Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 16
1.1. Структура, локализация и механизмы регуляции гликопротеина-Р 16
1.1.1. Суперсемейство АТФ-связывающих кассетных транспортеров (ABC-транспортеров) 16
1.1.2. Структура и транспортный цикл гликопротеина-Р 18
1.1.3. Локализация и функции гликопротеина-Р 22
1.1.4. Механизмы регуляции гликопротеина-Р 24
1.2. Подходы к тестированию лекарственных веществ на принадлежность к ингибиторам/индукторам гликопротеина-P 37
1.2.1. Тестирование лекарственных веществ на принадлежность к ингибиторам/индукторам гликопротеина-Р in vitro 37
1.2.2. Тестирование лекарственных веществ на принадлежность к ингибиторам/индукторам гликопротеина-Р in vivo .41
1.3. Фармакология половых гормонов 46
1.3.1. Общие сведения о стероидных гормонах 46
1.3.2. Фармакология эстрогенов.. 48
1.3.3. Фармакология гестагенов 50
1.3.4. Особенности эстрального цикла кроликов .52
1.3.5. Фармакология андрогенов 53
1.4. Влияние половых гормонов на функционирование гликопротеина-P .55
1.4.1. Половые различия в функционировании гликопротеина-Р 55
1.4.2. Влияние эстрогенов на функционирование гликопротеина-Р 57
1.4.3. Влияние гестагенов на функционирование гликопротеина-Р 58
1.4.4. Влияние тестостерона на функционирование гликопротеина-Р. 61
Глава 2. Материалы и методы исследования 64
2.1. Исследования in vitro 64
2.1.1. Клеточная линия 64
2.1.2. Культивирование клеток линии Caco-2 64
2.1.3. Определение активности гликопротеина-Р in vitro 65
2.1.4. Оценка влияния тестируемых веществ на активность гликопротеина-Р in vitro 66
2.1.5. Определение концентрации фексофенадина в транспортной среде 66
2.1.6. Валидация хроматографической методики определения концентрации фексофенадина в транспортной среде 67
2.2. Исследования in vivo 75
2.2.1. Экспериментальные животные 75
2.2.2. Дизайн исследования 77
2.2.3. Определение активности гликопротеина-Р in vivo 83
2.2.4. Определение концентрации фексофенадина в плазме крови кроликов .84
2.2.5. Валидация хроматографической методики определения концентрации фексофенадина 85
2.2.6. Анализируемые фармакокинетические параметры 94
2.2.7. Биохимические методы исследования 94
2.2.8. Иммуногистохимическое исследование 95
2.3. Статистическая обработка полученных результатов 97
Глава 3. Результаты исследования 99
3.1. Активность гликопротеина-Р в опытах in vitro 99
3.2. Влияние эстрадиола, прогестерона, тестостерона, финастерида, комбинации эстрадиола и прогестерона, этинилэстрадиола и гестодена на активность гликопротеина-Р в опытах in vitro 102
3.3. Половые различия в функционировании гликопротеина-Р у кроликов породы Шиншилла 102
3.4. Влияние «ложной» операции на функционирование гликопротеина-Р 104
3.5. Влияние дистиллированной воды на функционирование гликопротеина-Р 108
3.6. Влияние верапамила, рифампицина и тироксина на функционирование гликопротеина-Р 110
3.7. Функционирование гликопротеина-Р при орхиэктомии и последующем введении тестостерона 118
3.8. Влияние тестостерона на функционирование гликопротеина-Р 124
3.9. Влияние финастерида на функционирование гликопротеина-Р 133
3.10. Функционирование гликопротеина-Р при овариоэктомии 143
3.11. Влияние эстрадиола на функционирование гликопротеина-Р 149
3.12. Влияние прогестерона на функционирование гликопротеина-Р 160
3.13. Влияние комбинации эстрадиола и прогестерона на функционирование гликопротеина-Р 173
3.14. Влияние комбинации этинилэстрадиола и гестодена на функционирование гликопротеина-Р 180
3.15. Зависимость функционирования гликопротеина-Р от концентрации половых гормонов 192
3.16. Роль альфа эстрогеновых, прогестероновых, тестостероновых рецепторов и конститутивного андростанового рецептора энтероцитов тощей кишки в изменении функционирования гликопротеина-Р под действием гормональных лекарственных средств 200
Глава 4. Обсуждение полученных результатов 212
Выводы 241
Практические рекомендации 244
Перспективы дальнейшей разработки темы 245
Список сокращений 246
Список литературы 248
- Структура и транспортный цикл гликопротеина-Р
- Валидация хроматографической методики определения концентрации фексофенадина в транспортной среде
- Функционирование гликопротеина-Р при овариоэктомии
- Роль альфа эстрогеновых, прогестероновых, тестостероновых рецепторов и конститутивного андростанового рецептора энтероцитов тощей кишки в изменении функционирования гликопротеина-Р под действием гормональных лекарственных средств
Структура и транспортный цикл гликопротеина-Р
Рgp представляет собой крупный трансмембранный гликопротеин с молекулярной массой 170 кДа (из них 150 кДа приходится на пептидную часть), высотой 136 и диаметром 70 [61, 68, 223, 262]. Молекула Pgp у человека образована 1280, а у мышей – 1276 остатками аминокислот, сгруппированными в две гомологичные половины, которые соединены между собой подвижным линкерным полипептидом (рис. 1) [100, 125]. Данный пептид обеспечивает конформационную устойчивость Pgp, необходимую для его нормального функционирования [160].
Pgp синтезируется в эндоплазматическом ретикулуме в виде промежуточного продукта с молекулярной массой 150 кДа, который затем гликозилируется в комплексе Гольджи перед выходом на клеточную поверхность [194].
Каждая половина Pgp, как и всех остальных АВС-транспортеров эукариот, состоит из большого гидрофобного трансмембранного домена (TMD) и консервативного цитоплазматического домена, включающего АТФ-связывающий сайт (NBD) [262, 280]. Для соответствующей направленности в пространстве и стабильности молекулы Рgp необходимо N-гликозилирование по его первой экстрацеллюлярной петле [258]. Каждый трансмембранный домен представлен 6 трансмембранными сегментами (TMS) 1-6 и 7-12 [193, 196], образующими вместе большую внутреннюю полость (6000 3), открытую в цитоплазму и цитоплазматическую мембрану, которая может одновременно вмещать, по меньшей мере, две молекулы субстратов (рис. 1) [61, 68, 280]. Рисунок 1. Строение гликопротеина-Р по [68, 173]
Транспортируемые вещества попадают во внутреннюю полость Pgp через два портала, образованных ТМS 4/6 и 10/12 [68], или по другим данным ТМS 5/8 и 2/11 [193, 195]. Считается, что ТМS 1, 4, 5, 6, 7, 10, 11 и 12 играют важную роль в связывании и эффлюксе субстратов Pgp [195, 228], по некоторым данным первостепенная роль отводится ТМS 1 и 7 [249].
Pgp обладает широкой субстратной специфичностью. Его субстратами являются преимущественно липофильные вещества с молекулярной массой 330 - 4000 Да, относящиеся к следующим фармакологическим группам: противоопухолевые, гипотензивные и антигистаминные препараты, сердечные гликозиды, антиагреганты, антикоагулянты, стероидные и тиреоидные гормоны, антибиотики, ингибиторы ВИЧ-протеиназы, иммунодепрессанты и др. [19, 217, 224, 299].
Такая полиспецифичность Pgp объясняется наличием во внутренней полости молекулы транспортера множественных сайтов, связывающих ксенобиотики, что позволяет ему транспортировать вещества различного химического строения. Также показано, что для обеспечения полиспецифичности Pgp способен принимать различные конформации при взаимодействии с субстратами, то есть каждый субстрат создает для себя специфические сайты связывания [68, 173, 228]. С другой стороны, такая подвижность отдельных TMS затрудняет изучение трехмерной структуры данного белка-транспортера [173, 223].
Являясь липофильными молекулами, субстраты Pgp легко растворяются в цитоплазматической мембране. Pgp, работая как «гидрофобный пылесос», связывает данные вещества в цитоплазматической мембране и выводит их во внеклеточную среду. То есть транспортер способен перехватывать субстраты, прежде, чем они смогут войти в цитозоль, тем самым защищая клетку от воздействия потенциально токсичных молекул. Эта концепция поддерживается данными рентгеноструктурного анализа Pgp [68]. Некоторые авторы считают, что Pgp может также работать как «флиппаза», транспортируя вещества от цитоплазматической к внеклеточной поверхности билипидной мембраны [157] (рис. 2).
Предложено несколько моделей для описания транспортного цикла Pgp [61]. С совершенствованием подходов и методов исследований данные модели постоянно обновляются и дополняются, поэтому приведем лишь общие представления о транспортном цикле данного белка-транспортера (рис. 3). Рисунок 3. Транспортный цикл гликопротеина-Р по [69]
В неактивном состоянии два NBD отделены друг от друга на расстоянии 30 , образуя конформацию Pgp, открытую внутрь клетки. На I стадии транспортного цикла субстрат взаимодействует с сайтом связывания в TMD Pgp. На II стадии связывание субстрата снижает энергию активации и увеличивает сродство Pgp к АТФ. Это приводит к димеризации двух NBD, и связыванию 2 молекул ATФ на границе доменов. Причем каждый сайт связывания АТФ формируется из walker A и walker B одной субъединицы NBD и walker C другой субъединицы [261]. Конформационные изменения, обусловленные этой димеризацией, переносят лекарственное средство в низкоаффинное внеклеточное положение, откуда оно высвобождается во внеклеточное пространство. Стадии III и IV представляют собой две последовательные реакции гидролиза АТФ, которые обеспечивают энергию, для разъединения «сэндвича» нуклеотидного димера-АТФ и для последующей трансформации Pgp в исходную конформацию (стадии V-VI) [69]. Причем лимитирующей стадией в данном процессе является отщепление от молекулы транспортера АДФ и неорганического фосфата [271]. Особенностью функционирования Pgp является наличие у него так называемой «базальной АТФазной активности» при отсутствии в среде субстратов транспортера. Установлено, что гидролиз АТФ необходим для поддержания определенной пространственной структуры данного транспортера, обеспечивающей высокую активность и широкую субстратную специфичность [66].
Валидация хроматографической методики определения концентрации фексофенадина в транспортной среде
Валидацию биоаналитической методики выполняли согласно Руководству по экспертизе лекарственных средств (Том I), правилам проведения исследований биоэквивалентности лекарственных препаратов в рамках Евразийского экономического союза, руководствам ЕМА Guideline on bioanalytical method validation, 2011 и FDA Guidance for Industry: Bioanalytical method validation (draft guidance). U.S. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration, Center for Drug Evolution and Research (CDER). U.S. Government Printing Office: Washington, DC, 2013 по следующим параметрам: селективность; калибровочная кривая (линейность); точность; прецизионность; нижний предел количественного определения; перенос пробы; стабильность фексофенадина в транспортной среде.
Параметры пригодности хроматографической системы. Число теоретических тарелок составило более 3100 (норма – не менее 2000), коэффициент асимметрии пика – не более 1,2 (норма – не более 2).
Селективность. В качестве матрицы использовали транспортную среду. На хроматограммах образцов чистой транспортной среды, а также транспортной среды после инкубации с клетками линии Caco-2 в течение 3 часов не фиксировалось пиков со временем удерживания, совпадающим со временем удерживания фексофенадина (рис. 5, 6).
Предел обнаружения фексофенадина в транспортной среде при помощи используемой аналитической методики составил 0,4 мкМ, при этом соотношение сигнала к шуму (базовой линии) равнялось 3.
Нижний предел количественного определения фексофенадина составил 1,2 мкМ. При этом отношение сигнала к шуму было не ниже 10, а точность и прецизионность определения не превышали 20%.
Для построения калибровочных графиков готовили 7 стандартных растворов фексофенадина в транспортной среде следующих концентраций: 1,2 мкМ, 2,4 мкМ, 4,8 мкМ, 9,57 мкМ, 19,14 мкМ, 38,27 мкМ, 57,4 мкМ. Данные растворы были приготовлены и проанализированы троекратно. По полученным значениям построены три калибровочных графика зависимости площади пика фексофенадина от концентрации фексофенадина в транспортной среде. Графики представлены на рис. 7–9.
Рассчитанные коэффициенты корреляции соответствовали принятой норме (не менее 0,99). Отклонения концентраций калибровочных образцов, рассчитанные по уравнению линейной зависимости, от номинальных значений, приведены в табл. 4.
Точность и прецизионность. Выполняли анализ образцов транспортной среды с добавлением стандартных растворов фексофенадина до получения концентраций 1,2, 9,57 и 38,27 мкМ.
Анализ выполняли в рамках трех циклов. В первом цикле оценивали прецизионность и точность внутри цикла, для этого анализировали по 5 образов для каждой концентрации фексофенадина. Во втором и третьем цикле тестировали прецизионность и точность между циклами.
Полученные величины прецизионности (относительного стандартного отклонения) и точности (относительной погрешности) соответствовали принятым нормам (не более 20% для нижнего предела количественного определения и не более 15% - для остальных точек) (табл. 5, 6).
Стабильность. Для оценки стабильности фексофенадина в транспортной среде при хранении в замороженном состоянии готовили образцы, аналогичные по составу калибровочному раствору с концентрацией 38,27 мкМ. Половину образцов анализировали сразу после приготовления, а остальные – после хранения в замороженном состоянии (при -29 С) в течение 60 дней. Исследовали по 3 независимых образца. Рассчитанные концентрации фексофенадина до и после заморозки статистически значимо не различались (табл. 7).
Перенос пробы. При последовательном анализе пробы с концентрацией фексофенадина 57,4 мкМ и образца чистой транспортной среды на хроматограмме чистой транспортной среды отсутствовали пики, соответствующие по времени удерживания пикам фексофенадина.
Функционирование гликопротеина-Р при овариоэктомии
В следующих сериях экспериментов изучалось влияние женских половых гормонов на функционирование Pgp.
Вначале были оценены гормональный фон самок кроликов и функционирование белка-транспортера при овариоэктомии.
При гонадэктомии у самок животных по сравнению с исходными значениями отмечалось снижение концентрации эстрадиола на 42 сут эксперимента – на 29,7% (p=0,028), уменьшение содержания прогестерона на 14 сут на 31,3% (p=0,028), на 28 сут – на 54,9% (p=0,028), на 42 сут – на 44,3% (p=0,028) (табл. 34). Уровень тестостерона у животных на протяжении всего эксперимента достоверно не изменялся.
На 14 сут овариоэктомии отмечалась тенденция к увеличению Cmax фексофенадина в 1,61 раза (90% ДИ 1,09 – 2,38, p=0,093) и AUC0-– в 3,07 раза (90% ДИ 1,05 – 8,97, p=0,089) по сравнению с исходными значениями соответственно.
На 28 сут кастрации сохранялась тенденция к увеличению Cmax фексофенадина в 1,48 раза (90% ДИ 1,03 – 2,12, p=0,083) и происходило повышение AUC0-– в 1,92 раза (90% ДИ 1,15 – 3,21, p=0,05) по сравнению с показателями до операции.
На 42 сут гонадэктомии отмечалось увеличение Cmax фексофенадина в 2,43 раза (90% ДИ 1,87 – 3,15, p=0,0039), AUC0 – в 2,24 раза (90% ДИ 1,53 – 3,28, p=0,008) и AUC0- – в 2,68 раза (90% ДИ 1,22 – 5,87, p=0,053) по сравнению с исходными значениями (табл. 35, 36).
Данные изменения фармакокинетики фексофенадина свидетельствуют об увеличении всасывания маркерного субстрата Pgp, повышении его содержания в организме кроликов при неизмененном выведении, что, в свою очередь, характеризует снижение активности белка-транспортера преимущественно в кишечнике.
Выполнение иммуногистохимического исследования тощей кишки после овариоэктомии выявило ряд изменений. Локализация Pgp-позитивной реакции не изменялась по сравнению с показателями интактных животных, положительную реакцию давали апикальные и латеральные мембраны энтероцитов. В то же время при гонадэктомии наблюдалось снижение интенсивности Pgp-позитивной реакции мембран энтероцитов на 30,3% (р=0,008) по сравнению с показателями нормы (рис. 27, 28). Данные результаты косвенно свидетельствуют о снижении относительного количества Pgp.
Таким образом, нами установлено, что при овариоэктомии у самок кроликов породы Шиншилла происходит снижение содержания эстрадиола и прогестерона в сыворотке крови, что сопровождается уменьшением функциональной активности Pgp и его относительного количества в тощей кишке.
Роль альфа эстрогеновых, прогестероновых, тестостероновых рецепторов и конститутивного андростанового рецептора энтероцитов тощей кишки в изменении функционирования гликопротеина-Р под действием гормональных лекарственных средств
Для изучения роли альфа эстрогеновых (ERa), прогестероновых (PR), тестостероновых рецепторов (TR) и конститутивного андростанового рецептора (CAR) энтероцитов тощей кишки в изменении функционирования Pgp под действием гормональных лекарственных средств методом иммуногистохимии c использованием специфических антител к данным рецепторам было оценено наличие иммунопозитивной реакции в ядрах клеток при орхиэктомии, овариоэктомии, введении тестостерона, финастерида, эстрадиола, прогестерона, комбинаций прогестерона и эстрадиола, этинилэстрадиола и гестодена.
Во всех исследуемых сериях эксперимента у самцов и самок кроликов не было выявлено иммунопозитивной реакции ядер энтероцитов тощей кишки с антителами к TR. При этом в ткани-мишени тестостерона (семенном канальце) была обнаружена TR-позитивная реакция ядер клеток (позитивный контроль) (рис. 35).
У интактных кроликов-самок определялась слабая иммунопозитивная реакция ядер энтероцитов тощей кишки с использованием антител к ERa. Выполнение овариоэктомии, введение эстрадиола в дозе 2 мг/кролик, прогестерона в дозе 15 мг/кролик, комбинации эстрадиола в дозе 0,5 мг/кролик и прогестерона в дозе 5 мг/кролик, а также комбинации этинилэстрадиола в дозе 6,5 мкг/кг массы и гестодена в дозе 16,5 мкг/кг массы существенно не влияло на количество ERa-позитивных ядер (рис. 36, табл. 68). При этом в органах и тканях – мишенях эстрадиола (яичнике, эндометрии, слизистой оболочке влагалища) у интактных самок кроликов была обнаружена выраженная ERa-позитивная реакция в ядрах клеток (позитивный контроль) (рис. 36).
У кроликов-самцов ERa-позитивной реакции в ядрах энтероцитов тощей кишки обнаружено не было ни в норме, ни при введении тестостерона, ни при выполнении орхиэктомии.
В отличии от ERa PR не выявлялись иммуногистохимически в энтероцитах тощей кишки не только у самцов, но и у самок кроликов во всех сериях эксперимента. При этом в ткани-мишени прогестерона – эндометрии интактных самок кроликов была обнаружена PR-позитивная реакция (позитивный контроль) (рис. 37).
При изучении возможной роли CAR в реализации воздействий половых гормонов на функционирование Pgp были получены следующие результаты (рис. 38, 39, табл. 69, 70). У интактных кроликов (самцов и самок) определялись лишь единичные CAR-позитивные ядра в энтероцитах тощей кишки, причем у самок их количество было несколько выше (на 148,4%, р=0,151). Курсовое введение кроликам обоего пола рифампицина в дозе 20 мг/кг массы в течение 14 сут (индуктор экспрессии CAR) приводило к увеличению количества CAR-позитивных ядер (в 19,4 раза у самцов, p=0,008, и 6,6 раза у самок, р=0,032), что подтверждает адекватность используемого метода.
У кроликов-самцов введение тестостерона в дозе 24 мг/кг массы в течение 21 сут существенно не влияло на количество CAR-позитивных ядер энтероцитов тощей кишки. В то же время выполнение орхиэктомии приводило к увеличению их количества на 21 сут эксперимента в 10,2 раза (р=0,008), также как и введение финастерида интактным кроликам и животным на фоне кастрации в 6,7 раза и 6,2 раза (р=0,008) соответственно.
У кроликов-самок отмечалось увеличение количества CAR-позитивных ядер энтероцитов тощей кишки в 3,6 раза (р=0,032) на 28 сут введения эстрадиола в дозе 2 мг/кролик на фоне овариоэктомии по сравнению с показателями интактных животных. Во всех остальных сериях экспериментов (при овариоэктомии, введении прогестерона в дозе 15 мг/кролик, комбинации эстрадиола в дозе 0,5 мг/кролик и прогестерона в дозе 5 мг/кролик, а также комбинации этинилэстрадиола в дозе 6,5 мкг/кг массы и гестодена в дозе 16,5 мкг/кг массы) количество CAR-позитивных ядер существенно не изменялось по сравнению со значениями интактных животных.
Полученные результаты свидетельствуют о том, что ядерные PR и TR, видимо, не играют существенной роли в изменении активности и синтеза Pgp под действием половых гормонов, а ядерные ERa у самок кроликов могут участвовать в регуляции функционирования белка-транспортера.
В то же время тестостерон может снижать активность и синтез Pgp за счет подавления образования CAR, а эстрадиол в высоких дозах может повышать его активность и синтез, напротив, увеличивая образование CAR.