Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы .12
1.1. Понятие о воспалении и механизм развития воспаления. 12
1.1.1. Понятие о воспалении 12
1.1.2. Механизм развития воспаления 13
1.2. Фармакологическая регуляция воспаления .15
1.2.1. Глюкокортикоиды 16
1.2.2. Нестероидные противовоспалительные средства .18
1.3. Методы изучения новых потенциальных противовоспалительных средств 24
1.4. Некоторые лекарственные средства, обладающие противовоспалительным действием 27
Глава 2. Материалы и методы 30
2.1. Материалы .30
2.2. Объекты исследования .31
2.2.1. Производные гетероциклических соединений ряда 2(5Н)-фуранона... 31
2.2.2. Четвертичная соль фосфония — н-гексадецилтрифенилфосфония бромид 34
2.3. Объём исследования .35
2.4. Методы .37
2.4.1. Изучение мембранотропной активности новых потенциальных противовоспалительных молекул .37
2.4.1.1. Влияние новых потенциальных противовоспалительных молекул на осмотический гемолиз 37
2.4.1.2. Влияние новых потенциальных противовоспалительных молекул на свободнорадикальный гемолиз .39
2.4.2. Влияние новых потенциальных противовоспалительных молекул на агрегацию тромбоцитов, индуцированную 1 мМ арахидоновой кислотой 39
2.4.3. Каррагениновый отёк лап мышей (крыс) 41
2.4.4. Формалиновый отёк лап мышей 41
2.4.5. Метод поиска литературы 42
2.4.6. Статистическая обработка 43
Результаты и их обсуждение
Глава 3. Сравнительное изучение развития во времени каррагенинового и формалинового отёков лап мышей .45
3.1. Систематический обзор по изучению развития во времени каррагенинового и формалинового отёков лап грызунов 45
3.2. Экспериментальное сравнительное изучение развития во времени каррагенинового и формалинового отёков лап мышей при длительном наблюдении 47
3.2.1. Каррагениновый отёк лап мышей 47
3.2.2. Формалиновый отёк лапы мышей .48
Глава 4. Противовоспалительная активность некоторых традиционных нестероидных противовоспалительных средств при длительном наблюдении 52
4.1. Противовоспалительная активность некоторых традиционных нестероидных противовоспалительных средств на модели формалинового отёка лап мышей при длительном наблюдении 52
4.2. Противовоспалительная активность напроксена на модели каррагенинового отёка лап крыс при длительном наблюдении 54
Глава 5. In vitro тест-системы для скрининга флоготропной активности новых потенциальных противовоспалительных молекул 58
5.1. Оценка мембранотропной активности новых оригинальных производных напроксена .58
5.1.1. Влияние новых оригинальных производных напроксена на осмотический гемолиз .58
5.1.2. Влияние новых оригинальных производных напроксена на свободнорадикальный гемолиз 59
5.1.3. Влияние новых оригинальных производных напроксена на агрегацию тромбоцитов, индуцированную 1 мМ арахидоновой кислотой 60
5.2. Оценка мембранотропной активности новых оригинальных производных ментола .61
5.2.1. Влияние новых оригинальных производных ментола на осмотический гемолиз 61
5.2.2. Влияние новых оригинальных производных ментола на свободнорадикальный гемолиз .62
5.2.3. Влияние новых оригинальных производных ментола на агрегацию тромбоцитов, индуцированную 1 мМ арахидоновой кислотой 63
5.3. Оценка мембранотропной активности н-гексадецилтрифенилфосфония бромида (Р1) 64
5.3.1. Влияние н-гексадецилтрифенилфосфония бромида на осмотический гемолиз .64
5.3.2. Влияние н-гексадецилтрифенилфосфония бромида на свободнорадикальный гемолиз .65
5.3.3. Влияние н-гексадецилтрифенилфосфония бромида на агрегацию тромбоцитов, индуцированную 1 мМ арахидоновой кислотой 66
5.4. Критерии отбора новых производных ментола и напроксена по результатам тестирования на клеточных ситемах in vitro для дальнейшего скринингафлоготропной активности 67
Глава 6. In vivo изучение противовоспалительной активности новых потенциальных противовоспалительных молекул 70
6.1. In vivo изучение противовоспалительной активности нового оригинального производного напроксена L3 на модели каррагенинового отёка лап мышей 70
6.2. In vivo изучение противовоспалительной активности нового оригинального производного ментола R6 на модели каррагенинового отёка лап мышей .73
6.3. In vivo изучение противовоспалительной активности мазей н-гексадецилтрифенилфосфония бромида на модели каррагенинового отёка лап крыс .76
Глава 7. Изучение зависимости между показателями in vitro тестов и противовоспалительной активностью исследуемых соединений 79
Заключение .90
Выводы .94
Практические рекомендации 96
Список сокращений .97
Список литературы
- Механизм развития воспаления
- Четвертичная соль фосфония — н-гексадецилтрифенилфосфония бромид
- Экспериментальное сравнительное изучение развития во времени каррагенинового и формалинового отёков лап мышей при длительном наблюдении
- Влияние новых оригинальных производных ментола на агрегацию тромбоцитов, индуцированную 1 мМ арахидоновой кислотой
Механизм развития воспаления
Глюкокортикоиды (ГК) представляют собой класс стероидных гормонов, которые синтезируются корой надпочечников и связываются с глюкокортикоидным рецептором [197], который присутствует почти во всех клетках позвоночных животных. Они служат одними из самых эффективных противовоспалительных лекарств [72]. Противовоспалительное действие ГК обусловлено многими факторами, ведущий из которых — подавление активности фосфолипазы А2. При этом ГК увеличивают экспрессию генов, кодирующих синтез липокортинов (аннексинов), индуцируют продукцию этих белков (например, липомодулин ингибирует активность фосфолипазы А2). Угнетение данного фермента приводит к подавлению либерации арахидоновой кислоты и торможению образования ряда медиаторов воспаления — ПГ, лейкотриенов, тромбоксана, фактора активации тромбоцитов и др. Кроме того, ГК уменьшают экспрессию гена, кодирующего синтез ЦОГ-2, дополнительно блокируя образование провоспалительных ПГ.
Геномные механизмы ГК опосредованы в первую очередь глюкокортикоидным рецепторным путём активации или репрессии специфических генов-мишеней, которым, как правило, необходимо несколько часов, чтобы они вступили в силу [62]. ГК пассивно проникают через клеточную мембрану и связываются с глюкокортикоидным рецептором, который находится в цитоплазме клетки. В настоящее время открыт только один класс глюкокортикоидных рецепторов, встречающийся в клетках различных тканей. Показано, что наибольшее количество глюкокортикоидных рецепторов присутствует в эпителиальных клетках дыхательных путей и эндотелиальных клетках бронхиальных сосудов. Структурно глюкокортикоидный рецептор состоит из нескольких частей (доменов), каждая из которых выполняет свою функцию. Та часть молекулы глюкокортикоидного рецептора, которая связывается с гормоном, находится в С-концевом участке. В средней части глюкокортикоидного рецептора расположено два пальцевидных отростка, роль которых состоит в связывании с ядерной дезоксирибонуклеиновой кислотой (ДНК) клетки-мишени. Каждый из этих отростков сформирован молекулой цинка, связанной с четырьмя цистеиновыми остатками, получившими образное название «цинковые пальцы». Функция N-концевой части молекулы глюкокортикоидного рецептора сводится к связыванию с факторами транскрипции и активации генов после встраивания комплекса «рецептор-гормон» в ядерную ДНК. Активация генов приводит к реализации клеткой специфических глюкокортикоидных эффектов.
Терапевтические эффекты ГК часто сопровождаются тяжёлыми и иногда необратимыми побочными эффектами. Цель разработки нового ГК — поддержание противовоспалительных и иммуносупрессивных свойств классических ГК и уменьшение профиля побочных эффектов. В настоящее время необходимо глубже понять молекулярные механизмы действия ГК для поиска новых ГК, у которых менее выражены побочные эффекты. ГК могут ингибировать иммунную и воспалительную деятельность нейтрофилов и макрофагов с помощью негеномного механизма. Эти клетки играют важную роль в воспалительной реакции [73, 88, 288]. Нейтрофилы человека содержат три основных типа лизосомальных гранул: азурофильные специфические гранулы, желатиназные гранулы и секреторные пузырьки. Под действием протеолитических и пищеварительных ферментов разрушается внеклеточный матрикс чужеродных агентов, например бактерий, и бактериальные «осколки» хранятся внутри этих гранул, которые, таким образом, участвуют в иммунных и воспалительных процессах, а также в развитии различных заболеваний и повреждения тканей [71]. Показано, что 6а-метилпреднизолон и гидрокортизон проявляют значительное ингибирующее действие на дегрануляцию нейтрофилов в течение 5 мин после введения N-формил-метионил 18 лейцил-фенилаланина. Ни конкурентоспособный антагонист глюкокортикоидных рецепторов RU486 (мифепристон, который значительно подавляет связывание ГК с их рецепторами), ни ингибитор трансляции актидион не изменяют ингибирующие эффекты ГК. Кроме того, высокие дозы ГК оказывают быстрое тормозящее действие на дегрануляцию нейтрофилов человека на клеточном уровне за счёт негеномного механизма, который не зависит от оккупации (занятия) глюкокортикоидных рецепторов или синтеза белка [159].
Макрофаги — многофункциональные клетки, которые играют важную роль в воспалении и иммунном ответе. Их самая важная функция — фагоцитоз, который сопровождается генерацией активных форм кислорода, таких как супероксид-анион. Чужеродные микроорганизмы активируют протеинкиназу С и увеличивают уровень внутриклеточного катиона Са2+, что приводит к активации НАДФН-оксидазы и последующему образованию активных форм кислорода. Было показано, что ГК ингибируют фагоцитоз макрофагами при длительном профилактическом их введении (от нескольких часов до суток) [106, 118]. Кроме того, ГК также могут быстро подавлять фагоцитоз и образование супероксидного аниона в перитонеальных макрофагах мышей путём негеномного механизма [161].
Четвертичная соль фосфония — н-гексадецилтрифенилфосфония бромид
Исследованные соединения (образцы R1, R2, R3, R4, R5, R6, L1, L2, L3) — производные пятичленных кислородсодержащих гетероциклов ряда 2(5Н) фуранона. Гетероциклический фрагмент 2(5Н)-фуранона обнаружен во многих природных и синтетических биологически активных веществах. Среди соединений, содержащих ненасыщенный -лактонный цикл, обнаружены вещества, обладающие противовоспалительной, антибактериальной, противогрибковой, противоопухолевой и другими видами биологической активности. Производные 2(5Н)-фуранона вызывают в последние годы большой интерес исследователей благодаря их доступности, наличию ряда различных реакционных центров, высокой и множественной реакционной способности. Это позволяет широко использовать их в качестве исходных и промежуточных соединений в синтезе различных функциональных производных 2(5Н)-фуранона и новых классов гетероциклических соединений, обладающих биологической значимостью и другими практически полезными свойствами.
Автор считает своим приятным долгом выразить благодарность коллегам, любезно предоставившим новые соединения для исследований: А.Р. Курбангалиевой, к.х.н., доценту кафедры органической химии Химического института им. А.М. Бутлерова; И.В. Галкиной, д.х.н., профессору кафедры высокомолекулярных и элементорганических соединений Химического института им. А.М. Бутлерова К(П)ФУ. Благодарность В.Ф. Менимуллиной, сотруднику республиканского центра крови за предоставление эритроцитов и тромбоцитов. Благодарность аспиранту кафедры фундаментальной и клинической фармакологии А.И. Габрахманову за вклад в статистическую обработку результатов исследований. Молекулы исследуемых соединений R1, R2, R3, R4, R5, R6 содержат гетероциклический фрагмент 2(5Н)-фуранона и фрагмент l-ментола в 5-м положении лактонного цикла: l-Ментол (природного происхождения) был использован в синтезе исследуемых соединений в качестве доступного хирального разделяющего реагента. Хорошо известно, что сам ментол обладает анестезирующими свойствами, а многие гетероциклы, содержащие ментильный заместитель, проявляют бактерицидные свойства.
Следует отметить, что вещества R1, R2, R3, R4, R5, R6 — оптически активные соединения, они были выделены в конфигурационно чистом виде. Нам на испытания были переданы индивидуальные стереоизомеры 5-ментилокси-2(5Н)-фуранонов (образцы R1, R2, R3, R4, R5, R6), их строение отличается природой атома галогена в 3-м положении лактонного цикла (атом хлора или брома) и природой заместителя в 4-м положении (атом галогена, сульфанильный или сульфонильный фрагмент).
Молекулы соединений L1, L2, L3 содержат остаток 2(5Н)-фуранона и фрагмент S-напроксена в 5-м положении лактонного цикла:
Соединение было специально синтезировано и предоставлено нам в лаборатории д.х.н., профессора кафедры высокомолекулярных и элементоорганических соединений Химического института им. А.М. Бутлерова К(П)ФУ И.В. Галкиной. Ниже приведена структурная формула этого вещества: Н-гексадецилтрифенилфосфония бромид [(С6Н5)3Р+С16Н33]Br– относится к III классу токсичности (умеренно опасные вещества) и обладает высокой бактерицидной и антимикотической активностью в отношении S. aureus, P. aeruginosa, E. сoli, Proteus mirabilis и Candida albicans [3], что обусловливает перспективность применения данного биологически активного соединения как антисептического средства для местного применения. Установлена эффективность 0,05% мази н-гексадецилтрифенилфосфония бромида на основе вазелина для лечения мастита (воспалительного заболевания молочной железы) у коров, обеспечивающая выздоровление в течение 5 дней применения, что сопоставимо с интрацистернальным (внутривыменным) введением антисептических средств [9]. В исследовании мы использовали растворы и мазевые композиции с н-гексадецилтрифенилфосфония бромидом, разработанные и предоставленные нам научной группой профессора И.В. Галкиной и профессора С.Н. Егоровой. Эти мази изготавливали на основе вазелина в концентрациях 0,05% и 0,25% — перемешиванием биологически активного соединения (без предварительного измельчения) с основой при температуре 40 С. Н-гексадецилтрифенилфосфония бромид растворяется в основе, образуя однородную мазь-раствор.
Экспериментальное сравнительное изучение развития во времени каррагенинового и формалинового отёков лап мышей при длительном наблюдении
Исследование противовоспалительной активности НПВС на модели формалинового отёка лап мышей при длительном наблюдении показало, что напроксен максимально проявил противовоспалительную активность через 4 ч после индукции отёка формалином, подавляя отёк лап мышей на 34% (p=0,03). Противовоспалительный эффект напроксена также был зарегистрирован на сроках 24 и 96 ч с угнетением отёка лап мышей на 26 и 31% (p=0,04 и 0,01) соответственно (рисунок 5). Диклофенак проявлял противовоспалительное действие через 4 ч после введения формалина, подавляя отёк на 45% (р=0,01) и на 54% (p=0,0002) через 96 ч (таблица 13).
Введение индометацина в дозе 10 мг/кг способствовало подавлению формалинового отёка лап мышей на 4-е и 5-е сутки эксперимента на 18 и 31% (р=0,05 и 0,01) соответственно без влияния на более ранних сроках наблюдения. Таким образом, и индометацин, и диклофенак проявляли максимальный эффект на 5-е сутки, и диклофенак в нашем эксперименте был эффективнее индометацина (р=0,04; таблица 13).
Мы также применили подход с определением AUC для оценки совокупной (во времени) противовоспалительной оценки известных НПВС. Сравнение расчетных величин AUC показало, что 5-дневное введение НПВС мышам с формалиновым отёком снижало интенсивность отёка в отдельные конкретные временные точки (симптомы воспалительного процесса). Полного устранения отёка не наблюдалось, так как при сравнении площади под кривой «Прирост объёма лап — время» мы не обнаружили различий в показателях контрольной группы и групп животных, которым вводили напроксен в дозе 15 мг/кг, диклофенак в дозе 10 мг/кг и индометацин в дозе 10 мг/кг, величина AUC которых составила 3618±1153, 3547±1168 и 3874±885%/ч соответственно (рисунок 6, таблица 14).
Площади под кривой «Прирост объёма лап — время» при моделировании отёка у мышей субплантарным введением формалина на фоне внутрижелудочного лечебно-профилактического применения напроксена в дозе 15 мг/кг (n=15), диклофенака в дозе 10 мг/кг (n=10) и индометацина в дозе 10 мг/кг (n=10; М±). Отсутствие достоверных различий величин AUC в контроле и при введении НПВС не противоречит представлениям об общебиологической сущности воспаления — защитно-приспособительной реакции организма на повреждение. В своём развитии оно сопровождается совокупностью развивающихся одновременно и тесно взаимосвязанных между собой процессов альтерации, экссудации, фагоцитоза, пролиферации и др. Воспалительный процесс завершается фазой пролиферации, обеспечивающей регенерацию тканей на месте очага альтерации [135]. Следует отметить, что ещё в 2000 г. Виллоуфбай (Willoughby) и соавт. [278] высказали мысль о том, что опираться на единичный временной промежуток измерения интенсивности отёка лапы для предсказания противовоспалительной активности новых флоготропных агентов не следует, так как этот результат может ввести в заблуждение. Очевидно, что следует оценивать развёртку воспалительной реакции во времени.
Результат нашего сравнения суммарной величины воспалительного повреждения на формалиновой модели воспаления лап мышей при наблюдении в течение 5 дней, показал, что изученные НПВС только меняют скорость развития воспалительной реакции, не влияя на показатель суммарного воспалительного повреждения.
Показанное отсутствие влияния НПВС на суммарную величину воспалительного повреждения (AUC) соответствует литературным данным о том, что НПВС не влияют на исходы при хронических воспалительных заболеваниях [278], воздействуя только на симптомы, не затрагивая патогенез основного заболевания.
Воспалительная реакция, вызванная субплантарным введением 1% геля каррагенина, развивалась в виде отёка с увеличением объёма лап крыс на 16–55% исходного объёма. Максимальное развитие отёка наблюдали у животных контрольной группы через 3 ч после введения каррагенина, что соответствует литературным данным [42, 61]. Напроксен в дозе 15 мг/кг (однократное введение) проявлял противовоспалительную активность на сроках 1, 2, 3, 4 и 5 ч после введения каррагенина с подавлением отёка на 59, 81, 73, 60 и 39% (р=0,03; 0,001; 0,001; 0,001 и 0,01) соответственно; в остальные сроки (после 5 ч) противовоспалительное (противоотёчное) действие напроксена отсутствовало (рисунок 7, таблица 15).
Влияние новых оригинальных производных ментола на агрегацию тромбоцитов, индуцированную 1 мМ арахидоновой кислотой
В этой серии эксперимента исследуемые соединения вводили мышам внутрижелудочно однократно за 1 ч до индукции отёка лап животных субплантарной инъекцией 1% водного геля каррагенина.
Полученные нами результаты показали, что напроксен в дозе 10 мг/кг проявлял противовоспалительное действие через 2 ч после введения каррагенина с угнетением отёка лап мышей на 40% (р=0,05). Напроксен в дозе 15 мг/кг угнетает развитие отёка лап мышей на 66 и 61% на сроках 2 и 3 ч после индукции отёка субплантарным введением каррагенина (р=0,001 и 0,02) соответственно (рисунок 18). Противовоспалительная активность напроксена в дозе 20 мг/кг отмечена также на сроках 2 и 3 ч после инъекции каррагенина с подавлением отёка лап мышей на 50 и 67% (р=0,01) соответственно (рисунок 18).
Рисунок 18. Процент прироста объёма лап мышей на сроках 2 и 3 ч после моделирования острого каррагенинового отёка на фоне внутрижелудочного профилактического введения напрокена в разных дозах; р 0,01, р 0,05 по сравнению с контролем; n=6 (M±m) На остальных исследуемых сроках зарегистрировано отсутствие проявления противовоспалительного эффекта напроксена в дозах 10, 15 и 20 мг/кг на модели каррагенинового отёка лап мышей (рисунок 19).
Процент прироста объёма лап мышей после субплантарного введения каррагенина на фоне внутрижелудочного профилактического введения напроксена в разных дозах во времени; n=6 (М)
Производное напроксена L3 в нашем исследовании показывало противовоспалительный эффект в дозах 18 и 36 мг/кг. В дозе 18 мг/кг оно угнетало проявления воспалительного процесса, подавляя отёк лап мышей на 55 и 50% на сроках 2 и 3 ч после введения каррагенина (р=0,003 и 0,05) соответственно.
Противовоспалительное действие производного напроксена L3 в дозе 36 мг/кг отмечено только через 2 ч после субплантарной инъекции каррагенина с угнетением отёка на 65% (р=0,003; рисунок 20). На остальных сроках этот эффект отсутствует (рисунок 21). Производное напроксена L3 в дозе 27 мг/кг на сроках 24, 48 и 72 ч проявляло провоспалительный эффект на модели каррагенинового отёка лап мышей (таблица 20). Рисунок 20. Процент прироста объёма лап мышей на сроках 2 и 3 ч после моделирования острого каррагенинового отёка на фоне внутрижелудочного профилактического введения нового производного напрокена в разных дозах; р 0,01; р 0,05 по сравнению с контролем; n=6 (М±m) Рисунок 21. Процент прироста объёма лап мышей после субплантарного введения каррагенина, на фоне внутрижелудочного профилактического введения производного напроксена L3 в разных дозах во времени; р 0,01; р 0,05 по сравнению с контролем; n=6 (М) При вычислении площади под кривой «Прирост объёма лап — время» мы не обнаружили различий в показателях контрольной группы и групп животных, которым вводили напроксен и его производное L3 в разных дозах, что позволяет нам делать заключение об отсутствии влияния этих соединений на исход воспалительного процесса (рисунок 22).
In vivo изучение противовоспалительной активности нового оригинального производного ментола R6 на модели каррагенинового отёка лап мышей В этой серии эксперимента исследуемые соединения вводили мышам внутрижелудочно однократно за 1 ч до индукции отёка лап животных субплантарной инъекцией 1% водного геля каррагенина.
При моделировании каррагенинового отёка лап мышей выявлена противовоспалительная активность исследуемых соединений в разных дозах. Ментол в дозе 25 мг/кг проявлял противовоспалительное действие через 5 ч после введения каррагенина с угнетением отёка лап мышей на 51% (р=0,05). Ментол в дозе 50 мг/кг угнетал развитие отёка лап мышей на 58% на сроке 4 ч после индукции отёка субплантарным введением каррагенина (р=0,05). Противовоспалительная активность ментола в дозе 100 мг/кг проявлялась в первые часы эксперимента, а также на 5-й день наблюдения. Через 2 ч после индукции отёка ментол в дозе 100 мг/кг подавлял отёк лап мышей на 50% (р=0,05), на сроке 5 и 24 ч — на 59 и 74% (р=0,03 и 0,02) соответственно (рисунок 23). На сроке 96 ч, то есть на 5-й день эксперимента, противовоспалительный эффект ментола в дозе 100мг/кг проявлялся в виде угнетения отёка лап мышей на 79% (р=0,02; рисунок 24, таблица 21).
Производное ментола R6 в нашем исследовании оказало противовоспалительный эффект во всех исследуемых дозах на разных сроках исследования. Противовоспалительная активность R6 в дозе 68,3 мг/кг проявлялась в виде подавления отёка лап мышей на сроках 2 и 5 ч после инъекции каррагенина на 60 и 53% (р=0,05; рисунок 25). В дозе 136,6 мг/кг оно угнетало проявление воспалительного процесса, подавляя отёк лап мышей на 66, 54, 58, 58 и 92% на сроках 4, 5, 24, 72 и 96 ч после введения каррагенина (р=0,03; 0,05; 0,05; 0,05 и 0,02) соответственно (рисунок 26). Противовоспалительное действие производного ментола R6 в дозе 275,3 мг/кг зарегистрировано почти на всех исследуемых сроках: через 2, 3, 5, 24, 48, 72 и 96 ч после субплантарной инъекции каррагенина с угнетением отёка на 66, 69, 57, 75, 75, 79 и 91% (р=0,04; 0,05; 0,04; 0,02; 0,02; 0,01 и 0,02) соответственно (рисунок 26).
Процент прироста объёма лап мышей после моделирования острого каррагенинового отёка на фоне внутрижелудочного профилактического введения ментола в разных дозах во времени; р 0,05 по сравнению с контролем n=6 (М) При вычислении площади под кривой «Прирост объёма лап — время» отмечена достоверная разница прироста объёма лап в группах с применением препаратов в самых высоких исследуемых дозах (ментол в дозе 100 мг/кг и его производное R6 в дозе 273,3 мг/кг), что является результатом выраженной противовоспалительной активности этих соединений в указанных дозах. В других группах мы не обнаружили различий в показателях по сравнению с контрольной группой (рисунок 27, таблица 23).