка оксида. Частицы коммерческого образца имеют намного больший размер, они видимы под световым микроскопом (увеличение х1600) и не имеют выраженной структуры.
Сравнение конечного продукта методики производилось с образцом наночастиц ZnO, полученных по другой методике - размолом на шаровой мельнице. Рентгенофазовый анализ не выявил никаких отличий в дифракционных рефлексах от коммерческого образца. Электронное микроскопирование показало значительно меньший размер - 180,4 нм. Геометрическая структура представляла собой частицы без выраженной формы кристалла.
Характеризация фазового состава полупродукта (гель Zn(OH)2, полученный до стадии отжига) показала присутствие стабильной модификации гидроксида цинка -Zn(OH)2 с примесями гидроксиацетата цинка - гп5(ОН)8(СНзСОО)22Н20. Исследование распределения частиц по размерам в геле выявило подавляющее большинство в диапазон 2-3 нм.
Наиболее перспективными для исследования биологической активности соединениями, на наш взгляд, являются ZnO (конечный продукт методики) и Zn(OH)2 (полупродукт методики), о чем свидетельствует: — малый размер частиц гидроксида цинка (2-3 нм); «правильная» геометрическая структура оксида цинка в сравнении с коммерческим образцом и образцом, полученным при размоле на шаровой мельнице; отсутствие значительных примесей, способных оказать нежелательный биологический отклик в тест-системе. 3.2 Исследование биологической активности наночастиц Zn(OH)2 in vitro
В качестве тест-культуры были избраны хлебопекарные дрожжи S.cerevisiae. Первоначально подъемная сила была определена для соединений ZnO и Zn(OH)2, синтезированных нами. Для сравнительной характеристики в группу цинка оксида были введены коммерческий образец ZnO и образец ZnO, полученный размолом на шаровой мельнице. В группу наночастиц гидроксида цинка был введен образец сухого Zn(OH)2, полученный в лабораторных условиях. Все образцы также сравнивались с растворимым соединением – сульфатом цинка.
Полученная зависимость степени изменения подъемной силы тест-культуры S.сerevisiae от содержания соединения (в пересчете на цинк) на 1 г дрожжевых клеток представлена на рисунке 3.8.
Зависимость степени изменения подъемной силы от уменьшающейся массовой концентрации цинка на 1 г дрожжей: 1. Коммерческий образец ZnO; 2. Образец ZnO, измельченный на шаровой мельнице; 3. ZnO, конечный продукт золь-гель метода; 4. ZnSO4 – растворимый; 5. Zn(OH)2 – промежуточный продукт золь-гель метода; 6. Zn(OH)2, полученный в лабораторных условиях. Наибольшая угнетающая активность на подъемную силу наблюдается в группе 5, соответствующей наночастицам гидроксида цинка. Отсутствие первой точки на графике свидетельствует о гибели дрожжевых клеток при концентрации цинка 200 мг/г. Значение подъемной силы принимает значение, характерное для «холостого» опыта при 3 мг/г.
Лабораторный образец гидроксида цинка (группа 6) обладает меньшими токсическими свойствами – при максимальной концентрации наблюдается увеличение подъемной силы на 120%, а возвращение показателей к норме при концентрации соединения 6 мг/г. Наблюдается достоверное (р 0,05) различие с группой, где был введен полупродукт, полученный золь-гель методом.
Группа 3, получившая синтезированные микрочастицы оксида цинка, также характеризуется на графике (рисунок 3.8) отсутствием первой точки, однако уже первое уменьшение концентрации исследуемого соединения вдвое увеличивает подъемную силу на 80%. При содержании ZnO 3 мг/кг наблюдается соответствие показателей подъемной силы «холостому» опыту, при 1,5 мг/кг наблюдается положительное влияние на тест-культуру, проявляющееся в уменьшении подъемной силы.
Коммерческий ZnO (группа 1) и ZnO, подвергнутый размолу на шаровой мельнице (группа 2), демонстрируют наименьшие показатели увеличения подъемной силы при стартовых концентрациях. Возвращение к значениям контрольной группы наблюдается при 3 и 6 мг/г соответственно для группы 1 и 2. Достоверное уменьшение подъемной силы (p 0,05) по сравнению с контрольной группой обнаруживается только в группе 2 (ZnO после размола).
Группа 4, в которую вводили растворимый сульфат цинка, показывает достоверно более высокое (p 0,05) увеличение подъемной силы, чем в группе 1 и 2. По сравнению с образцами гидроксида цинка (группа 5 и 6), сульфат цинка показывает достоверно меньшее увеличение подъемной силы при стартовой концентрации 200 мг/г. Последовательное уменьшение содержания цинка в смеси возвращало подъемную силу к значению контрольной группы при концентрации 6 мг/г, не вызывая положительного изменения при дальнейшем уменьшении. Нами было сделано предположение о токсическом вкладе остаточного растворителя, который может возникнуть в группе, получавшей гидроксид цинка. Для этого было проведено исследование в отдельной группе, где активность дрожжей исследовалась в присутствии абсолютированного этанола (рисунок 3.9).
Сравнительная фармакокинетика наночастиц гидроксида цинка in vivo введенных энтерально и внутривенно
Расчеты демонстрируют инвариантность параметров среднего времени удержания (MRT), периода полувыведения (T1/2) и показателя Cmax/AUC0-12 относительно введенной дозы. В совокупности с удовлетворительной линейной аппроксимацией зависимости площади под кривой от введенной дозы это позволяет заключить о линейности фармакокинетических характеристик растворимого сульфата цинка.
Полученные экспериментальные данные опубликованы Лариным С.Л. и соавт. в работе [69].
Первоначально было проведено изучение фармакокинетических параметров для наночастиц гидроксида цинка, полученных нами модифицированным золь-гель методом. Было избрано три уровня дозы: 10, 50 и 100 мг/кг; в качестве тест-животных использовались кролики-самцы Шиншилла. Основной путь введения – энтеральный, именно так предполагается вводить полученное вещество, однако для определения относительной биодоступности была сформирована группа, получавшая наночастицы внутривенно в виде суспензии.
На кривых С(t) в группах, получавших наноразмерный Zn(OH)2, демонстрировалось строгое статистически значимое увеличение концентраций в зависимости от введенных доз. Время наступления максимальной концентрации (tmax) было зарегистрировано как 0,016 ч и 4 ч для внутривенного и энтерального введения соответственно, независимо от введенной дозы. В ходе проверки гипотезы линейности была установлена удовлетворительная линейная аппроксимация для зависимости «площади под фармакокинетической кривой от дозы», а параметры среднего времени удержания (MRT), периода полувыведения (T1/2) и показателя Cmax/AUC были инвариантны относительно введенной дозы. Все это позволило принять гипотезу линейности для наночастиц гидроксида цинка, введенных энтерально и внутривенно. Был рассчитан параметр относительной биодоступности (fa) при энтеральном введении, который составил для дозировок 10, 50 и 100 мг/кг 30,01%±3,55%, 45,15%±3,67% и 43,18%±2,71% соответственно.
В качестве соединения-сравнения был выбран широко используемый растворимый сульфат цинка, который вводился кроликам в трех дозировках – 10, 50 и 100 мг/кг, энтерально и, для определения относительной биодоступности, внутрисосудисто. Фармакокинетические кривые показали статистически достоверный рост концентраций в ответ на увеличение дозы. Время наступления максимальной концентрации отмечено как 0,016 ч и 6 ч в группах внутривенного и энтерального введения соответственно. Также была проверена и принята гипотеза линейности фармакокинетических параметров, о чем свидетельствовала удовлетворительная линейная аппроксимация зависимости AUC от введенной дозы, а также инвариантность показателей MRT, T1/2 и Сmax/AUC относительно введенной дозировки. На основании данных после внутрисосудистого введения были рассчитаны параметры относительной биодоступности (fa), которые составили 32,92%±2,29%, 44,43%±4,60% и 38,96%±1,87% соответственно для введённых доз 10, 50 и 100 мг/кг сульфата цинка.
Таким образом, гидроксид цинка демонстрирует параметры относительной биодоступности, сопоставимые с таковой у сульфата цинка при дозировке 10 мг/кг и превышающие последний при дозировках 50 и 100 мг/кг.
Сравнительная оценка накопления наноразмерного гидроксида цинка была проведена на крысах-самцах Wistar. В качестве соединения сравнения был избран растворимый сульфат цинка, а также полученные нами микрочастицы оксида цинка. Исследуемое соединение вводили подопытным животным многократно энтерально в дозе 100 мг/кг. Режим введения был избран как 0-24-48-72-120-168 ч, взятие образцов биологического материала производилось спустя 4 часа после очередного введения. В период 72-120 часов исследуемое соединение не вводилось для оценки параметров накопления и выявления его возможных закономерностей.
Для определения содержания ионов цинка были избраны следующие органы и ткани: кровь (эритроцитарная масса и плазма), семенники, печень и бедренная кость. После введения испытуемым животным исследуемых соединений регистрировалась масса тела, внешние морфологические и физиологические признаки, параметры поведения. Не было отмечено случаев гибели животных, каких-либо атипичных проявлений поведения, изменений волосяного и кожного покрова. На протяжении всего эксперимента прирост массы тела у крыс трех подопытных групп не имел достоверных статистических отличий от таковых показателей контрольной группы.