Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Физиологическая роль и применение в медицине аминокислот, биогенных металлов (лития, кобальта, меди, цинка) и серебра (обзор литературы) 10
1.1. Роль незаменимых аминокислот в организме и их фармакологическое применение 10
1.2. Роль биометаллов в организме. Применение лития, кобальта, меди, цинка, серебра и их соединений в медицине 16
ГЛАВА 2. Объект и методы исследования .25
2.1. Объекты исследования .25
2.2. Оценка противомикробной активности 26
2.3. Определение параметров острой токсичности 27
2.4. Изучение противовоспалительной активности 28
2.5. Оценка влияния Li-L-Met на слизистую желудка и побочные эффекты индометацина 31
2.6. Изучение нейротропного действия Li-L-Met .34
2.7. Исследование кумуляции методом субхронической токсичности 37
2.8. Статистическая обработка данных .38
ГЛАВА 3. Сравнительная оценка биологической активности металлокомплексов метионина (результаты собственных исследований) .39
3.1. Первичная оценка антимикробной активности комплексов метионина с металлами .39
3.2. Исследование токсичности соединений метионина с литием, натрием, кобальтом, медью, цинком и серебром 40
3.3. Изучение противовоспалительных свойств металлокомплексов метионина на модели «каррагениновый отек лапки у крыс» 42
ГЛАВА 4. Биологические свойства Li-L-Met(результаты собственных исследований) .47
4.1. Изучение влияния Li-L-Met на течение хронического иммунного воспаления у крыс .47
4.2. Противоязвенное действие Li-L-Met .64
4.3. Изучение нейротропной активности Li-L-Met .70
4.4. Кумулятивный индекс Li-L-Met .84
ГЛАВА 5. Обсуждение результатов .87
Выводы 101
Научно-практические рекомендации .102
Список сокращений 103
Список литературы .104
- Роль биометаллов в организме. Применение лития, кобальта, меди, цинка, серебра и их соединений в медицине
- Определение параметров острой токсичности
- Исследование токсичности соединений метионина с литием, натрием, кобальтом, медью, цинком и серебром
- Изучение нейротропной активности Li-L-Met
Введение к работе
Актуальность темы исследования
Модификация структуры известных биологически активных соединений является одним из подходов к созданию новых лекарственных средств. В этом аспекте интерес представляют аминокислоты, являющиеся строительным материалом для белков и пептидов или лигандами рецепторов, ответственных за проявление специфических биологических эффектов; в результате метаболизма аминокислот синтезируются многие соединения, выполняющие важные биохимические функции в организме (Северин Е.С., Алейникова Т.Л., Осипов Е.В., 2008; Bertini I., 2007). Включение биологически активных группировок в структуру аминокислоты приводит к созданию оригинальных веществ, по биологической активности отличающихся от самой аминокислоты. Перспективность исследований в этом направлении подтверждена созданием таких лекарственных препаратов как лития оксибутират, натрия оксибутират, фенибут (Любимов Б.И., Яворский А.Н., 1983; Тюренков И.Н., 1987).
На кафедре фармакологии Казанского государственного медицинского
университета Залялютдиновой Л.Н., Хафизьяновой Р.Х. и др. на протяжении
нескольких лет изучались новые комплексы и композиции аминокислот с
микроэлементами, созданные в Казанском государственном университете (в
настоящее время Казанский федеральный университет) под руководством
профессора Захарова А.В. и доцента Штырлина В.Г. (Захаров А.В., Штырлин
В.Г., 1985). В ходе этих исследований были разработаны композиции и
комплексы с противоопухолевой, противоязвенной, антианемической,
антидепрессивной, антиаритмической, антигипоксической активностью
(Патент РФ №2114853 от 10.07.1998; Патент РФ №2125874 от 10.02.1999; Патент РФ № 2151773 от 27.06.2000; Патент РФ №2151596 от 27.06.2000; Патент РФ №2173553 от 20.09.2001 и др.).
Наши исследования направлены на изучение биологических свойств
новых комплексов метионина с металлами - литием, кобальтом, медью,
цинком, серебром. Проявление интереса к этим комплексам было вызвано с
одной стороны тем, что метионин является незаменимой аминокислотой,
выполняющей в организме множество уникальных функций: выступает
донором метильных групп при биосинтезе адреналина, полиаминов, холина,
креатина, фосфолипидов; и серы - при биосинтезе цистеина, активирует
действие гормонов, витаминов, ферментов, важна его роль в процессах
детоксикации в печени, в реакции биосинтеза белка (Гараева С.Н., Редкозубова
Г.В., Постолати Г.В., 2009). В медицинской практике метионин применяется
как гепатопротектор, антиоксидант, липотропное средство, а его активное
производное – адеметионин используют для профилактики и лечения
различных заболеваний печени, при атеросклерозе и в качестве
антидепрессанта (Горьков В.А., Олейчик И.В., Раюшкин В.А., 2000; Буеверов А.О., 2001). С другой стороны, биометаллы – литий, кобальт, медь, цинк играют ключевую роль в биохимических процессах живого организма, входят в состав ряда ферментов и высокоспециализированных белков, обладающих
энзиматическими, иммунологическими, гормональными, сократительными, рецепторными, регуляторными, транспортными и иными функциями (Хьюз М., 1983; Скальный А.В., 2004). Для многих соединений с металлами – медью, цинком, серебром характерны противомикробные и противовоспалительные свойства, а соединения лития применяются в психиатрии для лечения маний и депрессий (Панченко Л.Ф., Маев И.В., Гуревич К.Г., 2004).
Исследования по теме нашей диссертации выполнялись в рамках общего научного направления кафедры фармакологии Казанского ГМУ «Изыскание и изучение новых лекарственных средств».
Цель исследования – сравнительная оценка биологических свойств металлокомплексов метионина с литием, кобальтом, медью, цинком, серебром.
Задачи исследования:
1. Изучить в сравнительном аспекте противомикробную активность
комплексов метионина с литием, кобальтом, медью, цинком и серебром в
опытах in vitro, острую токсичность для крыс, противовоспалительное действие
на модели острого воспаления («каррагениновый отек лапки у крыс»), выбрать
для дальнейшего изучения наименее токсичное и наиболее перспективное
соединение и оценить его кумулятивные свойства.
2. Изучить влияние комплекса метионина с литием (Li-L-Met) на течение
хронического иммунного воспаления на модели адъювантного артрита у крыс в
сравнении с диклофенаком и метотрексатом.
3. Изучить противоязвенное действие Li-L-Met при внутрижелудочном
способе введения на моделях алкогольного повреждения слизистой желудка и
индометацинового ульцерогенеза в сравнении с L-метионином и натрия
метионинатом (Na-L-Met).
4. Оценить влияние Li-L-Met на противовоспалительное и
гепатотоксическое действие индометацина.
5. Исследовать некоторые аспекты нейротропного действия Li-L-Met на
мышах и крысах в поведенческих тестах («открытое поле», «Т-образный
лабиринт», «приподнятый крестообразный лабиринт», «темная/светлая
камера», «поведенческое отчаяние» по Porsolt).
Научная новизна. В исследованиях in vitro впервые установлено, что комплексы метионина с серебром (Ag(L-Met)2) и литием (Li-L-Меt) обладают противомикробной активностью в отношении бактерий рода E. сoli, Bacillus cereus, Ps.аeruginosa, S.aureus и грибка Candida albicans. Получены данные, характеризующие острую токсичность комплексов метионина с медью (Cu(L-Met)2 и Cu(D-Met)2) при внутрибрюшинном введении и токсикологические свойства Li-L-Меt, Na-L-Met при внутрижелудочном введении. На основании оценки параметра «кумулятивный индекс» доказано отсутствие кумулятивных свойств у Li-L-Met.
На модели «каррагениновый отек лапки у крыс» показано противовоспалительное действие комплексов метионина с медью при местном применении, а также комплекса метионина с литием при внутрижелудочном и внутрибрюшинном применении. На модели «адъювантный артрит у крыс» показано противовоспалительное действие Li-L-Met, которое по эффекту
торможения развития воспалительного отека сопоставимо с таковым у
диклофенака и метотрексата, и антиревматоидное действие, которое по
лечебному влиянию на костно-суставную систему, подтвержденному данными
лабораторных и рентгенологических исследований, сопоставимо с таковым у
метотрексата. Кроме того, Li-L-Met имеет преимущество перед препаратами
сравнения, увеличивая выживаемость животных и корригируя
психоэмоциональные нарушения у крыс с адъювантным артритом. Показано
противоязвенное действие Li-L-Met на моделях этаноловой и индометациновой
язвы желудка и защитное действие в отношении ульцерогенного и
гепатотоксического побочных эффектов индометацина. Показана
дозозависимая седативная, анксиолитическая, антидепрессивная активность Li-L-Met. Обнаружено, что комплекс Li-L-Met в отличие от лития карбоната и метионина улучшает обучаемость и память экспериментальных животных.
Теоретическая и практическая значимость работы. Результаты
проведенных исследований дают представление о токсико-фармакологических
свойствах нового ряда металлокомплексов метионина – с литием, кобальтом,
медью, цинком, серебром в сравнительном аспекте. Данная работа расширила и
углубила теоретические сведения о биологических свойствах Li-L-Met, ранее
изучаемого на кафедре как потенциальное противоопухолевое и
антианемическое средство. Были дополнены знания о токсичности и спектре
фармакологических эффектов данного комплекса, обнаружено и доказано
наличие у соединения антимикробной, противовоспалительной,
антиревматоидной, противоязвенной активности и нейротропного действия.
Результаты проведенных исследований открывают перспективы для
продолжения экспериментальной работы по углубленному изучению
противомикробных свойств комплексов метионина с литием и серебром и
противовоспалительных свойств комплексов метионина с медью в виде мазей, а
также механизмов противовоспалительного, антиревматоидного,
противоязвенного, нейротропного действия Li-L-Met и возможности создания нового лекарственного средства на его основе.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
В ряду комплексов метионина с кобальтом, медью, цинком, серебром Li-L-Met является малотоксичным соединением, хорошо переносится животными, не кумулирует при длительном применении, проявляет противомикробное, противовоспалительное, противоязвенное действие.
-
На модели адъювантного артрита у крыс Li-L-Met по эффективности сопоставим с диклофенаком и метотрексатом.
3. Li-L-Met вызывает нейротропные эффекты у экспериментальных
животных.
Степень достоверности. Достоверность данных проведенного
исследования подкреплена проведением достаточного объема исследований с использованием оптимального числа животных и применением адекватных методик оценки эффективности и методов статистической обработки.
Апробация результатов. Материалы диссертации доложены и
обсуждены на ХVII, 87, 88, 89, 90-й Всероссийских научно-практической
конференциях «Молодые ученые в медицине» (г. Казань, 2012, 2013, 2014,
2015, 2016 гг.), IV съезде фармакологов России «Инновации в современной
фармакологии» (г. Казань, 2012 г.), VI Российской научно-практической
конференции, посвященной 200-летию Казанского государственного
медицинского университета «Здоровье человека в XXI веке» (г. Казань, 2014г.).
Публикации. По материалам диссертационного исследования
опубликовано 14 печатных работ, в том числе 4 статьи в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ для публикации результатов диссертационных исследований.
Внедрение результатов в практику. Результаты диссертационного исследования внедрены в учебный процесс кафедры фармакологии ФГБОУ ВО Казанский ГМУ Минздрава России (лекции и практические занятия) и в научно-исследовательскую работу химического института им. А.М. Бутлерова ФГАОУ ВО «Казанский (Приволжский) федеральный университет».
Личный вклад автора. Приведенные в работе данные получены лично
автором или при личном участии автора во всех этапах работы: определение
цели и задач, построение плана работы, выбор методов, организация и
воспроизведение экспериментов, статистическая обработка и анализ
полученных данных, написание публикаций по теме исследования и оформление их в печать. Выводы и положения, выносимые на защиту, сформулированы лично автором.
Объем и структура диссертации: Диссертация изложена на 131 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы (1 глава), описания объектов и методов исследования (2 глава), изложения результатов собственных исследований (3, 4 главы), обсуждения результатов (5 глава) и выводов. Работа иллюстрирована 30 таблицами и 15 рисунками. Список использованных источников и литературы включает 205 источников, в том числе 124 отечественных и 81 иностранных авторов.
Роль биометаллов в организме. Применение лития, кобальта, меди, цинка, серебра и их соединений в медицине
Неорганические соединения металлов широко использовались в практической медицине еще с давних времен в качестве антисептических средств: медь, серебро, золото. Препараты меди и серебра и сейчас применяются в качестве противомикробных и антисептических средств [56], а препараты золота применяются для терапии тяжелых форм артрита (ревматоидного артрита, псориатической артропатии, болезни Бехтерева, синдрома Рейтера) [38,162], исследования по изучению их биологической активности продолжаются, так, к примеру, в 2012 году была выявлена эффективность ауранофина в отношении Entamoeba histolytica [125, 151].
Открытие комплексов платины Розенбергом и создание препарата («Цисплатин»), который в настоящее время успешно применяется в онкологической практике [1,74,183] повысило интерес к исследованиям по поиску новых лекарственных средств среди соединений различных металлов и их комплексов с биологически активными структурами. В результате были синтезированы координационные соединения и металлоорганические комплексы кремния, галлия, титана, железа, рутения, родия, палладия, меди и золота с противоопухолевой активностью, антимикробным действием [191]. Особый интерес в этой области представляют комплексные соединения незаменимых аминокислот с биометаллами, потому что те и другие, оказывают на организм разностороннее влияние, вступая в связь с органическими веществами, синтезируемыми в живых клетках, влияя на оплодотворение, рост, развитие, иммунобиологические свойства, дыхательную и другие важнейшие функции [11,45,112]. К биогенным металлам относят Na, K, Mg, Ca; Mn, Fe, Co, Cu, Zn, Mo. Биометаллы являются центрами около 30% всех ферментативных систем. Так, Mg и Zn участвуют в реакциях ферментативного гидролиза; металлы, проявляющие переменную валентность и переменное координационное число (Cu, Fe, Mo), регулируют многие окислительно-восстановительные процессы [115].
Большинство металлов присутствуют в организме и выполняют свои определенные биологические функции в виде солей, гидратов (сольватов) или биокомплексов, т.е. координационных соединений с различными лигандами, к которым относятся аминокислоты, их анионы, пептиды, белки, фосфолипиды и др. соединения [26]. Хорошими комплексообразователями как правило являются переходные металлы - ванадий, хром, марганец, железо, кобальт, медь, никель, и цинк, также их называют биометаллы, «организаторы жизни» [119]. Способность связываться с лигандами зависит и от величины ионного радиуса катиона. Чем меньше ионный радиус, тем прочнее хелатные комплексы [62]. Магний к примеру, является достаточно сильным комплексообразователем и служит центром металлоферментов – активаторов фосфотрансферразы и фосфогидразы, катализирует гидролиз АТФ [132].
Литий относится к группе щелочных металлов, является биологически активным микроэлементом. В организме участвует в физиологических процессах, протекающих с участием натрия, калия, кальция, магния. Обладает сходством с этими металлами по физико-химическим свойствам (натрий, калий), близким ионным радиусом (магний) и плотностью заряда (кальций). Литий имеет диагональное сходство с магнием в кислотно-основных и окислительно-восстановительных свойствах (в частности, обладают способностью образовывать металлоорганические соединения) и является его функциональным аналогом [71], а также имеет наименьший ионный радиус (0.06 нм) среди металлов своей группы. Эти свойства лития делают его интересным не только для бионеорганической химии, но и для фармакологии.
Ионы лития всасываются из желудочно-кишечного тракта, 95% лития выделяется из организма с мочой, около 1% - через ЖКТ и до 4% - с потом [101]. Гематоэнцефалический барьер проницаем для лития, концентрация его в спиномозговой жидкости составляет около 40% от содержания в плазме. Еще в XIX веке литий начали применять в медицине в качестве антиподагрического средства, о чем писали G. Binswnger (1847), D. Garrod (1861); Schilling (1862). Литий, связываясь с мочевой кислотой, образует лития урат, легкорастворимую соль, ощелачивает мочу и увеличивает суточное образование и выделение мочи, что благоприятствует выведению из организма конечных продуктов азотистого обмена (какими являются аммиак, мочевина и мочевая кислота) [43]. До недавнего временя цитрат или бензоат лития входили в состав препарата уродан, применявшегося в качестве противовоспалительного, дезинфицирующего, диуретического и противоподагрического средства [58].
Еще в 1871 году Вильям Хамонд предложил большие дозы бромида лития для лечения «острой мании» и «острой меланхолии». Датский невролог Карл Ланге прописывал смесь солей щелочных металлов, в которой литий был главным компонентом, для лечения «периодической депрессии». В начале 20 века лития бромид успешно применялся как седативное и противосудорожное средство [99]. В середине XX века психотропное действие солей лития впервые подтверждено экспериментально [154]. Последующие исследования показали, что инъекции карбоната лития оказывают на животных сильный успокаивающий эффект [173]. Экспериментальная терапия пациентов с диагнозом мании, шизофрении и депрессии дала положительные результаты в случаях мании [134,135].
В настоящее время соли лития - карбонат, цитрат, хлорид, иодид, оксибутират, ацетат, пролонгированные формы лития карбоната и комбинированный препарат лития – литонит (литиевая соль никотиновой кислоты) широко используются для лечения маний. В отличие от других психоактивных средств, в терапевтических концентрациях прием лития не производит психотропных эффектов у здоровых людей [25,65,69,188].
Литий обладает свойствами предупреждать склероз, диабет, болезни сердца, аритмии и гипертонию, кожные заболевания [144,200,201,202]. Кремы на основе лития показали свою эффективность в терапии генитального герпеса [193,203]. Известно, что ионы лития участвуют в иммунных, гомеостатических и адаптационных реакциях организма [42]. Экспериментально выявлена способность соединений лития увеличивать уровни противовоспалительных цитокинов и снижать продукцию провоспалительных цитокинов [168,139,177]. Во многих работах показано протективное действие препаратов лития при острых ишемических состояниях в отношении эндотелия сосудов и нейронов ЦНС [70], а также в отношении гипоксии и ишемии других органов [60,61]. Имеются данные о способности лития уменьшать эффекты эмоционально-болевого стресса [107], оказывать влияние на экспрессию обеих NO-синтаз [15], а также о способности активировать дыхательную цепь митохондрий [34, 114,182].
Соли лития применяются в психиатрии для лечения биполярных расстройств, однако они обладают малой широтой терапевтического действия: в концентрациях ниже уровня лития 0,5 ммоль/л не оказывают лечебного эффекта, а выше уровня 0,8 ммоль/л оказывают токсическое действие на почки, щитовидную железу, кроветворение, ЦНС, могут привести к летальному исходу [56,63,170]. Еще один недостаток неорганических соединений лития – это их сравнительно высокая токсичность (так, ЛД50 лития карбоната около 200 мг/кг для крыс) и способность подавлять иммунитет; к тому же лития карбонат не растворим в воде, неустойчив и гигроскопичен. Период полуэлиминации для лития составляет 20-24 ч, что может способствовать накоплению лития в организме при длительном приеме литий-содержащих препаратов. Однако объективно положительная динамика при успешной литиевой терапии превосходит негативное влияние возможных побочных эффектов [73].
Определение параметров острой токсичности
Методика приподнятого крестообразного лабиринта (ПКЛ) [157], прообразом которой был Y-образный лабиринт Монтгомери [174] применялась для оценки уровня тревожности грызунов. Для тестирования крыс мы использовали приподнятую на 100 см от пола установку, состоящую из четырех крестообразно расходящихся от центральной площадки (101010 см) под прямым углом рукавов (101050 см) - два противоположных открытых, без стенок, с прозрачным, как и на центральной площадке, полом, и два закрытых, непрозрачных, темных. Для тестирования мышей применяли установку с центральной площадкой 555 см, а рукавами - 5525см. Эксперименты проводили при обычном дневном освещении открытых рукавов. Перед тестированием животных выдерживали 5 минут в темных клетках. Затем крысу или мышь помещали в ПКЛ на центральную площадку, головой к открытому рукаву, и в течение 5 минут регистрировали время пребывания на центральной площадке, в открытых, закрытых рукавах, количество заходов в светлые и темные рукава, стоек и свешиваний в открытых рукавах. Критерием анксиолитического эффекта считали увеличение времени пребывания в открытых рукавах и числа заходов в открытые рукава без увеличения количества переходов между, увеличения числа свешиваний с открытых рукавов [97].
Методика оценки поведения в темной/светлой камере [141]. В основе методики лежит природное стремление крыс и мышей избегать ярко освещенных мест, прятаться в темные норки. Для проведения оценки поведения предварительно выдерживали мышь в течение 3 минут в темной клетке, а затем помещали в ярко освещенную часть двухкамерной установки с перегородкой и лазом 5х5 см между темной и светлой половинами. Регистрировали число переходов мыши между светлым и темным отсеками за 3 минуты и латентное время до первого посещения темного отсека. Седативное и анксиолитическое действие оценивалось по увеличению латентного времени до первого захода в темный отсек и уменьшению число переходов между отсеками камеры [97].
Тест «поведенческого отчаяния» по Porsolt применяли для оценки антидепрессантного действия веществ. Крысу или мышь помещали в стеклянный цилиндр диаметром 10 см и высотой 40 см (для крыс) или цилиндр диаметром 10 см и высотой 25 см (для мышей), на 1/3 заполненный водой с температурой 25-27 С. Регистрировали в течение 5 минут время активного плавания, длительность иммобилизации, латентное время до первой иммобилизации, число попыток выбраться из воды (прыжки или ныряние) в поисках выхода. Критерием наличия антидепрессантного эффекта считали увеличение латентного времени до первой иммобилизации грызуна, увеличение времени активного плавания, увеличение числа попыток выбраться из воды и уменьшение длительности иммобилизации по сравнению с контролем [184,185].
По методике «условного рефлекса с положительным подкреплением в Т-образном лабиринте» [97] оценивали влияние Li-L-Met на скорость обучения пищевому рефлексу. До обучения животных на 48 часов лишали пищи, сохраняя свободный доступ к воде, кормление стандартными кормами проводили после сеанса обучения. В течение 2-х первых дней каждое животное высаживали в лабиринт на 5 минут для привыкания к условиям эксперимента. В последующие дни начинали обучение условному рефлексу. Животное помещали в стартовый отсек лабиринта. Через 30 с открывали дверцу, одновременно подавая звуковой сигнал в виде щелчка по стенке установки, который служил условным раздражителем, и давали животному возможность свободного поиска кормушки с едой, расположенной в правом рукаве. В качестве положительного пищевого подкрепления использовали кусочки хлеба с зерновыми добавками. Ежедневно животные делали по 10 учебных побежек. Время побежки до кормушки 10 с и менее считалось за сформированный рефлекс. Также критерием выработки рефлекса считали 7 и более правильных ответов из 10 сделанных. Рассчитывали среднее для группы время правильных побежек от стартового отсека до кормушки, подсчитывали число правильных ответов и число неправильных ответов (заходов в пустой рукав). В группах контроля и опыта сравнивали полученные показатели.
При выборе доз для исследования хронической токсичности фармакологического вещества следует учитывать его кумулятивное действие. Поэтому до проведения хронических токсикологических исследований часто возникает потребность в определении индекса кумуляции фармакологического вещества. Для этой цели можно использовать различные методы, основанные на учете гибели животных при повторном введении фармакологического вещества.
При исследовании кумуляции Li-LMet предпочтение отдали оценке кумуляции методом субхронической токсичности по Lim et al. [97,166], позволяющему оценить не только кумулятивные свойства, но и привыкание, с минимальным числом животных в группе - 10 особей. Эксперименты выполнены на 20 белых мышах-самцах массой 27-30 г. Li-LMet вводили мышам опытной группы ежедневно в/б, начиная с 0,1 от ЛД50. Каждые 4 дня дозу увеличивали в 1,5 раза согласно алгоритма Lim R.K. и соавторов до завершения опыта. Мышам группы контроля вводили воду для инъекций. Регистрировали поведение, массу тела и день гибели животных. Суммарная доза, введенная животному за все время опыта, составляет 12,8 ЛД50, максимальная продолжительность эксперимента 24±4 дня. Вывод об эффекте вещества делается на основании величины коэффициента кумуляции (Кк), который рассчитывают по отношению ЛД50n (при кратном введении) к ЛД50 при однократном введении: если Кк 1 вещество кумулирует, а если Кк1 – к веществу развивается привыкание.
Исследование токсичности соединений метионина с литием, натрием, кобальтом, медью, цинком и серебром
Изучаемый комплекс метионина с литием на модели адъювантного артрита проявил противовоспалительную активность, сопоставимую с таковой у диклофенака, и, в отличие от НПВС, предупреждал гибель животных по сравнению с контролем. У крыс, получавших лечение Li-L-Met, не наблюдали некрозов больных лапок, ухудшения аппетита, потери массы тела. Крысы в этих группах были активнее, чем крысы из групп диклофенака и контроля.
Оценка эффективности Li-L-Met при экспериментальной терапии адъювантного артрита у крыс в сравнении с метотрексатом. Выявленная нами на модели АА противовоспалительная активность Li-L-Met, его хорошая переносимость животными, стойкость противовоспалительного эффекта после его отмены и улучшение выживаемости крыс с АА по сравнению с диклофенаком, послужили основанием для дальнейшей оценки эффективности Li-L-Met при хроническом иммунном воспалении в сравнении со средством базисной терапии ревматоидного артрита у людей – метотрексатом [66,67,124,126].
Эксперимент выполнен на 32 крысах линии Wistar. Крысам моделировали АА, а изучаемые вещества вводили в/б с 15 дня от начала эксперимента (по лечебной схеме): в опытных группах – Li-L-Met 100 мг/кг ежедневно в течение 30 дней или метотрексат – 1 мг/кг один раз в неделю в течение 3 месяцев, а в контроле – воду для инъекций 1 мл/100г (в эквиобъеме).
После моделирования артрита в течение суток возникала первичная воспалительная реакция в лапке, которая нарастала к 3-му дню и проявлялась в виде покраснения, отека лапы, болезненности при пальпации. Отек лапки крыс в контрольной группе относительно исходного был принят за 100% и к 3 дню составил в среднем 1,05±0,04 мл. Вторичное усиление отека в суставах до 1,2±0,02мл наблюдали на 18 сутки, что было достоверно больше по сравнению с измерениями на третьи сутки. К 4 неделе эксперимента у контрольных животных с адъювантным артритом наблюдали генерализацию процесса с формированием вторичных изменений в виде усиления и распространения отека на вышележащие суставы, появления единичных пальпируемых подкожных узелков на хвосте. К 5-6-й неделе у животных в контрольной и опытных группах с АА наблюдали различающиеся по степени выраженности региональные вторичные изменения в виде деформации и ограничения движения в мелких суставах стоп, голеностопных, коленных и тазобедренных суставах (Рисунок 9).
Рисунок 9 – Влияние лечебного введения Li-L-Met и метотрексата на отек лапки у крыс с адъювантным артритом в динамике – р 0,05 по сравнению с контролем
Достоверный противовоспалительный эффект при терапии метотрексатом наблюдался через 3 недели терапии, когда метотрексат подавлял отек на 19%. Лечебный эффект Li-L-Met проявился через 2 недели терапии (30 день опыта), когда подавление отека составило 18,8% (p 0,05) по сравнению с контролем. Противовоспалительная активность Li-L-Met в конце 4 недели терапии (45 день опыта) составила 39,5%, а метотрексата - 29,29% (p 0,05). Статистически значимых различий между группами не наблюдали. После завершения 3 месячного курса терапии метотрексатом (103 день опыта) выраженность воспалительного отека у животных в данной группе уменьшилась на 43,85% по сравнению с контролем. Li-L-Met на этом сроке оказывал аналогичное действие, достоверно подавляя отек на 45,6%, хотя лечение было прекращено уже двумя месяцами ранее (Рисунок 9,10). Влияние лечебного введения Li-L-Met и метотрексата на отек лапки у крыс с адъювантным артритом в разные сроки эксперимента (в % относительно контроля) – р 0,05 по сравнению с контролем Проведенная на 10-й неделе опыта компьютерная рентгеновская томография (КРТ) выявила у контрольных крыс с АА подвывихи проксимальных фаланговых суставов, изъеденность по суставной поверхности коленных и голеностопных суставов, сужение суставных щелей межфаланговых и плюстнефаланговых суставов, утолщение и разволокнение кортикальных слоев плюсневых костей, крупные эрозии в дистальных отделах бедренной кости, плотный отек мягких тканей по сравнению с интактными животными (рисунок 11 а, б). В группах крыс, леченых Li-L-Met и метотрексатом, наблюдали небольшие сужения суставных щелей, единичные кистовидные просветления бедренных костей и единичные эрозии суставных поверхностей. Плотность отека мягких тканей лапок крыс в группе Li-L-Met была значительно меньше чем в контроле (Рисунок 11 в, г). в г
КРТ суставов задней лапы у крыс в опыте с адъювантным артритом на 10-й неделе эксперимента: а) в интактной группе; б) в контрольной группе; в) в группе, получавшей метотрексат; г) в группе, получавшей Li-L-Met На 18-й неделе опыта на компьютерных рентгенограммах задних лап трех выживших контрольных крыс с адъювантным артритом наблюдали припухлость мягких тканей, выраженное сужение суставных щелей и деформации межфаланговых суставов, девиации концевых фаланг, утолщение и разволокнение кортикальных слоев фаланговых, плюсневых костей, субхондральный склероз в плюстнефаланговых суставах (Рисунок 12 а,б).
КРТ суставов задних лапок у крыс в опыте с адъювантным артритом на 18-й неделе эксперимента (135-е сутки): а) в интактной группе; б) в контрольной группе; в) в группе, получавшей метотрексат; г) в группе, получавшей Li-L-Met
На рентгенограммах задних лапок крыс с АА, после курса терапии метотрексатом и Li-L-Met наблюдали, что девиации и подвывихи проксимальных фаланг, кистовидные просветления и сужения суставных щелей у крыс в этих группах выражены меньше, чем в контроле (Рисунок 12 в, г). Меньше были выражены субхондральный склероз фаланговых костей и костные разрастания краевых проксимальных фаланг. Плотность отека была выражена меньше.
Прогрессирование АА у контрольных животных сопровождалось снижением прироста массы тела крыс, и к концу опыта разница контроля с интактными животными по массе составила 18,8 % (Таблица 7).
Изучение нейротропной активности Li-L-Met
В мировой литературе широко освещена тема изучения биологических свойств аминокислот, биогенных металлов и их соединений. Известна роль незаменимых аминокислот в обменных процессах, в нейромедиаторной передаче, в работе нервной, мышечной, сердечно-сосудистой, пищеварительной, иммунной и др. систем организма, также, как и роль биогенных металлов в регуляции функциональной деятельности практически всех систем организма и включение их в состав множества биологически активных структур.
На кафедре фармакологии Казанского государственного медицинского университета проводятся исследования, направленные на углубление знаний о биологических свойствах аминокислот и их соединений с различными металлами с целью поиска среди них новых потенциальных лекарственных препаратов. Для этих соединений ранее было доказано антиаритмическое, противоязвенное действие, противоопухолевая активность, влияние на кроветворную функцию и др., что подтверждено рядом патентов. Наша научная работа представляет одно из направлений плана научных исследований кафедры. Настоящее исследование посвящено изучению некоторых биологических свойств металлокомплексов незаменимой аминокислоты метионина и их сравнительной оценке.
Исследуемые комплексы метионина с литием, кобальтом, медью, цинком и серебром были синтезированы в Казанском Федеральном (Поволжском) университете под руководством заведующего лабораторией координационных соединений Ю.Г.Штырлина с сотрудниками.
Опираясь на общеизвестный факт, что многие соединения металлов широко применяются как противомикробные средства, мы определили противомикробную активность новых синтезированных химиками комплексов. Результаты исследований показали, что в опытах in vitro растворы комплексов метионина с серебром (0,005%) и литием (1%) проявляли антибактериальные свойства в отношении E. сoli, Bacillus cereus, Ps.аeruginosa, S.aureus и антимикотические свойства в отношении грибка Candida albicans, вызывая задержку зоны роста микроорганизмов. Сам метионин (D- или L-) в изученных концентрациях (1%) не влиял на зоны роста исследуемых штаммов. Новый комплекс метионина с серебром (0,0048%), использованный в концентрации в 200 раз меньшей, чем протеинат серебра (1%), проявлял близкую к нему антимикробную активность, так же, как и 1% раствор Li-L-Met, подавляя при этом в отличие от протеината серебра рост спорообразующих палочек. Комплекс метионина с медью (1%) и препарат сравнения - меди сульфат (1%) проявляли аналогичную антибактериальную активность, но не задерживали рост Candida albicans. Однако эффективность меди метионината была обусловлена антимикробной активностью растворителя (полиэтиленгликоля). Комплексы метионина с кобальтом (0,0718%) и цинком (0,0135%), имеющие ограниченную растворимость в воде, в доступных концентрациях не проявили антимикробную активность. На основании этих данных, можно полагать, что для дальнейшего углубленного изучения противомикробных свойств металлокомплексов метионина представляют интерес соединения лития и серебра. Параметры острой токсичности удалось определить только для метионинатов меди. Остальные комплексы из-за ограниченной растворимости невозможно было ввести в достаточной дозе, чтобы определить параметры острой токсичности для животных. При в/ж введении максимально вводимая доза Li-L-Met составила 3500 мг/кг. В этой дозе комплекс не вызывал гибели крыс, но оказывал незначительное раздражающее действие, вызывал угнетение в течение 1-2 часов, полидипсию, полиурию, диарею в течение 1-2 суток. Угнетающее действие препарата развивалось через несколько минут после введения, что может указывать на его хорошую биодоступность и тропность к ЦНС. У аналога, содержащего в структуре вместо лития натрий (Na-L-Met), при в/ж введении максимальная введенная доза составила 3840 мг/кг. В этой дозе вещество оказывало раздражающее действие, что проявилось сокращением мышц живота после введения соединения и агрессивностью животных длительностью до 30 минут, и также вызывало у животных полидипсию. При оценке кумулятивных свойств по Lim et al. рассчитанный по формуле коэффициент кумуляции для Li 89 L-Met составил 1,12, что свидетельствовало об отсутствии кумуляции у комплекса. Это предполагает возможность его длительного применения.
В/б введение токсических доз медных комплексов аминокислоты вызывало у крыс симптом «корчи» длительностью до 1 часа, цианоз кожи и слизистых, расширение хвостовых вен (визуально), замедление двигательной активности, и гибель в течение 2 часов на фоне судорог и асфиксии.
Параметры токсичности комплексов L- и D-метионина с медью, определенные при в/б введении, составили для Cu(L-Met)2: ЛД50=75,0±3,7 мг/кг, ЛД16=66 мг/кг, ЛД84=86 мг/кг, ЛД100=100мг/кг, а Cu(D-Met)2: ЛД50=43,0±4,54 мг/кг, ЛД16=35 мг/кг ЛД84=65 мг/кг, ЛД100=87,5 мг/кг. По-видимому, здесь играет роль изомерия вещества, так как комплекс с D-изомером оказался почти в 2 раза токсичнее комплекса L-изомера аминокислоты. По классификации К.К. Сидорова [32] комплексы метионина с медью относятся к умеренно токсичным веществам.
В литературе имеются данные об эффективности активного метаболита метионина – адеметионина при остеоартритах [23,199,202]. На этом основании мы сочли целесообразным изучить противовоспалительную активность исследуемых комплексов метионина.
Сравнительная оценка противовоспалительной активности на модели каррагенинового отека лапки у крыс позволила установить, что при местном применении в виде мазей противовоспалительную активность проявляют комплексы метионина с медью. Так, 1% мази, содержащие комплексы L-, D- и DL- метионина с медью, достоверно подавляли выраженность отека на 48%, 47% и 37% соответственно, что было сопоставимо с активностью 1% мази диклофенака натрия. Причем этот эффект не зависел от L- и D- изомерии аминокислоты. Мази с метионином, его литиевым, кобальтовым, цинковым комплексами не влияли на выраженность острого воспаления.