Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Литературный обзор 13
1.1 Современное состояние вопросов терапии инфекционных
конъюнктивитов бактериальной этиологии 13
1.2 Мирамистин как перспективный антимикробный агент глазных капель и особенности его фармацевтического анализа в разрабатываемых глазных каплях 22
1.3 Димедрол как эффективный противоаллергический агент для разрабатываемых глазных капель и методы его анализа
1.4 Обоснование использования Na-КМЦ и ПВС в качестве пролонгаторов в составе разрабатываемых глазных капель 29
1.5 Перспективы использования твердофазной механохимической обработки пролонгаторов для модификации их физико-химических показателей 31
Заключение по обзору литературы 36
ГЛАВА II. Материалы и методы исследования 37
2.1 Материалы исследования 37
2.1.1 Действующие вещества 38
2.1.2 Вспомогательные вещества 39
2.2 Методы исследования 40
2.2.1 Физические и физико-химические методы 40
2.2.2 Биофармацевтические методы 44
2.2.3 Микробиологические методы 44
2.2.4 Статистические методы 45
2.3 Дизайн исследования 45
ГЛАВА III. Разработка состава и технологии пролонгированных глазных капель антимикробного действия 48
3.1 Изучение изменения формы и размеров частиц пролонгаторов в
процессе их твердофазной механохимической обработки 48
3.1.1 Изучение формы и размеров частиц Na-КМЦ 48
3.1.2 Изучение формы и размеров частиц ПВС 50
3.1.3 Изучение формы и размеров частиц комбинированного пролонгатора Na-КМЦ и ПВС 51
3.2 Изучение распределения частиц пролонгаторов по размерам в процессе механохимической обработки 57
3.2.1 Изучение распределения по размерам частиц Na-КМЦ 57
3.2.2 Изучение распределения по размерам частиц ПВС 3.3 Изучение изменения физико-химических свойств водных растворов пролонгаторов в процессе механообработки 60
3.4 Изучение изменения технологических характеристик пролонгаторов в процессе механообработки 64
3.5 Разработка состава пролонгированных глазных капель антимикробного действия 71
3.6 Биофармацевтические исследования разрабатываемых глазных капель антимикробного действия 73
3.7 Изучение стабильности составов модельных смесей
разрабатываемых глазных капель антимикробного действия 74
3.8 Разработка технологической схемы производства пролонгированных глазных капель антимикробного действия 77
Выводы по главе 82
ГЛАВА IV. Разработка норм качества пролонгированных глазных капель для лечения бактериальных конъюнктивитов 83
4.1 Разработка методики определения мирамистина и димедрола в разрабатываемых глазных каплях 83
4.2 Результаты валидации методики определения мирамистина и димедрола в разрабатываемых глазных каплях 89
4.3 Разработка норм качества для пролонгированных глазных капель
антимикробного действия «Мирадрол» 103
4.4 Определение антимикробной активности разрабатываемых пролонгированных глазных капель для лечения бактериальных конъюнктивитов 105
4.5 Изучение сроков годности пролонгированных глазных капель «Мирадрол» 108
Выводы по главе 110
Заключение 111
Список сокращений и условных обозначений 113
Список литературы
- Обоснование использования Na-КМЦ и ПВС в качестве пролонгаторов в составе разрабатываемых глазных капель
- Физические и физико-химические методы
- Изучение распределения частиц пролонгаторов по размерам в процессе механохимической обработки
- Результаты валидации методики определения мирамистина и димедрола в разрабатываемых глазных каплях
Введение к работе
Актуальность темы исследования. В настоящее время инфекционные
конъюнктивиты являются одной из серьезных проблем практической
офтальмологии. Больные с этой патологией составляют до 50% пациентов, обращающихся за офтальмологической помощью (Майчук, Ю.Ф., 2013).
Лечение глазных заболеваний инфекционной этиологии требует особо тщательного выбора не только лекарственного препарата, но и приемлемой лекарственной формы. Таковыми являются глазные капли – наиболее широко используемые в офтальмологической практике (Жилякова, Е.Т., 2014; Анисимов С.И., 2010; Егоров, Е.А., 2008).
Наиболее эффективными в терапии глазных инфекций являются
пролонгированные глазные лекарственные формы, использование которых
позволяет снизить количество инстилляций препарата при сохранении
терапевтического эффекта, что обеспечивается путем введения в лекарственную форму вспомогательных веществ пролонгаторов. Повысить пролонгированный эффект можно за счет предварительной механохимической обработки полимеров, которая приводит к увеличению вязкости водных растворов, что позволяет снизить концентрацию вспомогательных веществ в лекарственной форме.
Выбор антимикробного агента должен быть обусловлен широким спектром
его антимикробного действия и возможностью возникновения резистентности к
нему микроорганизмов. С этой точки зрения особого внимания заслуживает
мирамистин, оказывающий широкое бактерицидное действие вследствие
гидрофобного взаимодействия с мембранами микроорганизмов, приводящего к разрушению последних.
Кроме того, терапия бактериальных конъюнктивитов должна учитывать, что в основе клиники многих инфекционных заболеваний глаз лежит аллергическая реакция, которая может быть устранена путем использования в составе глазных капель димедрола.
В качестве объекта исследования предложен новый комбинированный состав пролонгированных глазных капель с антимикробным и противоаллергическим
средствами для лечения бактериальных конъюнктивитов.
Для оценки содержания действующих веществ в препарате, а также контроля их стабильности в лекарственной форме необходимым условием являлся подбор оптимальных методов их идентификации и количественного анализа. Однако, проблема анализа компонентов жидких вязких систем в настоящее время является одной из основных в производстве пролонгированных лекарственных форм, так как существующие методы анализа и пробоподготовки не полностью удовлетворяют потребностям современного производства.
Применительно к предложенному в данном исследовании составу сложность анализа состоит в том, что пролонгирующие компоненты, представляющие собой ВМС, способны связывать действующие компоненты лекарственной формы, тем самым препятствуя их обнаружению.
На сегодняшний день решить эту проблему могут хроматографические методы анализа, в частности ВЭЖХ, положительно зарекомендовавшая себя как современный метод для анализа лекарственных форм сложного состава (Медведев, Ю.В., 2013).
При анализе вязких систем методом ВЭЖХ, необходим оптимальный выбор подвижной фазы, колонки и условий хроматографирования с учетом физико-химических свойств компонентов, входящих в состав лекарственной формы. Особую сложность представляет разработка методики ВЭЖХ в вязких водных системах на основе ВМС, пробоподготовка при их совместном присутствии.
В этой связи, разработка методики анализа мирамистина и димедрола в вязкой
среде предложенного состава антимикробных пролонгированных глазных капель, их
последующая валидационная оценка и доказательство приемлемости для
стандартизации позволят осуществить надлежащий контроль качества
разрабатываемой лекарственной формы антимикробного действия.
Таким образом, разработка состава, технологии и норм качества комбинированных пролонгированных глазных капель антимикробного действия является актуальной.
Степень разработанности темы исследования
В настоящее время показатель пролонгированности для глазных капель не
регламентирован действующей НД РФ. На фармацевтическом рынке России отсутствуют комбинированные глазные капли, содержащие в себе эффективный антимикробный агент в сочетании с противоаллергическим компонентом и пролонгатором. Определенную научную ценность представляет применение механохимических приемов к обработке известных пролонгаторов с целью оптимизации их физико-химических свойств. Существующие методы анализа мирамистина не позволяют качественно и количественно определить его содержание в предлагаемой жидкой лекарственной форме с вязкой дисперсионной средой, что определило важность разработки необходимых валидируемых методик анализа компонентов состава предлагаемых глазных капель.
Цель и задачи исследования
Цель исследования – разработка состава, технологии и норм качества комбинированных глазных капель пролонгированного действия для лечения бактериальных конъюнктивитов.
Задачи исследования:
1. Изучение по литературным данным предметных вопросов терапии
инфекционных конъюнктивитов бактериальной этиологии и ее лекарственного
обеспечения.
2. Разработка технологии механообработки пролонгаторов и определение их
физико-химических и технологических характеристик.
3. Разработка состава и технологии глазных капель с мирамистином и
димедролом с учетом особенностей физико-химических характеристик компонентов.
-
Разработка методики идентификации и количественного анализа мирамистина и димедрола в разрабатываемых глазных каплях.
-
Проведение валидации разработанных методик качественного и количественного определения мирамистина и димедрола в разрабатываемых пролонгированных глазных каплях.
6. Изучение сроков годности пролонгированных глазных капель
антимикробного действия.
7. Разработка норм качества пролонгированных глазных капель с
мирамистином и димедролом.
-
Изучение антимикробной активности разрабатываемых глазных капель.
-
Разработка НД на препарат.
Научная новизна исследования
Впервые предложены состав и технология комбинированных пролонгированных глазных капель, содержащих эффективные антимикробный и противоаллергический агенты, комбинированный пролонгатор, полученный с использованием твердофазной механохимической обработки. Разработана и валидирована методика анализа действующих компонентов комбинированных глазных капель.
Теоретическая и практическая значимость работы
Изучено современное состояние вопросов терапии инфекционных
конъюнктивитов бактериальной этиологии, рассмотрены достоинства и недостатки
существующих глазных капель антимикробного действия, обоснована разработка
комбинированного состава глазных капель пролонгированного действия,
включающего эффективный антимикробный и противоаллергический компоненты.
Полученные экспериментальные данные изменения физико-химических характеристик различных пролонгаторов в процессе их механохимической обработки явились определяющими в выборе пролонгатора в составе разрабатываемых глазных капель антимикробного действия.
По результатам исследования получены Свидетельства о регистрации в качестве ноу-хау результатов интеллектуальной деятельности:
1. Технология механохимической обработки высокомолекулярных соединений
производных целлюлозы : свидетельство о регистрации в качестве ноу-хау результата
интеллектуальной деятельности №134 / НИУ «БелГУ»; Е.Т. Жилякова, О.О. Новиков,
М.Ю. Новикова, Н.Н. Попов, Д.В. Придачина. – заявл. 07.10.2013; зарег. 17.10.2013.
2. Композитные глазные капли антимикробного действия : свидетельство о
регистрации в качестве ноу-хау результата интеллектуальной деятельности №159 /
НИУ «БелГУ»; Е.Т. Жилякова, Н.Н. Попов, О.О. Новиков, М.Ю. Новикова, А.В.
Баскакова. – заявл. 12.11.2013; зарег. 14.11.2013.
3. Метод анализа мирамистина в пролонгированной лекарственной форме :
свидетельство о регистрации в качестве ноу-хау результата интеллектуальной деятельности №160 / НИУ «БелГУ»; Е.Т. Жилякова, Н.Н. Попов, О.О. Новиков, М.Ю. Новикова, А.А. Зинченко. – заявл. 12.11.2013; зарег. 14.11.2013.
4. Технология механохимической обработки поливинилового спирта : свидетельство о регистрации в качестве ноу-хау результата интеллектуальной деятельности №161 / НИУ «БелГУ»; Е.Т. Жилякова, Н.Н. Попов, О.О. Новиков, М.Ю. Новикова, Е.Ю. Тимошенко, О.А. Кузьмичева. – заявл. 12.11.2013; зарег. 14.11.2013.
На основании проведенных экспериментов разработан проект ФСП и лабораторного регламента на антимикробные глазные капли. Технология апробирована в промышленных условиях на предприятии ООО «Гротекс», г. Санкт-Петербург (акт технологической апробации от 11.02.2015 г.)
Полученные в диссертационной работе новые научные данные
используются в учебном процессе кафедры фармацевтической технологии и
кафедры фармацевтической химии и фармакогнозии ФГАОУ ВПО НИУ «БелГУ».
Также полученные научные данные включены в учебный процесс и НИР кафедры
технологии получения лекарств и кафедры фармацевтической и
токсикологической химии Пятигорского медико-фармацевтического института – филиала ГБОУ ВПО ВолгГМУ Минздрава России.
Методология и методы исследования
Методология разработки антимикробных глазных капель пролонгированного
действия представляет собой научно-обоснованную концепцию, состоящую из
информационного, технологического и аналитического блоков. Дизайн
исследования в полной мере отражает структуру и последовательность выполнения этапов диссертационной работы. В ходе выполнения исследований использовался комплекс методов фармацевтической технологии, механохимии, фармацевтического анализа, микробиологии и статистики.
Положения, выносимые на защиту:
1. Результаты изучения изменения физико-химических и технологических
свойств пролонгаторов в результате их механохимической обработки.
2. Результаты серии экспериментов по выбору оптимального состава
пролонгированных глазных капель антимикробного действия с мирамистином и димедролом.
-
Результаты исследований по разработке методики идентификации и количественного определения действующих компонентов пролонгированных глазных капель с мирамистином и димедролом.
-
Результаты изучения сроков годности и разработки норм качества пролонгированных глазных капель антимикробного действия с мирамистином и димедролом.
5. Результаты изучения антимикробной активности разработанных
пролонгированных глазных капель с мирамистином и димедролом.
Степень достоверности и апробация результатов исследования
Основные результаты научных исследований обсуждались на конференциях: 76-я всероссийская научная конференция студентов и молодых ученых с международным участием «Молодежная наука и современность» (19-20 апреля 2011 г., КГМУ, Курск); всеукраинская научно-практическая конференция молодых ученых и студентов с международным участием «Современные аспекты Медицины и фармации – 2011 г» (12-13 мая 2011 г., ЗГМУ, Запорожье); международная научно-практическая конференция «Фитодизайн в современных условиях» (14-17 июня 2010 г., БелГУ, г.Белгород); всероссийская конференция с элементами научной школы для молодежи «Нано- и супрамолекулярная химия в сорбционных и ионообменных процессах» (14-17 сентября 2010 г., БелГУ, г. Белгород); ІІІ (65) Международный научно-практический конгресс студентов и молодых ученых «Актуальные проблемы современной медицины» (13-14 октября 2011 г., НМУ им. О.О. Богомольца, г. Киев); всероссийская научно-практическая конференция с международным участием «Традиции и инновации фармацевтической науки и практики», посвященная 45-летию фармацевтического факультета КГМУ (27 октября 2011 г., КГМУ, г. Курск); 5-ая Юбилейная Международная Научно-практическая конференция «Геронтологические чтения – 2012» (6-10 февраля 2012 г., НИУ «БелГУ», г. Белгород); всеукраинская научно-практическая конференция студентов и молодых ученых «Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов» (25 апреля 2012 г., НФаУ, г. Харьков); региональная
конференция по программе «УМНИК» (16-17 мая 2012 г., БГТУ им. В.Г. Шухова, г.
Белгород); региональный отраслевой форум «Медицинская биотехнология.
Биофармацевтическая промышленность» (29 ноября 2012 г., НИУ «БелГУ», г.
Белгород); международная III научная конференция «Фармацевтический кластер как
интеграция науки, образовании и производства» (12-17 апреля 2013 г., НИУ «БелГУ», г.
Белгород); первая научно-практическая конференция аспирантов и молодых ученых
«Молодые ученые и фармация ХХI века» (24 февраля 2013 г., ВИЛАР, г. Москва); 68-я
конференция «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической
продукции» (22-26 января 2013 г., Пятигорский медико-фармацевтический институт –
филиал ГБОУ ВПО ВолгГМУ Минздрава России, г. Пятигорск, Россия); региональная
научно-практическая конференция молодых исследователей «Перспективные
инновационные разработки молодых исследователей Белгородской области – развитию региона», аккредитованная в качестве итогового мероприятия по Программе «УМНИК» (19-20 декабря 2013 г., БГТУ им. В.Г. Шухова, г. Белгород); 4-я международная научно-практическая конференция «Фармацевтический кластер как интеграция науки, образования и производства» (9-16 апреля 2014 г., НИУ «БелГУ, г. Белгород).
Научно-исследовательская работа в 2012 году получила финансовую поддержку в рамках программы «УМНИК»; в этом же году НИР стала призером конкурса студенческих научных работ по теме: «Новое в фармакотерапии основных заболеваний человека», проводившегося в рамках XIX Российского национального конгресса «Человек и лекарство». В 2013 году НИР была отмечена победой во всероссийском конкурсе инновационных проектов «Start Up Поиск».
Публикации по работе
По материалам диссертации опубликовано 30 научных работ, из них 8 – в изданиях перечня ВАК.
Личный вклад автора
Принимал участие в выборе объектов исследования, постановке целей и задач, проведении экспериментальной части работы. Проведен научно-информационный и патентный поиск, осуществлен сбор и анализ литературных данных, а также выполнен комплекс технологических и аналитических исследований, проведена
статистическая обработка полученных результатов, обобщены экспериментальные данные. Лично автором выполнено более 85% исследований.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 128 страницах машинописного текста, содержит 19 таблиц, 82 рисунка, состоит из введения, 4 глав, заключения, списка литературы, включающего 131 источник, из них 36 зарубежных, приложения.
Обоснование использования Na-КМЦ и ПВС в качестве пролонгаторов в составе разрабатываемых глазных капель
Кроме того, в последнее время наблюдается увеличение количества резистентных к антибиотикам возбудителей глазных инфекций [101, 103].
Некоторыми исследователями отмечено, что широкое применение гентамицина в лечении язвы роговицы способствовало возникновению около 64% устойчивых к нему штаммов. В свою очередь исследователи отмечают возрастание резистентности к ампициллину – до 80%, к цефалексину – 86%, к тетрациклину – 21%. Около 50% стафиллококков резистентны к сульфаниламидам [14, 23, 33].
Увеличение количества резистентных штаммов возбудителей бактериальных инфекций вызывает необходимость использования новых веществ широкого спектра антимикробного действия. Однако, немаловажным остается тот факт, что антибиотики способствуют усилению аллергических реакций на лекарственные вещества [6, 29, 100].
Что касается препаратов пиклоксидина и декаметоксина, к которым не возникает резистентность микроорганизмов, то они обладают довольно узким спекром противомикробной активности, кроме того, пиклоксидин способствует снижению концентрации внимания и быстрых психомоторных реакций [12].
В настоящее время в офтальмологической практике лечения инфекционных конъюнктивитов широко применяется группа фторхинолонов [78, 96, 128].
Однако, как и другим антибиотикам, первоначально низкая резистентность к ним постепенно возрастает при широком применении [129, 113]. К примеру, по некоторым данным, резистентность микроорганизмов к ципрофлоксацину может достигать 52,6% [71, 94].
Особо следует отметить, что Фармакологическим комитетом РФ к применению у детей раннего возраста разрешены не все фторхинолоны, так как наряду с их высокой эффективностью возможно возникновение токсико-аллергических реакций [5, 73]. Среди офтальмологических лекарственных средств можно выделить препарат «Окомистин» на основе мирамистина, присутствующий на отечественном фармацевтическом рынке [11, 34, 95].
По результатам проведенных клинических исследований этого препарата было показано отсутствие побочных эффектов, снижение выраженности симптомов воспаления [76]. Полное исчезновение симптомов воспаления наблюдалось к 3-4 дню использования глазных капель «Окомистин», при использовании традиционной терапии воспалительных заболеваний глаз симптомы сохраняются до 14 дней. Установлено, что использование мирамистина в терапии воспалительных заболеваний глаз приводит к 100% восстановлению трудоспособности больных [35, 72].
Однако, анализируя состав глазных капель «Окомистин», видно, что он не является пролонгированным, а, следовательно, быстро вымывается из конъюнктивальной полости и требует частой инстилляции капель при использовании – до 6 раз в сутки, что крайне неудобно для больного.
Таким образом, можно сделать вывод о том, что антимикробный агент офтальмологического препарата должен обладать широким спектром действия и к нему не должно возникать резистентности микроорганизмов-возбудителей инфекции [120, 123]. С этой точки зрения перспективно использование мирамистина, обладающего широким спектром антисептического действия.
Ввиду того, что в основе бактериального конъюнктивита лежит аллергическая реакция и лечение зачастую сопровождается назначением дополнительных противоаллергических препаратов [86], то в состав разрабатываемых глазных капель для устранения аллергических проявлений заболевания перспективно включение димедрола, обладающего выраженным противоаллергическим действием [106].
Крайне важно, чтобы препарат находился в конъюнктиве достаточно продолжительное время и мог оказывать необходимый терапевтический эффект, так как обильное слезотечение способствует быстрому вымыванию лекарственных веществ и тем самым снижает результативность лечения [114]. У пролонгированных лекарственных средств увеличена продолжительность действия [7, 109, 112, 116].
Существует два основных направления пролонгирования глазных лекарственных форм. К первому относится использование систем, которые равномерно высвобождают лекарственные вещества (вставки, имплантанты и др.) [107, 118, 119, 124].
Вторым направлением является использование пролонгаторов, которые увеличивают время нахождения лекарственного вещества в конъюнктивальной полости [125]. Так, широкое распространение в технологии офтальмологических лекарственных форм в качестве пролонгаторов получили различные синтетические и природные высокомолекулярные соединения (натрий карбоксиметилцеллюлоза, поливиниловый спирт, гидроксиэтилцеллюлоза, поливинилпирролидон и др.) [4, 68, 130]. Главными критериями, допускающими применение полимера в офтальмологии, являются отсутствие способности вызывать аллергические реакции, низкая токсичность, фармакологическая индифферентность, а также исключение физико-химических взаимодействий между действующими и вспомогательными веществами лекарственной формы [127]. Использование в составе препарата ВМС различной концентрации позволяет регулировать время пролонгированного действия, уменьшить количество инстилляций глазных капель [31, 60].
Следует отметить, что ГФ СССР XI издания не регламентирует такой показатель качества глазных капель как пролонгированность действия [19].
Однако, к примеру, Европейской Фармакопеей пролонгированность является одним из требований к глазным каплям [28].
Один из показателей пролонгированного действия глазных капель – их вязкость [83]. На сегодняшний день вязкость всех глазных капель, кроме препаратов искусственной слезы находится в пределах 1 мПас. Из литературных источников известно, что некоторые исследователи рекомендуют значение показателя вязкости глазных капель в диапазоне 15-30 мПас [87].
Физические и физико-химические методы
По данным рисунка 3.6 частицы неизмельченного ПВС неправильной формы, с неровными краями размером около 100 мкм. Как показано на рисунке 3.7, после 15 мин обработки в мельнице МЛ-1 появляются раздробленные частицы, которые частично агломерируются, размер частиц в среднем 8-22 мкм. Из рисунка 3.8 видно, что размер частиц ПВС после 30 мин обработки находится в пределах 10-20 мкм, частицы также агломерируются. По данным рисунка 3.9 частицы ПВС после 45 мин обработки уменьшаются, количество агломератов возрастает, размер частиц 8-20 мкм, количество более мелких частиц увеличивается. Таким образом, обработка ПВС в мельнице МЛ-1 способствует агломерированию частиц полимера, уменьшению размеров частиц и увеличению количества более мелких частиц размером около 8 мкм с увеличением времени измельчения.
Из рисунка 3.10 видно, что после измельчения в течение 15 мин в мельнице Retsch RS 200 происходит разрушение частиц ПВС, размер частиц несколько уменьшается по сравнению с неизмельченным полимером и находится в пределах 30-100 мкм. По данным рисунка 3.11 происходит разрушение значительной части полимера, частицы агломерируются, размер их находится в диапазоне 30-100 мкм. Появляются вытянутые агломераты в виде веретенообразных палочек, которые появляются в процессе трения дисков измельчительного аппарата. Как показано на рисунке 3.12, после 45 мин обработки частицы в виде палочек утончаются, размер частиц уменьшается и составляет 20-100 мкм.
Таким образом, обработка ПВС в мельницах различного типа способствует незначительному уменьшению размеров частиц со 100 мкм до 8-20 мкм в МЛ-1 и 20-100 мкм в Retsch RS 200. Измельчение в мельнице Retsch RS 200 способствует возникновению веретенообразных агломератов полимера.
По данным рисунков 3.13-3.17 видно, что совместное измельчение Na-КМЦ и ПВС в соотношении 1:1 способствует уменьшению размеров частиц полимеров, разрушению глобулярной структуры Na-КМЦ, образованию агломератов. В режимах 5 и 15 мин обработки в мельнице МЛ-1 размер частиц полимеров находится в пределах 10-20 мкм, встречаются остатки глобулярной структуры Na-КМЦ. После 30 и 45 мин обработки увеличивается количество более мелких частиц, появляются агломераты, размер частиц около 5-20 мкм. Механообработка в режиме 60 мин способствует увеличению количества агломератов, можно наблюдать, что большинство частиц полимера деформировано, размер частиц в пределах 5-15 мкм. На рисунках 3.18-3.22 представлены микрофотографии смеси Na-КМЦ и ПВС в соотношении 1:2 после обработки в различных временных режимах в мельнице МЛ-1.
Как видно из рисунков 3.18-3.22, после измельчения смеси полимеров в соотношении 1:2 в течение 5-15 мин в мельнице МЛ-1 размер частиц находится в пределах 8-22 мкм, практически полностью разрушается глобулярная структура Na-КМЦ.
В свою очередь в режимах 30-45-60 мин происходит уменьшение размеров частиц полимера, образование агломератов, размер частиц находится в пределах 7-30 мкм.
На рисунках 3.23-3.27 представлены микрофотографии смеси Na-КМЦ и ПВС в соотношении 1:3 после обработки в различных временных режимах в мельнице МЛ-1. Видно, что механообработка смеси Na-КМЦ и ПВС в соотношении 1:3 в режимах 5-15 мин способствует появлению агломератов, размер частиц 8-20 мкм. После измельчения в режимах 30-45 мин количество агломератов уменьшается, увеличивается количество более мелких частиц размером 5-25 мкм. В свою очередь в режиме 60 мин обработки количество агломератов невелико, преобладают отдельные частицы размером около 10-20 мкм.
Из рисунков 3.28-3.32 видно, что измельчение Na-КМЦ и ПВС в соотношении 2:3 во всех режимах не приводит к полному разрушению глобулярной структуры Na-КМЦ. Размер частиц с увеличением времени практически не изменяется и находится в пределах 5-20 мкм. Увеличение более мелкой фракции порошка полимера происходит пропорционально в режимах 30-45-60 мин, агломерирование частиц несущественно.
На рисунках 3.33-3.37 представлены микрофотографии смеси Na-КМЦ и ПВС в соотношении 2:5 после обработки в различных временных режимах в мельнице МЛ-1.
Из этих микрофотографий видно, что смесь Na-КМЦ и ПВС в соотношении 2:5, измельченная в мельнице МЛ-1 содержит большое количество агломерированных частиц, количество обломков глобул Na-КМЦ незначительно. В режимах 5 и 15 мин размер частиц 5-15 мкм, значительно количество агломератов.
В режимах 30-45 мин количество агломератов увеличивается, увеличивается также количество более мелких частиц, размер частиц в среднем 7-30 мкм. В режиме 60 мин практически все частицы полимера агломерированы, размер частиц около 7-20 мкм.
Таким образом, анализируя микрофотографии измельченной смеси Na-КМЦ и ПВС в различных временных режимах и соотношениях, можно сделать вывод о том, что измельчение смеси полимера приводит к увеличению количества частиц полимера с меньшим размером, образованию агломератов, разрушению глобулярной структуры Na-КМЦ. Средний размер частиц полимера во всех соотношениях в целом остается постоянным и находится в пределах 5-30 мкм. 3.2 Изучение распределения частиц пролонгаторов по размерам в процессе механохимической обработки
На рисунках 3.38-3.40 представлены гистограммы распределения по размерам частиц Na-КМЦ в режимах 30, 45 и 60 минут механообработки в мельнице МЛ-1.
Интегральная кривая и гистограмма: интегральная кривая в координатах Q3(x)=f(m) (левая шкала) - каждая точка на кривой, сколько % образца имеет размер частиц меньше либо равно данного. Гистограмма в координатах q3(x)=f(m) (правая шкала) - количество образца с данным размером частиц.
По данным рисунка 3.38, около 5% порошка Na-КМЦ после 30 мин обработки имеет размер частиц от 300 нм до 1 мкм, также около 5% порошка имеет размер частиц от 10 до 20 мкм, от 20 до 50 – около 20% и около 50% приходится на размер частиц от 50 до 200 мкм. Установлено, что средний размер частиц составляет 73,04 мкм.
Как видно из рисунка 3.39, после 45 мин обработки Na-КМЦ в МЛ-1 около 15% составляют частицы размером от 600 нм до 2 мкм, более 55% – частицы размером 2-6 мкм. Установлено, что средний размер частиц составляет 2,93 мкм.
Из рисунка 3.40 видно, что после 60 мин обработки Na-КМЦ в МЛ-1, более 80% частиц имеют размер в диапазоне 400 нм – 1 мкм. Установлено, что средний размер частиц составляет 0,64 мкм.
Таким образом, в ходе механохимической обработки Na-КМЦ с увеличением времени измельчения происходит уменьшение размеров частиц полимера. Средний размер частиц Na-КМЦ составляет 73,04 мкм в режиме 30 мин, 2,93 мкм в режиме 45 мин, 0,64 мкм в режиме 60 мин.
Изучение распределения частиц пролонгаторов по размерам в процессе механохимической обработки
Наиболее приемлемым методом определения мирамистина и димедрола в составе разработанных глазных капель антимикробного действия может быть метод ВЭЖХ.
Известно, что в молекуле мирамистина присутствуют гидрофобный и гидрофильный фрагменты [55], мирамистин является типичным катионо-активным ПАВом. Соединения с такими свойствами являются «неудобными» для определения методом ВЭЖХ, поскольку либо гидрофобный, либо гидрофильный фрагмент мирамистина взаимодействует с сорбентом колонки, что приводит к неудовлетворительным результатам при хроматографировании как на обращено-фазовых, так и на катионо-обменных колонках. Пики мирамистина на этих колонках получаются ассиметричными, наблюдается плохое разделение с другими компонентами и неудовлетворительные метрологические характеристики методики.
Существенно улучшить форму пиков мирамистина при использовании колонок с обращено-фазовыми сорбентами можно путем уменьшения содержания воды в подвижной фазе до 7-3%, т. е. фактически перейдя от обращено-фазовой хроматографии к прямо-фазной [22, 80]. Разделение пары мирамистин и димедрол было достигнуто при использовании хроматографических колонок с сорбентом, содержащим привитые бутильные группы С4, а также с типично прямо-фазным сорбентом, содержащим нитрильные группы Spherisorb CN, и подвижной фазой состава фосфатный буферный раствор рН 2,5 – ацетонитрил (10:90). Из-за специфичности операции приготовления испытуемого раствора и необходимости по возможности наиболее полно отделить анализируемую пробу от других вспомогательных компонентов препарата предпочтение было отдано второму варианту – применению сорбента с нитрильными группами.
В ходе предварительных экспериментов по определению мирамистина в препаратах, содержащих полимеры, было установлено, что в процессе пробоподготовки незначительная низкомолекулярная часть полимерных компонентов не осаждается органическим растворителем, а остается в испытуемом растворе. При этом, после получения 30-40 хроматограмм испытуемого раствора наблюдается увеличение входного давления подвижной фазы на колонке и снижение эффективности колонки.
Для устранения этого негативного явления комплект хроматографа был дополнен 6-ти портовым краном высокого давления и предколонкой, заполненной подобным сорбентом, что и основная колонка (рисунок 4.1).
Второй насос хроматографа использовали для удаления остаточных количеств водорастворимых полимерных веществ с предколонки противотоком растворителя, содержащего 95 % воды и 5 % ацетонитрила.
Принцип работы такой схемы состоял в том, что в момент введения пробы 6-ти портовый кран находился в положении «А». Все компоненты пробы попадали в предварительную колонку, при этом высокомолекулярные компоненты задерживались, а мирамистин и димедрол попадают в основную колонку. Через 2 мин после введения пробы, по программе управления хроматографом, 6-ти портовый кран переключали в положении «Б» и одновременно включали второй насос с промывочным раствором. За время получения хроматограммы водорастворимые полимерные компоненты удаляются противотоком промывочного раствора с сорбента предварительной колонки. После выхода пиков определяемых веществ и окончания регистрации хроматограммы кран переключали в положение «А» и система через 3 минуты становится готовой к введению следующей пробы.
Методика приготовления испытуемого раствора: 5,0 мл препарата помещали в мерную колбу вместимостью 25 мл, доводят объём раствора, при непрерывном перемешивании, подвижной фазой до метки и перемешивали.
Полученную смесь центрифугировали в течение 5 мин при 8000 об/мин. Прозрачный слой использовали в качестве испытуемого раствора.
Методика приготовления раствора сравнения мирамистина и димедрола. Около 20 мг (точная навеска) СО мирамистина и около 200 мг (точная навеска) СО димедрола помещали в мерную колбу вместимостью 50 мл, растворяли в 40 мл воды, доводили объём раствора водой до метки и перемешивали. 1,0 мл полученного раствора помещали в мерную колбу вместимостью 20 мл, доводили объём раствора подвижной фазой до метки и перемешивали.
По 10 мкл испытуемого раствора и раствора сравнения мирамистина и димедрола хроматографировали на жидкостном хроматографе с УФ-спектрофотометрическим детектором. При этом термостат колонок должен быть оснащен 6-ти портовым краном высокого давления, управляемым по программе работы хроматографа. Условия хроматографирования: - колонка стальная, размером 4,6 мм х 250 мм, заполненная сорбентом Spherisorb CN RP (Waters) , размер частиц 5 мкм, - предварительная колонка, размером 4,6 мм х 10 мм Spherisorb Cyano, размер частиц 5 мкм (Supelco Кат № Z227013); - подвижная фаза - фосфатный буферный раствор рН 2,5 - ацетонитрил (10:90); - скорость подвижной фазы - 1,0 мл/мин; - промывочный раствор - вода-ацетонитрил (95 : 5); - температура колонки - 40 С; - длина волны регистрации - 262 нм; - время переключения 6-ти портового крана - 2 мин. Методика определения подлинности мирамистина и димедрола в разрабатываемых глазных каплях антимикробного действия На хроматограммах испытуемого раствора времена удерживания основных пиков должны совпадать с временами удерживания пиков мирамистина и димедрола на хроматограммах сравнения мирамистина и димедрола.
Методика количественного определения мирамистина и димедрола в разрабатываемых глазных каплях антимикробного действия Содержание мирамистина или димедрола (Хi), в миллиграммах, в 1 мл препарата, рассчитывали по формуле 4.1: _ SiXmoix25xlxP _ SiXmoixP X — — (4.1) S0;X5X50X20X100 So;X200Xl00 где Si - среднее значение площадей пиков мирамистина или димедрола, рассчитанное из хроматограмм испытуемого раствора; Soi - среднее значение площадей пиков мирамистина или димедрола, рассчитанное из хроматограмм раствора сравнения мирамистина и димедрола; moi - масса навески СО мирамистина или димедрола, в миллиграммах; Р – содержание основного вещества в СО мирамистина или димедрола, в процентах. Содержание мирамистина в 1 мл препарата должно составлять от 0,085 до 0,115 мг. Содержание димедрола в 1 мл препарата должно составлять от 0,9 мг до 1,1 мг. Результаты считаются достоверными, если выполняются следующие условия: - эффективность хроматографической системы, рассчитанная по пику мирамистина, должна быть не менее 8000 теоретических тарелок; - коэффициент разделения пиков мирамистина и димедрола должен быть не менее 1,5; - относительное стандартное отклонение площадей пиков мирамистина, рассчитанное из хроматограмм испытуемого раствора и раствора сравнения мирамистина и димедрола должно быть следующим: для 2 параллельных введений – не более 0,76%; для 3-х – не более 2,01%, для 4-х – не более 2,88% и для 5-ти – не более 3,56%; - относительное стандартное отклонение площадей пиков димедрола, рассчитанное из хроматограмм испытуемого раствора и раствора сравнения мирамистина и димедрола должно быть: для 2 параллельных введений – не более 0,51%; для 3-х – не более 1.34%, для 4-х – не более 1.92% и для 5-ти – не более 2.37%.
Результаты валидации методики определения мирамистина и димедрола в разрабатываемых глазных каплях
Изучение антимикробной активность проводилось на базе бактериологической лаборатории Шебекинской центральной районной больницы, имеющей соответствующее разрешение на работу с патогенными и условно-патогенными микроорганизмами.
В качестве испытуемых микроорганизмов использовали следующие музейные тест-культуры: Staphylococcus aureus 6538 – Р, Esherichia coli М-17, Pseudomonas aeruginosa 613-60, Klebsiella pneumoniae 919, Proteus vulgaris ИХ-19 №222. Также был использован госпитальный штамм Staphylococcus epidermidis, взятый у больного бактериальным конъюнктивитом.
Предварительно с тест-культурами были приготовлены взвеси с концентрацией микробных клеток на 1 мл стерильного физиологического раствора 106. Далее проводился посев тест-культур в чашках Петри на расплавленной и охлажденной до 48-50С агаризованной среде в количестве 20 мл для создания оптимальной толщины слоя.
Питательна среда засеивалась стерильным ватным тампоном, смоченным во взвеси тест-культуры, в агаровом покрытии были сделаны лунки диаметром 6 мм. Исследуемые экспериментальные образцы помещались в лунки питательной среды. Далее чашки Петри инкубировались в течение 24 часов при температуре 37С. После чего измерялся диаметр зон задержки роста тест-культур с точностью до 0,1 мм.
Для оценки степени чувствительности микроорганизмов к исследуемым образцам были использованы следующие соотношения диаметров: менее 10 мм – слабая чувствительность, 10 мм – умеренная чувствительность, более 10 мм – высокая чувствительность.
На рисунке 4.7 представлены результаты определения антимикробной активности разработанного препарата в отношении музейного штамма St. aureus. Условные обозначения исследуемых растворов: 1, 5 – раствор мирамистина субстанции 0,01%; 2, 6 – раствор мирамистина ЗАО «Инфамед» 0,01%; 3, 7 – «Окомистин»; 4 – разрабатываемые пролонгированные глазные капли серия 1; 8 – разрабатываемые пролонгированные глазные капли серия 2; 9 – разрабатываемые пролонгированные глазные капли серия 3; 10 – разрабатываемые пролонгированные глазные капли серия 4.
Как видно из рисунка 4.7, музейный штамм St. aureus проявил высокую чувствительность ко всем образцам, представленным в исследовании, диаметр зоны угнетения более 10 мм.
На рисунке 4.8 представлены исследования определения антимикробной активности разработанного препарата в отношении госпитального штамма St. epidermidis, взятого у больного с бактериальным конъюнктивитом из гнойного отделяемого конъюнктивы. Как видно из рисунка 4.8, госпитальный штамм St. epidermidis проявил высокую чувствительность ко всем образцам, представленным в исследовании, диаметр зоны угнетения более 10 мм.
Также подтверждена антимикробная активность для штаммов E. сoli, P. aeruginosa, Pr. vulgaris, Kl. pneumoniae. Эти патогены проявили умеренную чувствительность к изучаемым образцам.
Таким образом, анализируя полученные данные, можно сделать вывод о том, что комбинированный состав разработанных глазных капель показал высокую антимикробную активность, что подтверждает выбор оптимального состава и технологии разработанного препарата для лечения бактериальных конъюнктивитов.
Для установления сроков годности разрабатываемых глазных капель антимикробного действия была произведена наработка 4 серий препарата и заложена на хранение.
В течение 24 месяцев проводился контроль глазных капель по показателям стерильность, наличие механических включений, прозрачность, цветность, рН, вязкость. Результаты изучения стабильности глазных капель представлены в таблице 4.10. Установлено, что на протяжении всего срока хранения показатели качества пролонгированных глазных капель антимикробного действия остаются стабильными.