Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Современные подходы к системной и местной гемостатической терапии (обзор литературы) 15
1.1 Гемостатические средства системного действия 15
1.2 Гемостатические средства локального действия 27
Глава 2. Материал и методы исследования 35
Оборудование: 38
Реактивы: 39
2.1 Оценка гемостатической активности вещества системного действия в условиях экспериментальной геморрагии 40
2.1.1 Оценка гемостатической активности соединения на основе фибрин-мономера при внутривенном введении интактным кроликам в различных дозах в условиях экспериментальной геморрагии 40
2.1.2 Оценка гемостатической активности соединения на основе фибрин-мономера при внутривенном введении кроликам с некомпенсированной кровопотерей 5,00–7,00 % от ОЦК в условиях экспериментальной геморрагии 42
2.1.3 Оценка гемостатической активности соединения на основе фибрин-мономера при внутривенном введении кроликам с компенсированной 0,9 % раствором хлорида натрия кровопотерей 7,00–20,00 % от ОЦК в условиях экспериментальной геморрагии 42
2.1.4 Оценка гемостатической активности комбинированного действия соединения на основе фибрин-мономера и -аминокапроновой кислоты при их внутривенном введении интактным кроликам в условиях экспериментальной геморрагии 44
2.1.5 Сравнительная оценка гемостатической активности соединения на основе фибрин-мономера и препарата эптаког альфа активированный при их внутривенном введении интактным кроликам 45
2.1.6 Оценка гемостатической активности исследуемых соединений при внутривенном введении 46
2.2 Определение гемостатической активности соединений локального действия 47
2.3 Эксперименты in vitro 49
2.3.1 Методика определения агрегации тромбоцитов 50
2.3.2 Методика определения активированного парциального тромбинового времени (АПТВ) 51
2.3.3 Методика определения протромбинового времени (ПВ) 52
2.3.4 Методика определения тромбинового времени (ТВ) 53
2.3.5 Методика определения концентрации фибриногена по Клауссу 54
2.3.6 Методика определения концентрации D-димера в плазме крови 55
2.4 Методы статистической обработки результатов 56
Глава 3. Оценка эффективности соединения на основе фибрин-мономера при системном и местном применении (результаты собственных исследований) 57
3.1 Сравнительная оценка гемостатической активности соединения на основе фибрин-мономера в условиях экспериментальной геморрагии у интактных кроликов при его внутривенном введении в различных дозах. Выбор оптимальной дозы 58
3.2 Оценка гемостатической активности соединения на основе фибрин-мономера в эксперименте у интактных кроликов. 61
3.2.1 Определение гемостатической активности соединения на основе фибрин-мономера у интактных кроликов в условиях экспериментальной геморрагии 61
3.2.2 Определение гемостатической активности совместного действия соединения на основе фибрин-мономера и -аминокапроновой кислоты при их внутривенном введении интактным кроликам 65
3.2.3. Сравнение гемостатической активности соединения на основе фибрин мономера и препарата эптаког альфа активированный в эксперименте у интактных кроликов 69
3.3 Оценка гемостатической активности соединения на основе фибрин мономера в эксперименте у кроликов в условиях кровопотери 73
3.3.1 Оценка гемостатической активности соединения на основе фибрин мономера в эксперименте у кроликов в условиях кровопотери 5,00–7,00 % от ОЦК 73
3.3.2 Оценка гемостатической активности соединения на основе фибрин-мономера в эксперименте у кроликов в условиях кровопотери 7,00–20,00 % от ОЦК 77
3.3.3 Оценка гемостатической активности соединения на основе фибрин-мономера в эксперименте у кроликов в условиях кровопотери 7,00–20,00 % от ОЦК при болюсном внутривенном введении 0,9 % раствора хлорида натрия 78
3.4 Оценка локальной гемостатической активности покрытий на основе фибрин мономера 80
3.4.1 Сравнительная оценка гемостатической активности порошков фибрин-мономера и тромбина при их аппликации на экспериментальную рану печени 80
3.4.2 Сравнительная оценка гемостатической активности комбинации порошка фибрин-мономера с альгинатом натрия и комбинации порошка тромбина с альгинатом натрия при их аппликации на экспериментальную рану печени 84
3.4.3 Сравнительная оценка гемостатической активности образцов губок с фибрин-мономером при их аппликации на экспериментальную рану печени 88
3.4.4 Сравнительная оценка гемостатической активности губок на основе альгината натрия с добавлением порошка фибрин-мономера и губок на основе альгината натрия с добавлением порошка тромбина при аппликации их на экспериментальную рану печени 91
3.4.5 Измерение показателей сосудисто-тромбоцитарного гемостаза при аппликации порошка фибрин-мономера в эксперименте на интактных кроликах 93
Заключение 95
Выводы 103
Практические рекомендации 105
Список литературы 106
- Гемостатические средства системного действия
- Сравнительная оценка гемостатической активности соединения на основе фибрин-мономера в условиях экспериментальной геморрагии у интактных кроликов при его внутривенном введении в различных дозах. Выбор оптимальной дозы
- Сравнительная оценка гемостатической активности порошков фибрин-мономера и тромбина при их аппликации на экспериментальную рану печени
- Измерение показателей сосудисто-тромбоцитарного гемостаза при аппликации порошка фибрин-мономера в эксперименте на интактных кроликах
Гемостатические средства системного действия
Кровопотеря обычно характеризуется как процесс истечения крови из кровеносных сосудов при нарушении их целостности или проницаемости. Массивная кровопотеря приводит к нарушению снабжения органов и тканей кислородом, снижению тканевой перфузии и функциональным расстройствам [42, 68]. В медицинской практике кровопотерю принято рассматривать как совокупность адаптивных и/или патологических реакций организма, развившихся в ответ на потерю определённого объёма крови за определённый промежуток времени. При таком подходе к понятию кровопотери были сформулированы ниже приведённые современные классификации кровопотерь [17].
Одну из первых таких классификаций, характеризующих ответную реакцию организма на потерю определённых объёмов крови, предложил П. Г. Брюсов [67] в 1998 году (Таблица 1). По данной классификации определение вида кровопотери происходит сразу по четырём признакам. Важное место занимают количественные характеристики дефицита объёма циркулирующей крови и глобулярного объёма, что, по мнению ряда авторов, более полно идентифицирует картину кровопотери [18, 32, 60].
В настоящее время в хирургической практике выделяют три степени кровопотери, различающихся по клинической картине [68]:
1. Лёгкая степень — кровопотеря до 1 л. Частота сердечных сокращений (ЧСС) составляет 90–100 ударов в минуту, артериальное давление (АД) — 110/70 мм. рт. ст., концентрация гемоглобина и гематокрит находятся в пределах нормы, ОЦК снижается на 20 %.
2. Средняя степень — кровопотеря 1,5–2,0 л. ЧСС составляет 120–130 ударов в минуту, АД — 90/60 мм. рт. ст., гематокрит — 0,23, ОЦК снижается на 20–30 %.
3. Тяжёлая степень — кровопотеря 2,5–3,0 л. ЧСС составляет 140–160 ударов в минуту, концентрация гемоглобина снижается до 60 г/мл, гематокрит — ниже 0,20, ОЦК снижается на 30–40 % [32, 68].
Одним из методов современной трансфузиологии является системная гемостатическая терапия. Современные кровоостанавливающие препараты системного действия проявляют себя исходя из следующих принципов:
а) Замещают дефицит факторов свёртывания крови — VIII, IX, Х и др. (моно- и полифакторные препараты);
б) Шунтируют гемостаз — рекомбинантный фактор VIIа (эптаког альфа активированный), антиингибиторный комплекс (Фейба);
в) Активируют синтез факторов свёртывающей системы крови (препараты витамина K);
г) Изменяют равновесие гемостатических реакций (ингибиторы фибринолиза) [21].
Многолетние фундаментальные научные исследования в области гематологии, иммунологии, биохимии, морфологии, а также обширный клинический опыт применения донорской крови и её компонентов дали возможность реализовать концепцию компонентной гемотерапии: её применение должно быть строго по показаниям и теми компонентами крови, в которых нуждается больной, так как необоснованное переливание крови может быть весьма опасно [67].
Цельная консервированная донорская кровь (по классификатору ОК ККЧиК) — венозная кровь, ранее являлась уникальным лечебным средством и незаменима при качественном и количественном восполнении кровопотери. Использование её обеспечивало увеличение ОЦК, содержания форменных элементов, гемоглобина, плазматического белка, факторов свёртывания, повышение иммунологической резистентности. Переливания консервированной крови в настоящее время применяются редко и главным образом в тех случаях, когда жизни пациента угрожает реальная опасность: при родах или травмах, при проведении хирургических операций, а также при лечении тяжёлых форм лейкозов при отсутствии в достаточном уровне её компонентов. В отличие от этой устаревшей практики сегодня для избирательной коррекции дефицита форменных элементов, белковых фракций крови, плазменного гемостаза методом фракционирования из цельной консервированной крови получают плазму, эритроцитарную массу, лейкоцитарный концентрат, тромбоцитарный концентрат и другие её компоненты [67, 170].
Донорская плазма (свежезамороженная плазма (СЗП) или патоген-инактивированная плазма) используется в течение многих лет в мировой практике. Только в США ежегодно используют 1,8–2,0 млн доз плазмы. СЗП содержит около 70 % обычного уровня всех факторов свёртывающей системы крови. Свежезамороженная плазма ввиду практически полной сохранности ее функций в обеспечении гемостатического равновесия оказывает наибольший эффект. Нативная (жидкая) и лиофилизированная (сухая) плазма — в значительной мере теряют лечебные свойства в процессе изготовления, поэтому их клиническое использование менее эффективно. Свежезамороженная плазма может храниться до 1 года при температуре –25C и ниже. Все факторы свёртывания крови, антикоагулянты, компоненты системы фибринолиза в течение этого времени в той или иной мере в ней сохраняются [67].
Показаниями к применению свежезамороженной плазмы являются: кровопотеря свыше 30 % от ОЦК, длительное кровотечение, восстановление уровня факторов свёртывания при терапии варфарином, тромботическая и тромбоцитопеническая пурпура [74, 112]. В настоящее время ряд эффективных препаратов разработаны на основе плазмы донорской крови. Широкое применение нашли криопреципитат, плазма нативная концентрированная, фибриноген и тромбин, которые получают из препаратов плазмы — корректоров системы гемостаза [67]. В наши дни в клинической практике имеется достаточно большой выбор препаратов фармацевтического гемостаза. По технологиям получения эти препараты подразделяют на два типа: генноинженерные и вирусинактивированные препараты из плазмы доноров. Препараты подразделяются на монофакторные и полифакторные (комплексные). В их числе при дефиците определенных факторов свёртывающей системы крови в качестве монопрепаратов используются факторы VII, VIII, IX, XIII, фактора Виллебранда и концентраты фибриногена [21].
В клинической практике по прежнему востребован криопреципитат плазмы крови при недоступности препаратов фактора VIII и фибриногена [16, 139]. Криопреципитат плазмы крови состоит из смеси высокомолекулярных криоглобулинов, которые получают из СЗП. В состав одной дозы криопреципитата входят: фактор VIII (80–120 ед. активности), фактор XIII (до 30 %), фибриноген, фибронектин и фактор Виллебранда (до 70 %). В зависимости от тяжести кровотечения и от объёма планируемой операции определяется доза криопреципитата, которую определяют следующим образом: 1 ME VIII фактора на 1 кг массы тела. Криопреципитат продолжают использовать при таких заболеваниях как гемофилия А [85], болезнь Виллебранда, ДВС-синдром в фазе гипокоагуляции [48, 136]. Отметим, что как и в случае с применением эритромассы, использование замороженной плазмы, концентрата тромбоцитов, а также криопреципитата может потенциально стать причиной заражения гемотрансмиссивными инфекциями [146].
При гемофилии А и болезни Виллебранда, используются препараты, содержащие FVIII и связанный с ним фактор Виллебранда: «Агемфил-А» (Россия), «Гемофил М» (США), «Иммунат» (Австрия), «Коэйт-ДВИ» (США), «Эмоклот Д. И.» (Италия), «Octanate» ( Австрия) [29, 103, 88].
В последнее время получили распространение высокоочищенные препараты FVIII. FVIII обладает прокоагулянтной активностью которая заключается в регуляции процесса образования активной протромбиназы [92, 150]. Фактор Виллебранда (FVIII:ФВ) — гликопротеин плазмы крови, образующий крупные олигомерные комплексы и обеспечивающий адгезию тромбоцитов на волокнах коллагена поврежденных сосудов в процессе свертывания крови. Дефицит или аномалии (FVIII:ФВ) приводят к одноименной болезни (болезнь Виллебранда). Снижение концентрации FVIII:ФВ, изменение структуры или уменьшение количества его рецепторов приводит к нарушениям адгезии и агрегации тромбоцитов [83].
Препараты, в состав которых входит FVIII, производят путем генно-инженерных технологий или выделяют отдельные компоненты плазмы крови. Концентрат FVIII более активен, чем криопреципитат и обеспечивает лучший гемостаз, так как при выделение белка из плазмы уровень очистки в 2000–15000 раз выше, чем у комплексно-факторных препаратов. В числе показаний к применению препаратов с FVIII является гемофилия А, в том числе с иммунным ингибитором к FVIII, а также неконтролируемые кровотечения при болезни Виллебранда [88].
Сравнительная оценка гемостатической активности соединения на основе фибрин-мономера в условиях экспериментальной геморрагии у интактных кроликов при его внутривенном введении в различных дозах. Выбор оптимальной дозы
Сравнительная оценка гемостатической активности соединения на основе фибрин-мономера проводилась в остром эксперименте на 6 группах кроликов. Каждой группе кроликов внутривенно вводилось соединение на основе фибрин-мономера в дозе фибрин-мономера 100 мкг/кг; 250 мкг/кг; 500 мкг/кг; 1000 мкг/кг; 2500 мкг/кг; 5000 мкг/кг массы тела. Полученные результаты представлены в таблицах 2 и 3.
В ходе анализа результатов выявлены две наиболее эффективные дозы соединения на основе фибрин-мономера. При внутривенном введении соединения на основе фибрин-мономера в дозах 250 мкг/кг и 2500 мкг/кг гемостатическая активность по времени остановки кровотечения через 30, 60 и 120 минут наблюдения составляла 69,79 %; 56,90 %; 63,70 % и 55,82 %; 54,65 %; 40,64 % соответственно. Аналогичная картина прослеживалась у гемостатической активности по объёму кровопотери, которая составляла через 30, 60 и 120 минут наблюдения 67,06 %; 68,49 %; 81,42 % и 62,33 %; 75,95 %; 39,36 % соответственно.
Для уточнения выбора дозы соединения на основе фибрин-мономера, совместно с Алтайским филиалом ФГБУ «НМИЦ гематологии» Минздрава России (директор филиала д. м. н., профессор Момот А. П.) мы провели оценку концентрации D-димеров в плазме крови после внутривенного введения соединения на основе фибрин-мономера в различных дозах в эксперименте на кроликах. Полученные результаты представлены в таблице 4.
Анализ результатов показал, что наиболее эффективными дозами соединения на основе фибрин-мономера являются дозы 250 мкг/кг и 2500 мкг/кг. В то же время, дозы соединения на основе фибрин-мономера свыше 1000 мкг/кг обладают значительной тромбогенностью, которая оценивалась по нарастанию концентрации D-димеров в плазме крови, являющихся классическим маркером фибринообразования и фибринолиза. Таким образом, в качестве наиболее эффективной и безопасной для дальнейших экспериментов была выбрана доза соединения на основе фибрин-мономера 250 мкг/кг.
Сравнительная оценка гемостатической активности порошков фибрин-мономера и тромбина при их аппликации на экспериментальную рану печени
Для сравнительной оценки гемостатической активности порошков фибрин-мономера и тромбина была определена гемостатическая активность по времени остановки кровотечения и по объёму кровопотери в остром эксперименте на интактных кроликах. Был исследован: порошок фибрин-мономера в дозах 25 мг, 50 мг, 100 мг. Проведена сравнительная оценка порошка фибрин-мономера в дозе 25 мг и тромбина в дозе 25 мг (375 ед. NIH). Полученные результаты представлены в таблице 15 и на рисунке 11.
На основании результатов исследования можно отметить, что порошок фибрин-мономера и порошок тромбина во всех исследуемых дозах смывался потоком крови и не успевал оказать кровоостанавливающего действия. В то же время, прижатие порошков марлевым тампоном приводило к выраженному снижению времени остановки кровотечения и объёма кровопотери.
Гемостатические свойства порошка фибрин-мономера в дозе 25 мг и 100 мг были ярко выражены. Показатели гемостатической активности по времени остановки кровотечения составляли 72,25 % и 73,87 % соответственно, а показатели гемостатической активности по объёму кровопотери — 88,98 % и 83,28 % соответственно. Гемостатическая активность по времени остановки кровотечения и объёму кровопотери порошка тромбина с прижатием марлевым тампоном составляла 72,92 % и 88,37 % соответственно. Приведённые результаты достоверно показывают, что порошок фибрин-мономера не уступает по своей гемостатической активности порошку тромбина.
Измерение показателей сосудисто-тромбоцитарного гемостаза при аппликации порошка фибрин-мономера в эксперименте на интактных кроликах
Следующим направлением работы было проведение экспериментов на кроликах по оценке влияния порошка фибрин-мономера на сосудисто-тромбоцитарный гемостаз. Показатели сосудисто-тромбоцитарного гемостаза изучались у интактного кролика до нанесения порошка фибрин-мономера и через 60 минут после нанесения на кровоточащую рану образца в дозе 25 мг. Результаты изменения значимых параметров свёртывающей системы крови представлены в таблице 19.
Результаты исследования показали, что АПТВ, тромбиновое время, протромбиновое время и концентрация фибриногена до разреза и через 60 минут после нанесения образца не подвергались достоверным изменениям. Было выявлено достоверное снижение агрегационной способности тромбоцитов на 7,83 % по отношению к контролю через 60 минут после нанесения образца.
Настоящее исследование проводилось по четырём направлениям.
Первым направлением данной работы явилось экспериментальное исследование гемостатической активности соединения на основе фибрин-мономера при его внутривенном введении в дозах 100; 250; 500; 1000; 2500; 5000 мкг/кг и определение D-димеров в плазме крови. В результате анализа полученных данных была выбрана оптимальная доза для дальнейшего изучения.
Второе направление нашей работы заключался в оценке гемостатической активности совместного применения соединения на основе фибрин-мономера в дозе 250 мкг/кг и -аминокапроновой кислоты в дозе 0,75 мл/кг массы тела при их внутривенном введении в условиях экспериментальной геморрагии. Было проведено сравнительное исследование соединения на основе фибрин-мономера и препарата эптаког альфа активированный при их внутривенном введении в дозах 250 мкг/кг и 90 мкг/кг соответственно.
Следующим направлением данной работы было изучение влияния соединения на основе фибрин-мономера на гемостатическую активность в условиях экспериментальной кровопотери (5–7 % и 7–20 % от ОЦК) и при замещающей инфузии в объёме 7 % от ОЦК 0,9 % раствором хлорида натрия.
Задача четвёртого направления данной работы заключалась в изучении локального применения композиций на основе фибрин-мономера в форме порошка и губки на экспериментальной модели раневой поверхности и определении влияния порошка фибрин-мономера на базовые параметры коагулограммы (ТВ, ПВ, АПТВ, концентрация фибриногена, агрегация тромбоцитов).
В ходе анализа результатов выявлены две наиболее эффективные дозы соединения на основе фибрин-мономера. При внутривенном введении соединения на основе фибрин-мономера в дозах 250 мкг/кг и 2500 мкг/кг гемостатическая активность по времени остановки кровотечения через 30, 60 и 120 минут наблюдения составляла 69,79 %; 56,90 %; 63,70 % и 55,82 %; 54,65 %; 40,64 % соответственно. Аналогичная картина прослеживалась у гемостатической активности по объёму кровопотери, которая составляла через 30, 60 и 120 минут наблюдения 67,06 %; 68,49 %; 81,42 % и 62,33 %; 75,95 %; 39,36 % соответственно.
Для уточнения выбора дозы соединения на основе фибрин-мономера, совместно с Алтайским филиалом ФГБУ «НМИЦ гематологии» Минздрава России (директор филиала д.м.н., профессор Момот А. П.) мы провели исследование концентрации D-димеров в плазме крови после внутривенного введения соединения на основе фибрин-мономера в различных дозах в эксперименте на кроликах. Исследования показали, что дозы соединения на основе фибрин-мономера выше 1000 мкг/кг обладают значительной тромбогенностью, которая оценивалась по нарастанию концентрации D-димеров в плазме крови, являющихся классическим маркером фибринообразования и фибринолиза. Таким образом, в качестве наиболее эффективной и безопасной для дальнейших экспериментов была определена доза соединения на основе фибрин-мономера 250 мкг/кг.
При внутривенном введении животным соединения на основе фибрин-мономера в дозе 250 мкг/кг было зафиксировано значительное увеличение гемостатической активности по времени остановки кровотечения. Её показатели составляли 69,79 % через 30 минут, 56,90 % через 60 минут и 63,70 % через 120 минут от исходного значения соответственно (при контроле 17,49 %; 19,85 % и 17,89 % от исходного значения соответственно). После введения соединения на основе фибрин-мономера было выявлено достоверное увеличение гемостатической активности по объему кровопотери на всех временных промежутках. Так, через 30 мин после введения соединения на основе фибрин-мономера гемостатическое действие увеличилось на 67,06 %, в то время как у контрольной группы оно составляло 10,54 %. После 60 мин наблюдения за экспериментальными животными гемостатическое действие составляло уже 68,49 %, а у контрольной группы соответствующий параметр составлял 34,60 %. К 120 минутам наблюдения гемостатическая активность по объему кровопотери у контрольной группы составляла 54,98 %, в то время как у экспериментальной группы она была 81,42 % от исходного значения. Сравнительная оценка результатов данной серии экспериментов показала высокую гемостатическую активность соединения на основе фибрин-мономера на протяжении первых 2-х часов после внутривенного введения.