Роль нейростероидной системы в реализации действия диазепама, афобазола и мексидола Шимширт Александр Александрович

Содержание к диссертации

Введение

Глава 1. Обзор литературы 13

1.1 Роль нейростероидной системы в ЦНС 19

1.2 Биосинтез и метаболизм нейростероидов

1.3 Взаимодействие нейростероидной системы с ГАМКА–рецепторной системой

1.4 Взаимодействие нейростероидной системы с НМДА–рецепторной системой

1.5 Взаимодействие нейростероидной системы с серотониновой рецепторной ситемой

1.6 Взаимодействие нейростероидной системы с 1-рецепторной системой

1.7 Взаимодействие нейростероидной системы с гипоталамо- гипофизарно-адреналовой системой

1.8 Участие нейростероидной системы в развитии тревожных расстройств

1.9 Терапевтический потенциал нейростероидов. Нейростероидогенез как мишень для создания новых анксиолитиков

1.10 Экспериментальные модели оценки анксиолитического эффекта

Глава 2. Материалы и методы 49

2.1 Экспериментальные животные 49

2.2 Изученные вещества 49

2.3 Дизайн исследования 50

2.4 Методика «открытое поле» 53

2.5 Методика «приподнятый крестообразный лабиринт» 54

2.6 Оперантная методика лекарственной дифференцировки 55

2.7 Моделирование состояния острого стресса при помощи 57

«вынужденного плавания»

2.8 Определение концентрации нейромедиаторных моноаминов в 58

структурах головного мозга крыс Wistar

2.9 Статистическая обработка полученных результатов 59

Результаты исследований 60

Глава 3. Изучение эффектов анксиолитиков на тревогу, вызванную введением малых доз коразола у грызунов

3.1 Анализ поведенческих реакций, вызванных введением коразола, у грызунов в тесте «открытое поле»

3.2 Анализ поведенческих реакций, возникающих при совместном введении коразола и анксиолитиков у грызунов в тестах «открытое поле» и «приподнятый крестообразный лабиринт»

3.3 Эффекты анксиолитиков на интероцептивные эффекты 69

коразола у крыс Wistar

Глава 4. Изучение влияния блокады синтеза нейростероидов на 73 поведенческие реакции грызунов

4.1 Влияние блокады МТБ18 и нарушения метаболизма прогестерона на ориентировочно-исследовательскую реакцию и уровень тревожности у грызунов

4.2 Изучение интероцептивные эффекты финастерида у крыс, обученных лекарственной дифференцировке «коразол-физиологический раствор»

Глава 5. Влияние различных этапов синтеза нейростероидов на эффекты анксиолитиков

5.1 Влияние функциональной активности циклооксигеназы на ориентировочно-исследовательскую реакцию у мышей BALB/c в тесте «открытое поле»

Глава 6. Особенности влияния ингибиторов метаболизма прогестерона и анксиолитиков на поведенческие реакции мышей BALB/c после вынужденного плавательного стресса в тесте «открытое поле»

Глава 7. Сравнительное изучение влияния ингибиторов ГАМКА-рецепторов и нейростероидогенеза на концентрациию нейромедиаторных моноаминов в структурах головного мозга крыс Wistar

Заключение 104

Выводы 113

Практические рекомендации 115

Список литературы

• Взаимодействие нейростероидной системы с серотониновой рецепторной ситемой
• Методика «приподнятый крестообразный лабиринт»
• Анализ поведенческих реакций, возникающих при совместном введении коразола и анксиолитиков у грызунов в тестах «открытое поле» и «приподнятый крестообразный лабиринт»
• Влияние функциональной активности циклооксигеназы на ориентировочно-исследовательскую реакцию у мышей BALB/c в тесте «открытое поле»

Введение к работе

Актуальность исследования. Согласно эпидемиологическим данным не менее 500 млн человек в мире страдает той или иной формой психического заболевания, несущего за собой негативные последствия не только медицинского, но и социального характера. Течение аффективных расстройств, в частности тревожных, сопряжено с риском утраты трудоспособности, коморбидностью с другими патологиям и существенными бюджетными затратами на их лечение (KesslerR. C. The global burden of anxiety and mood disorders // J.Clin.Psychiatry. 2007. № 68, suppl. 2. P. 10–19).Несмотря на то, что стандартные схемы инициирующей терапии анксиолитиками бензодиазепинового ряда (БД) с последующим поддерживающим лечением антидепрессантами зарекомендовали себя как эффективные, существует ряд факторов, ограничивающих их применение. При приеме БД может наблюдаться развитие толерантности, ослабление когнитивных показателей, синдром отмены при прекращении длительных курсов. Для ингибиторов обратного захвата серотонина характерен длительный период применения до достижения клинического эффекта. В связи с этим, актуальность создания эффективных противотревожных препаратов, лишенных выше обозначенных побочных эффектов, и изучение механизмов противотревожного действия фармакологических веществ не теряет своей остроты (Nutt D.J. Generalized anxiety disorder: comorbidity, comparative biology and treatment// Int. J. Neuropsychopharmacol.- 2002.- № 5.- P. 315-325).

В ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова» разработаны и внедряются в лечебную практику оригинальные лекарственные препараты, противотревожное действие которых реализуется при взаимодействии с мишенями, отличными от классических БД. Афобазол, селективный анксиолитик с нейропротективным действием, является лигандом сигма-1(1)-рецепторов (Середенин С. Б. Фармакология нового анксиолитика афобазола // Экспериментальная и клиническая фармакология.- 2009.- № 1.- C. 3-11). В лечебной практике в качестве анксиолитического, ноотропного и нейропротективного средства широко применяется антиоксидант мексидол, психотропные свойства которого объясняются способностью оказывать мембраностабилизирующее действие (Воронина Т. А. Мексидол: основные нейропсихотропные эффекты и механизм действия // Фарматека.- 2009.- № 6.- C. 28-31). Афобазол и мексидол, не имея прямого аффинитета ни к одному из сайтов ГАМК_А-рецептора, тем не менее препятствуют обусловленному стрессом снижению связывания БД. Точные механизмы подобного влияния препаратов на ГАМК_А-рецептор не установлены.

В настоящее время сформировалось понимание фундаментальной роли системы эндогенных нейростероидов (НС) в патогенезе аффективных расстройств, нарушениях адаптивных реакций организма в условиях стресса. Так, у пациентов с депрессивно-тревожными заболеваниями наблюдаются изменения концентраций НС в спинномозговой жидкости (Finn D.A. A new look at the 5alpha-reductase inhibitor finasteride // CNS drug Rev.- 2006.- № 12.- P. 53-76).

Синтез НС в ЦНС, преимущественно в лимбических структурах (гиппокампе, миндалевидном комплексе) и гипоталамусе, инициирует активация митохондриального транслокационного белка 18кДа (МТБ18). МТБ18 связывается с холестеролом (холестерин-эфиром) и транспортирует его в митохондрии, где под действием фермента P450_SCC из холестерола образуется нейростероидный предшественник прегненолон, который после выхода из митохондрии в цитоплазму глиальной или нейрональной клетки проходит каскад превращений с образованием ряда НС, в том числе позитивных и негативных лигандов ГАМК_А-рецепторов. Одними из основных ферментов нейростероидогенеза являются 5-редуктаза и 3-гидроксистероидная оксидоредуктаза, участвующие в образовании агониста ГАМК_А-рецептора аллопрегнанолона. В эксперименте блокада основных этапов синтеза НС может быть достигнута при введении селективного лиганда МТБ18 PK11195, индометацина, селективно ингибирующего активность 3-гидроксистероидной оксидоредуктазы, или финастерида, ингибирующего активность 5-редуктазы (Mac Kenzie G. Neurosteroids and GABAergig signaling in health and disease // Biol. Mol. Conc.- 2013.- № 4. - P. 29-42).

Степень разработанности проблемы. В течение последних 10 лет функциональная
активность МТБ18 представляет интерес в качестве мишени при разработке новых лекарственных
средств терапии тревожно-депрессивных расстройств. За рубежом были синтезированы и

изучены лиганды МТБ18 FGIN-1-27, XBD173 (эмапунил), для которых установлена связь их
анксиолитической активности с облегчающим эффектом в отношении биосинтеза

аллопрегнанолона. В настоящее время в качестве анксиолитика применяется лиганд МТБ18 и ГАМК_А-рецептора этифоксин, а эмапунил находится на этапе клинических исследований (Rupprecht R. Translocator protein (18 kD) as target for anxiolytics without benzodiazepine-like side effects // Science.- 2009.- № 325.- P. 490–493).

Несмотря на то, что появляется все больше экспериментальных и клинических данных, подтверждающих значение нейростероидогенеза в формировании психоэмоциональных реакций, исследования роли отдельных принципиальных этапов синтеза НС в механизме действия анксиолитиков, в том числе и известных препаратов, малочисленны.

Целью настоящей работы является изучение роли функциональной активности МТБ18 и основных ферментов метаболизма прогестерона в реализации эффектов препаратов с разным механизмом анксиолитического действия.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

1. Изучение влияния диазепама, афобазола и мексидола на тревогу, вызванную введением малых доз коразола.

2. Изучение особенностей тревожных реакций, вызванных селективной блокадой МТБ18, у мышей с различным фенотипом эмоциональной реакции на стресс.

3. Изучение особенностей тревожных реакций, индуцированных нарушением метаболизма прогестерона при ингибировании 5-редуктазы финастеридом и 3-гидроксистероидной оксидоредуктазы индометацином, у крыс и мышей.

4. Изучение механизмов реализации тревоги, вызванной нарушением нейростероидогенеза селективной блокадой 5-редуктазы, по сравнению с тревогой, вызванной ингибированием ГАМК_А-рецепторов на модели лекарственной дифференцировки.

5. Сравнительное изучение влияния функциональной блокады ГАМК_А-рецепторов и нарушения метаболизма прогестерона на уровень нейромедиаторных моноаминов в структурах головного мозга крыс Wistar.

6. Изучение влияния блокады МТБ18 и метаболизма прогестерона на эффекты диазепама, афобазола и мексидола.

7. Изучение влияние нарушения нейростероидогенеза при остром плавательном стрессе на поведение мышей, эффекты диазепама и афобазола.

Научная новизна. Впервые показано, что селективная блокада МТБ18 и нарушение основных этапов метаболизма прогестерона, подобно ослаблению функциональной активности ГАМК_А-рецептора, приводит к снижению ориентировочно-исследовательской реакции (ОИР) у грызунов разных видов (крысы, мыши) и мышей с альтернативными фенотипами эмоциональной реакции на стресс. Выявлены межлинейные различия во влиянии нарушения синтеза НС на поведение у мышей: сопоставимое по степени выраженности усиление тревожных реакций регистрируются у мышей BALB/с при фармакологической блокаде МТБ18, а у мышей С57Bl/6 – при ингибировании 5-редуктазы. На модели лекарственной дифференцировки (ЛкД) установлено, что финастерид частично воспроизводит интероцептивные эффекты коразола, что свидетельствует о наличии общих звеньев в механизме тревожных реакций, вызванных снижением активности 5-редуктазы и тревоги, обусловленной неконкурентным антагонистом ГАМК_А-рецепторов. Впервые показано, что нарушения метаболизма прогестерона вызывают изменение в содержании моноаминов и их метаболитов в стриатуме, гиппокампе, коре больших полушарий, но не прилежащем ядре или гипоталамусе у крыс Wistar. Наибольшее влияние оказывает снижение функциональной активности 5-редуктазы, изменяющей содержание дофамина и норадреналина, метаболизм дофамина и серотонина. Блокада 3-гидроксистероидной оксидоредуктазы изменяет метаболизм дофамина и серотонина, а функциональное снижение активности ГАМК_А-рецепторов - только дофамина. Впервые установлено, что у мышей BALB/с на эффекты афобазола оказывает влияние функциональная активность МТБ18 и 5-редуктазы, на анксиолитические свойства диазепама - 5-редуктазы.

Методология и методы исследования. В работе применялись физиологические, фармакологические, нейрохимические и генетические методы исследования врожденных и приобретенных форм поведения млекопитающих (крысы и мыши). При моделировании отклонений от нормального процесса нейростероидогенеза применяли фармакологические агенты, оказывающие избирательное ингибирующее действие в отношении его определенных этапов. Анализ нарушений нейростероидогенеза был выполнен на уровне организма животного при оценке поведенческих реакций и биохимическом уровне при оценке содержания моноаминов и их метаболизма в структурах головного мозга. Сравнительное изучение механизмов тревожных реакций, обусловленных снижением функциональной активности ГАМК_А-рецепторной системы и фармакологической блокадой ферментов метаболизма прогестерона, выполнено на уровне организма в условиях метода ЛкД и при использовании нейрохимических методов. Экспериментальные результаты обработаны при использовании современных методов статистического анализа.

Научно-практическая значимость. Данные о способности селективного блокатора 5-редуктазы финастерида и блокатора 3-гидроксистероидной оксидоредуктазы индометацина при системном введении вызывать нарушения поведения у грызунов, а также изменять уровни нейромедиаторных моноаминов и их метаболизма в структурах головного мозга животных указывают, на то, что при назначении финастерида и индометацина по прямым показаниям в клинической практике следует учитывать гормональный фон пациентов, особенно при наличии тревожных реакций, депрессий и посттравматических состояний. Результаты исследования существенно расширяют представление о роли НС в реализации свойств анксиолитиков, в том числе и тех, для которых не показаны прямые лиганд-рецепторные взаимодействия с МТБ18 (афобазол). Данные о роли активности ферментов метаболизма прогестерона (5-редуктазы ЦНС) для анксиолитического эффекта диазепама указывают на то, что активность 5-редуктазы в ЦНС может являться звеном в патогенетическом механизме резистентности к терапии БД и мишенью для потенциальных анксиолитиков для решения проблемы лекарственной резистентности к БД. Полученные результаты указывают на необходимость дальнейшего изучения эффективности афобазола и мексидола как средств коррекции эмоциональных расстройств, индуцированных приемом индометацина. Результаты исследования позволяют рекомендовать проведение клинического изучения взаимодействия афобазола с препаратами, ингибирующими активность 5-редуктазы (финастерид и др.).

Связь с планами НИР. Диссертация выполнена в рамках плана НИР ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова» «Изучение механизмов эндо- и экзогенной регуляции функций ЦНС. Разработка новых оригинальных нейропсихотропных средств» (№ гос.регистрации 01201169192 ) и гранта РФФИ № 13-01596.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Селективная блокада МТБ18 и нарушение основных этапов метаболизма прогестерона подобно снижению функциональной активности ГАМК_А-рецептора приводит к ослаблению ориентировочно-исследовательского поведения и усилению тревожных реакций у грызунов.

2. Нейрохимические изменения, вызываемые функциональным снижением активности ГАМК_А-рецепторов и нарушением метаболизма прогестерона, различаются, прежде всего, по степени вовлеченности системы нейромедиаторных моноаминов. Наиболее глубокие изменения в метаболизме нейромедиаторных моноаминов оказывает ингибирование 5-редуктазы, одного из основных ферментов, определяющих содержание прогестерона в ЦНС.

3. Состояние системы нейростероидогенеза оказывает существенное влияние на реализацию эффектов как классических (диазепам), так и атипичных (афобазола, мексидола) анксиолитиков.

4. У мышей BALB/с анксиолитический эффект афобазола и диазепама зависит от функциональной активности 5-редуктазы, функциональное состояние МТБ18 также оказывает влияние на анксиолитическое действие афобазола.

5. Реализация анксиолитических эффектов афобазола и диазепама в меньшей степени сопряжена с функциональной активностью 3-гидроксистероидной оксидоредуктазы по сравнению с активностью 5-редуктазы.

Личный вклад автора. Автор является исполнителем всех этапов проведенного исследования: поиска и анализа научной литературы, проведения экспериментальной работы, обработки результатов, их статистического анализа, формулирования положений и выводов,подготовки публикации по материалам диссертации.

Апробация. Результаты работы представлены на 5-ой Международной конференции «Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам», Москва, 2010; the 11^th ECNP Regional Meeting of European College of Neuropsychopharmacology, Санкт-Петербург, 2011; the 6^th European Congress of Pharmacology, Granada, 2012; IV съезде фармакологов России «Инновации в современной фармакологии», Казань, 2012; the 15^th Biennial Meeting of European Behavioral Pharmacology Society, LaRochelle, 2013; 6-ой Международной конференции «Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам», Москва, 2015; the 16^th Biennial Meeting of European Behavioral Pharmacology Society, Verona, 2015.

Публикации. Результаты работы опубликованы в 3 статьях в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ, и в 9 тезисах в материалах российских и международных научных конференций.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 139 страницах, содержит разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты исследований и их обсуждение, выводы, список литературы, включающий 24 отечественных и 247 зарубежных источника. Работа иллюстрирована 17 таблицами и 12 рисунками.

Взаимодействие нейростероидной системы с серотониновой рецепторной ситемой

Мировая статистика свидетельствует, что усложнение структуры общества и ряд социально-экономических факторов спровоцировали в последнее время рост тревожных расстройств и других психических заболеваний (аффективные расстройства) у населения. По расчетным данным не менее 500 млн. человек в мире страдают различными психическим расстройствами (Alonso and Lpine, 2007; Kessler 2007). Во многих странах 30-40% людей с ограниченными возможностями утратили трудоспособность вследствие психических расстройств (Girolamo and Reich, 1995). Эпидемиологические прогнозы свидетельствуют, что в будущем масштабы этой проблемы, весьма вероятно, возрастут в связи с влиянием разного рода факторов, в том числе и таких, как рост продолжительности жизни лиц с психическими расстройствами и инвалидность, а также увеличение контингента пожилых людей, среди которых особенно высок риск нарушений психики.

Тревожные расстройства составляют одну из наибольших категорий аффективных расстройств. Основными симптомами этих расстройств являются: беспокойство, страх, утомляемость, расстройство концентрации, раздражительность, мышечное напряжение и расстройство сна. В России 6–7 % населения страдает депрессивными и тревожными расстройствами (Ротштейн и соавт., 2005). Согласно мировой статистике в течение жизни какое-либо тревожное расстройство возникает у 10,4-28,8% населения, а показатель заболеваемости за год составляет в среднем около 18% среди лиц старше 18 лет (Martin, 2007).

Депрессивные и тревожные расстройства влекут за собой неблагоприятные последствия медицинского, личностного и социального характера. Согласно многочисленным эпидемиологическим исследованиям, проведённым в странах Западной Европы (Alonso et al., 2004) и Соединённых Штатах Америки (США) (Kessler and Merikangas, 2004), тревожные расстройства являются группой психических расстройств с наиболее длительной продолжительностью течения заболевания и наиболее ранним дебютом (11 лет) (Kessler et al., 2005). У молодых пациентов коморбидность тревожного расстройства является важным прогностическим показателем, который предопределяет более тяжелое течение депрессии, хронизацию заболевания, увеличение суицидального риска, более длительный курс лечения и снижение эффективности лечения, такие же взаимосвязи наблюдаются и при заболеваниях в среднем и пожилом возрасте (Clayton, 1991; Corywell et al., 1992; Eatin and Ritter 1998). Помимо ассоциированного течения с депрессией, тревожные расстройства сопровождаются другими заболеваниями: астмой, опухолевыми процессами, гипертонической болезнью, мигренью, болезнями желудочно-кишечного тракта (Roy-Byrne et al., 2008).

Ряд наблюдений показывает, что величина бюджетных затрат по лечению аффективных расстройств в ряде государств составляет значительную величину государственных ассигнований. Согласно Greenberg и соавт. (1999) за период с 1990 по 2000 гг. бюджетные затраты и экономические потери, связанные с проявлениями острых тревожных расстройств, в США составили более 42 млрд. долларов. Аналогичные по величине результаты были получены в ходе статистических исследований в странах Западной Европы (Andlin-Sobocki et al., 2005). Данные показатели свидетельствуют о необходимости выработки наиболее оптимальных подходов к лечению аффективных расстройств и предотвращению развития их неблагоприятных социальных и экономических последствий. Одним из таких подходов является поиск лекарственных препаратов, позволяющих обеспечить эффективную, безопасную психофармакотерапию, не ухудшающую качество жизни больных.

Проблема эффективной и безопасной фармакотерапии тревожных расстройств является одной из ведущих в неврологии и психиатрии. Сложность патогенеза и разнообразие клинических проявлений предполагает серьёзный подход к выбору лекарственного средства с целью лечения вышеупомянутых состояний. Учитывая определяющую роль -аминомасляная кислота (ГАМК)-ергических механизмов в формировании синдрома тревоги, базовая лекарственная терапия тревожных расстройств, особенно на начальном этапе, основывается на применении лекарственных средств, воздействующих на ГАМК-нейромедиаторную систему. Основная терапия острой фазы тревожных расстройств основывается на применении «классических» анксиолитиков бензодиазепиновой природы (БД). Назначение БД длительное время считалось и продолжает являться одним из лучших методов кратковременной фармакологической коррекции аффективных расстройств (Costa and Guadotti, 1996; Bandelow et al., 2008; Baldwin et al., 2005; Rudolph et al., 2006).

БД, связываясь со специфическим бензодиазепиновым сайтом ГАМК-рецепторного комплекса, стимулируют ГАМК-ергическую медиацию и процесс центрального торможения. Таким образом БД реализуют своё анксиолитическое и антифобическое действие, что позволило на этапе их внедрения в клиническую практику в 1960-х годах добиться значительных успехов в лечении тревожных расстройств различной этиологии. Также ряд БД, например, диазепам, используется в качестве эталонных препаратов сравнения в различных методиках при экспериментальном изучении и поиске новых анксиолитических препаратов (Незнамов и соавт., 2006; Воронина и Середенин, 2006).

Несмотря на выраженный терапевтический потенциал БД, использование препаратов бензодиазепиновой природы связано с риском развития нежелательных побочных эффектов, таких как развитие толерантности, «синдрома отмены», когнитивных нарушений (Nutt et al., 2002). Ввиду вероятности появления данных реакций, в настоящее время в терапии острых аффективных расстройств наметилась тенденция в назначении пациентам БД короткими курсами, не более 2-4 недель (Bandelow et al., 2008).

Методика «приподнятый крестообразный лабиринт»

В первую очередь, НС быстро метаболизируются, что ограничивает их биодоступность (Reddy, 2010). Кроме того НС могут конвертироваться в вещества, действующие на рецепторы стероидных гормонов, оказывая тем самым нежелательные эффекты (Rupprecht et al., 1993). Ввиду этих ограничительных факторов был создан ряд синтетических НС. Одним из примеров является ганаксолон, синтетический аналог аллопрегнанолона (Reddy and Woodwart, 2004; Kerrigan et al., 2000). Эффективность ганаксалона была показана на экспериментальных моделях инфантильных спазмов (Kerrigan et al., 2000), катаментальной эпилепсии (Reddy and Rogawski, 2000), коразол-индуцированных судорог (Garison et al., 2000) и киндлинга (Reddy and Rogawski, 2010). Клинические испытания ганаксалона показали эффективность препарата в отношении снижения частоты эпилептических приступов у детей и взрослых (Laxer et al., 2000). Параллельно с достаточно выраженным клиническим эффектом в ходе клинических испытаний ганаксолона был обнаружен ряд нежелательных побочных эффектов, таких как сонливость и эметический синдром (Nohria and Giller, 2007). Модулирующее влияние на функцию ГАМК рецепторов было выявлено также у другого синтетического НС – альфаксолона (Lambert et al., 1995). Противотревожные эффекты альфаксалона обнаруживаются в тесте ПКЛ, «конфликтной ситуации» у крыс (Britton et al., 1991).

Стероидный анестетик минаксалон в лабораторных исследованиях обнаруживал выраженное седативное влияние, вызывая снижение двигательной активности у мышей в тесте ПКЛ (Marshall et al., 1997). Однако клинические испытания минаксолона продолжены не были из-за обнаруженных токсических реакций (McNeill et al., 1981).

Нейростероидогенез и препараты, влияющие на их синтез, могут являться перспективной фармакологическим инструментом в терапии тревожных расстройств. В экспериментальных и клинических работах было установлено, что селективные лиганды МТБ18, обеспечивающего начальный этап нейростеройдогенеза, FGIN-1-27 (Auta et al. 1993), AC-5216 (Kita et al., 2009), XBD173 (Rupprecht et al., 2009) стимулируют биосинтез НС в головном мозге и предположительно оказывают анксиолитическое действие посредствам активации ГАМКА-рецпторов. В тестах на животных этифоксин (Varleye et al, 2005) и имидазопуридина ацетамид (Serra et al., 1999) показали анксиолитическую активность, например в питьевом конфликтном тесте Вогеля у крыс. Verleye и Gillardin (2004) в поведенческих тестах у грызунов описали анксиолитические эффекты этифоксина, небензодиазепинового транквилизатора и позитивного модулятора ГАМКА-рецепторного комплекса, который широко применяется в терапии тревожных расстройств и острой реакции на стресс (Servant et al, 1998). Verleye и соавт. (2005) было показано, что этифоксин неконкуретно ингибировал связывание лиганда РКП 195 с МТБ 18 в препаратах переднего мозга, полученных от интактных самцов крыс. У адреналэктомированных кастрированных крыс этифоксин в анкиолитических эффективных дозах повышал концентрации прегненолона, 5 -дегидропрогестерона и аллопрегнанолона в сыворотке крови и головном мозге. Соединение ХBD173, ранее называвшееся АС-5216, вызывало выраженные противотревожные и антидепрессантные эффекты в конфликтном тесте Вогеля у крыс, тестах «светлая-тёмная камера» и «социального взаимодействия» у мышей, тесте «вынужденное плавание» по Parsolt у крыс (Kita et al, 2004). В тесте «социальное взаимодействие» у мышей анксиолитическое действие XBD173 ингибировалось введением трилостана (ингибитор З-гидроксистероидной дегидрогеназы), финастерида (ингибитор 5а-редуктазы) и пикротоксина (анатагонист ГАМКА-рецепторов), в то время как противотревожная активность бензодиазепинов ингибировалась только введением пикротоксина, свидетельствуя об участии МТБ18-опосредованного нейростеройдогенеза в реализации анксиолитических эффектов XBD173 у мышей (Kita and Furakawa, 2008). Rupprecht и соавт. (2009) показали, что XBD173 оказывает положительное модулирующее влияние на ГАМКА-рецепторы в срезах головного мозга путём стимуляции синтеза НС, ранее ингибированного введением финастерида (Rupprecht et al., 2009). Кроме того, анксиолитические свойства XBD173 были показаны в тесте «социального взаимодействия» и ПКЛ. Данные эффекты подавлялись введением PK11195, селективного блокатора МТБ 18 (Rupprecht et al., 2009). Анксиолитические свойства XBD173 были подтверждены в экспериментах с лактат- или CCK4-индуцированными тревогой у грызунов (Rupprecht et al., 2009). В отличие от бензодиазепинов XBD173 не обнаруживал седативных эффектов, симптомов синдрома отмены или привыкания (Kita et al., 2009; Rupprecht et al., 2009). Другие лиганды МТБ18, N-(4-хлоро-2-феноксифенил)-N-(2-изопропокси-бензил) ацетамид (DAA1097), N-(2б5-диметоксибензил)-N-(5-флуоро-2-феноксифенил) ацетамид (DAA1106) и MPIGA, показали противотревожные эффекты в тестах «тёмная-светлая камера» и ПКЛ (Costa et al., 2011). В клинических экспериментах у пациентов с паническими атаками XDB173 вызывал выраженный терапевтический эффект, не приводя к развитию седации и синдрома отмены (Rupprecht et al., 2009).

Ряд БД, таких как Дз и мидазолам, не только реализуют свой эффект через усиление активности ГАМКА-рецепторов, но и обладают способностью потенциировать нейростеройдогенез посредствам непосредственного воздействия на активность МТБ 18 (Rupprech et al., 2010; Tokuda et al., 2010). Мидазолам, применяемый в клинической практике для потенцирования анестезии, вызывает повышение концентрации НС и существенно тормозит процесс долговременной потенциации в пирамидальных нейронах головного мозга крыс (Tokuda et al., 2010). Финастерид, ингибитор 5-редуктазы, и 17РА (17-фенил-35-андрост-16-ен-3-ол), селективный антагонист ГАМКA-рецепторов, снижают активность мидозалама. Клоназепам, БД анксиолитик и противосудорожный препарат, не понижает уровень нейростеройдогенеза и не влияет на долговременную потенциацию.

Анализ поведенческих реакций, возникающих при совместном введении коразола и анксиолитиков у грызунов в тестах «открытое поле» и «приподнятый крестообразный лабиринт»

У крыс Wistar при совместном введении диазепама (1, 5 мг/кг) и коразола (20 мг/кг) диазепам оказывал различное влияние на параметры ОИР в зависимости от дозы. Диазепам (1 мг/кг) полностью восстанавливал структуру ОИР. В то время как эффект диазепама (5 мг/кг) отличался от дозы анксиолитика в 1 мг/кг по параметру вертикальной активности, которая не восстанавливалась и была ниже аналогичного показателя у группы животных, получавших физиологический раствор (P0,01) (табл. 3.2). Афобазол (0,5 мг/кг) при совместном введении с коразолом не оказывал анксиолитического действия. В дозе 1 мг/кг афобазол увеличивал в 2 раза показатель вертикальной активности, в 1,5 раза - число обследованных отверстий, Коир, сниженные введением антагониста ГАМКА-рецепторов (P0,01) (табл. 3.2). Повышение дозы афобазола до 5 мг/кг сопровождалось снижением в 2 раза горизонтальной активности и Коир по сравнению с группой крыс, получавших инъекция физ. р-ра (P0,01) (табл. 3.2). Следует отметить, что афобазол корректировал вертикальную активность, сниженную введением коразола, в дозе 1 и 5 мг/кг, а диазепам – только в дозе 1 мг/кг. Совместное применение коразола и мексидола (100 мг/кг) сопровождается снижением в 3,5 раза параметра величины обследований отверстий по сравнению с группой животных, получавших инъекцию коразола (P0,05). Кроме того в данной группе животных отмечалось уменьшение параметров вертикальной активности, обследования отверстий и Коир относительно группы физ. р-ра (P0,01) (табл. 3.2). В тесте ПКЛ афобазол (1 мг/кг) увеличивал в 3 раза параметр времени нахождения крыс Wistar в светлом рукаве лабиринта, сниженный после введении коразола (15 мг/кг) (P0,05) (табл. 3.3).

Таким образом, можно заключить, что доза 1 мг/кг для афобазола и диазепама является оптимальной для восстановления ОИР, нарушенной введением коразола (20 мг/кг) у крыс Wistar. отличие от коразола; , - Р 0,05; 0,01 отличие от физ. р-ра (по ANOVA) Табл. 3.3 Влияние афобазола на тревожные реакции, вызванные коразолом, у крыс Wistar в тесте «приподнятый крестообразный лабиринт».

У мышей линии BALB/c анксиолитическое действие диазепам (1 мг/кг) выражалось в увеличении по сравнению с группой мышей, получавших инъекцию физ. р-ра, всех регистрируемых составляющих ОИР. При инъекции коразола (30 мг/кг) через 30 мин после диазепама (1 мг/кг) сохранялись повышенные по сравнению с физ. р-ом уровни горизонтальной, вертикальной активностей (P0,01). Вместе с тем при совместном введении диазепама и коразола наблюдалось ещё более выраженное, чем при введении только коразола, уменьшение числа обследованных отверстий (P0,05). Несмотря на снижение этого параметра, Коир не отличался от такового при введении одного диазепама (табл. 3.4).

Таким образом, диазепам (1 мг/кг) сохранял анксиолитические свойства при комбинированном введени с коразолом (30 мг/кг) у мышей BALB/c в ОП.

Афобазол (1 мг/кг) вызывал повышение горизонтальной активности, количества вертикальных стоек и суммарного показателя Коир (P0,01). Афобазол (1 мг/кг) при совместном введении с коразолом (30 мг/кг) усиливал анксиогенные эффекты последнего у мышей BALB/c. Данный феномен выражался в более чем 5-ти кратном снижении горизонтальной активности, полном подавлении вертикализации, а также уменьшении Коир в 2 раза по сравнению с группой мышей, которым вводили коразол (Р0,01) (табл. 3.4). Мексидол (150 мг/кг, в/б) не изменял поведения мышей в тесте ОП. Мексидол (150 мг/кг) при введении с коразолом (30 мг/кг) не восстанавливал параметры ОИР у мышей BALB/c в тесте ОП (табл. 3.4).

Таким образом, афобазол (1 мг/кг) не только не компенсировал усиление тревожных реакций, вызванных коразолом (30 мг/кг), но и потенциировал поведенческие эффекты блокады ГАМКА-рецепторов.

При сочетании диазепама (1 мг/кг) с коразолом (30 мг/кг) не отмечалось изменения параметров ОИР по сравнению с группой мышей, которым вводился один коразол. Таким образом, у мышей С57Bl/6 диазепам (1 мг/кг) не только не обладает анксиолитическим действием, но и не компенсирует поведенческие нарушения, индуцированные снижением функциональной активности ГАМКА-рецепторов.

Афобазол (1 мг/кг) восстанавливал сниженную коразолом (30 мг/кг) горизонтальную двигательную активность (P0,05; 0,01) (табл. 3.5). При этом афобазол не влиял на число обследований отверстий, но провоцировал падение количества вертикальных стоек (P0,05) (табл. 3.5). В отношении Коир афобазол полностью восстанавливал данный показатель до контрольных значений при предварительном введении с КР (P0,01) (рис. 3.1).

Таким образом, афобазол (1 мг/кг), не оказывая собственного анксиолитического действия у мышей C57Bl/6, предотвращал усиление тревожных реакций, наблюдаемых при введении коразола.

Мексидол (150 мг/кг, в/б) восстановливал параметр вертикальной активности и Коир, сниженные введением коразола (рис. 3.1), (табл. 3.5).

Таким образом, способность анксиолитиков корректировать нарушения поведения, вызванные малыми дозами коразола, зависит от фенотипа эмоционально-стрессовой реакции грызунов. Афобазол у крыс Wistar и мышей линии С57Bl/6 восстанавливал большинство поведенческих нарушений, вызванных функциональной блокадой ГАМКА-рецепторов. У мышей BALB/c афобазол потенцеировал тревогу, индуцированную коразолом.

Влияние функциональной активности циклооксигеназы на ориентировочно-исследовательскую реакцию у мышей BALB/c в тесте «открытое поле»

Имеются экспериментальные указания на то, что НС оказывают важное выраженное воздействие на активность не только ГАМКА-рецепторов, но и на глутаматные, серотониновые, каинатные, глициновые, - и никотиновые ацетилхолиновые рецепторы (Rupprecht and Holsboer, 2001). Изменение концентраций моноаминов (дофамина, серотонина, норадреналина) и ряда НС наблюдается при аффективных расстройствах различного спектра (Blier and De Montigny, 1998). Таким образом, следует ожидать, что нарушения процесса синтеза эндогенных НС могут вызывать изменения в содержании и/или метаболизме нейромедиаторов. Вместе с тем, эффекты селективных ингибиторов нейростероидогенеза на содержание моноаминов в головном мозге грызунов не изучены. Учитывая вышеописанные факты, оценка влияния веществ, изменяющих синтез НС, на уровень нейромедиаторов в различных структурах головного мозга является весьма перспективной экспериментальной задачей.

Целью данной серии экспериментов послужило изучение влияния коразола, финастерида и индометацина на уровень нейромедиаторов в структурах головного мозга крыс. В качестве пассивного контроля использовали физ. р-р. В качестве активного контроля использовали коразол, вызвающий в экспериментальных условиях усиление тревожных реакций, а при клиническом применении – панические атаки (Jung et al., 2002).

Опыты проводили на самцах белых крыс стока Wistar. Индометацин (15 мг/кг), финастерид (15 мг/кг) и коразол (20 мг/кг) вводили внутрибрюшинно за 30 мин до декапитации. Уровень моноаминов определяли во фронтальной коре и гипоталамусе, прилежащем ядре, стриатуме и гиппокампе, структурах лимбической системы головного мозга, отвечающей за формирование мотиваций, эмоций, поведенческих реакций (Heuvel and Sporns, 2013). Установлено, что функциональная блокада ГАМКА-рецепторов вызывает снижение уровня 3-метилтирамина (3-МТ), метаболита дофамина, во фронтальной коре и стриатуме (на 62 и 25% соответственно) (таб. 7.1; 7.4) (P0,05; 0,01). В гиппокампе крыс Кр повышал уровень 3,4-диоксифенилуксусной кислоты (ДОФУК) на 11% в сравнении с контрольной группой животных (таб. 7.5) (P0,01). Также отмечалась тенденция к увеличению соотношения 3,4-диоксифенилуксусная кислота/дофамин (ДОФУК/ДА) в гиппокампе, что свидетельствует об усилении метаболизма дофамина (таб. 7.5). В других изучаемых структурах изменений в концентрациях моноаминов обнаружено не было (таб. 7.2; 7.3).

Индометацин (15 мг/кг), ингибитор 3-гидроксистероидной оксидоредуктазы, фермента метаболизма 5-дигидропрогестерона в аллопрегненалон, на 68% понижал уровень 3-МТ во фронтальной коре крыс стока Wistar (P0,01) (таб. 7.1). В стриатуме индометацин вызывал повышение концентраций основного метаболита серотонина, 5-оксииндолуксусной кислоты (5-ОИУК) на 28%, при этом снижая соотношение ДОФУК/ДА на 12% (P0,01) (табл. 7.4). Кроме того, в гиппокампе под действием индометацина отмечалось падение уровня 5-ОИУК (на 17 %, P0,05), наблюдалась тенденция к снижению концентраций дофамина (ДА) и повышению величины соотношения ДОФУК/ДА (таб. 7.1). Таким образом, нами было отмечено, что в отличие от Кр при введении индометацина наблюдаются изменения в метаболизме не только дофамина, но и серотонина. При этом изменения были зарегистрированы в тех же структурах, что в группеКр.

Наибольшее влияние на концентрацию нейромедиаторных моноаминов оказывало введение финастерида (15 мг/кг). Так, елективный ингибитор 5-редуктазы, ключевого фермента нейростероидогенеза, вызывал падение уровня норадреналина, изменений содержания которого не отмечалось при введении Кр и индометацина, на 29% (P0,01) во фронтальной коре (таб. 7.1), уменьшение содержание дофамина в гиппокампе (56%, p0,05) (таб. 7.5), снижение на 12% параметров соотношения ДОФУК/ДА и повышение на 16% величины соотношения 5-ОИУК/5-окситриптамин в стриатуме (таб. 7.4) (P0,01). Установлено, что при введении ингибитора 5-редуктазы в гиппокампе наблюдалось существенное повышение соотношений ДОФУК/ДА (147%, P0,01) и гомованилиновая кислота/ДА (54%, P0,05) (таб. 7.5).

В экспериментальной работе Chimakurthy и Talasia (2010) было показано, что КР (20 мг/кг) у крыс Wistar при внутрибрюшинном введении вызывает падение уровней норадреналина в гиппокампе и гипоталамусе, также наблюдается падение уровней дофамина в коре больших полушарий, гипоталамусе, гиппокампе и Варолиевом мосте. Это согласуется с результатами настоящего исследования, в котором было обнаружено, что КР изменяет концентрации метаболитов дофамина во фронтальной коре, стриатуме, гиппокампе. К сожалению, в литературных источниках отсутствуют данные об изменениях содержания нейромедиаторных моноаминов на фоне введения блокаторов нейростероидогенеза.

Таким образом, полученные в данной серии экспериментоврезультаты свидетельствуют, что наиболее выраженные нарушения в концентрациях нейромедиаторов были выявлены при введении финастерида. Ингибитор 5-редуктазы провоцировал падение уровней норадреналина во фронтальной коре, изменял концентрации метаболитов серотонина и дофамина в гиппокампе и стриатуме. Считается, что именно вышеописанные структуры отвечают за реализацию поведенческих и когнитивных функций, ориентирование и пространственную память, пищедобывающее поведение, формирование условных рефлексов, эмоциональную активность (Van den Heuvel and Sporns, 2013). Эти результаты согласуются с ранее полученными данными об угнетении финастеридом ориентировочно-исследовательской реакций грызунов в тестах ОП, ПКЛ. При этом из всех изученных веществ, влияющих на систему синтеза НС, наиболее выраженное действие в отношении спектра нейромедиаторов и количества структур, в которых были установлены изменения, оказывал именно финастерид.