Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Достижения и перспективы в области создания лекарственных средств растительного происхождения антимикробного и противовоспалительного действия (обзор литературы) 10
1.1. Биологически активные вещества растительного происхождения, обладающие противовоспалительной и антимикробной активностью 10
1.2. Таблетки для рассасывания – как средство для лечения воспалительных заболеваний полости рта 13
1.3. Способы перевода жидких субстанций в сыпучее состояние 18
1.4. Вспомогательные вещества для прямого прессования 23
1.5. Методы анализа флавоноидов в препаратах растительного происхождения 26
Выводы к главе 1 28
Глава 2. Объекты и методы исследований 29
2.1. Объекты исследований 29
2.2. Методы исследований 32
2.2.1. Физические методы исследований 32
2.2.2. Физико-химические методы исследований 35
2.2.3. Биологические методы исследований 42
2.2.4. Математические методы 45
Глава 3. Разработка состава и технологии таблеток для рассасывания с жидким растительным экстрактом 48
3.1. Обоснование выбора объекта исследования 48
3.2. Перевод жидкого растительного экстракта в сыпучее состояние 51
3.3. Разработка состава и технологии таблеток для рассасывания 68
Выводы к 3 главе 77
Глава 4. Стандартизация, специфическая активность и безопасность таблеток «Ротокан-Табс» 78
4.1. Совершенствование методики количественного определения суммы флавоноидов жидкого экстракта 78
4.2. Стандартизация и сроки хранения разработанной лекарственной формы 82
4.3. Изучение специфической активности «Ротокан-Табс» in vitro и безопасности in vivo 88
Выводы к 4 главе 92
Общие выводы 93
Список сокращений и условных обозначений 94
Список литературы 97
- Таблетки для рассасывания – как средство для лечения воспалительных заболеваний полости рта
- Перевод жидкого растительного экстракта в сыпучее состояние
- Совершенствование методики количественного определения суммы флавоноидов жидкого экстракта
- Изучение специфической активности «Ротокан-Табс» in vitro и безопасности in vivo
Таблетки для рассасывания – как средство для лечения воспалительных заболеваний полости рта
Лекарственная форма «Таблетки для рассасывания» впервые появляется в ГФ РФ XIII издания (ОФС.1.4.1.0015.15 Таблетки), по ГФ РФ XIV изд. характеризуется как таблетки, помещаемые в полость рта, для последующего рассасывания обычно для получения местного действия, состав которых обеспечивает медленное высвобождение действующих веществ [11]. Классификация таблеток для применения в полости рта по ГФ РФ XIV представлена на Рисунке 2.
Государственные фармакопеи Республики Беларусь [45] и Республики Казахстан [46] выделяют только таблетки для применения в полости рта без дальнейшего дифференцирования.
Британская фармакопея (2009 г.) [175] выделяет «tablets for use in the mouth» - «таблетки для применения во рту/в полости рта», которые должны отвечать требованиям «Oromucosal preparations» (Ph Eur monograph 1807). Однако в самой статье выделяет только «Sublingual tablets and buccal tablets» - «сублингвальные и буккальные таблетки». Данная классификация сохраняется в XII издании Британской фармакопеи [176], в Европейских фармакопеях VI-VIII изд. [100, 101, 102], а также в Американской фармакопее (USP XXXVIII) в разделах «pharmaceutical dosage forms» и «oral drug products» [178].
Таблетки для применения в полости рта
Японская фармакопея XVII изд. выделяет «Tablets for Oro-mucosal Application» - «таблетки для применения на слизистой полости рта» [124].
Китайская (2005) [152] и Индийская фармакопеи (2010) [161] не содержат информации о буккальных и лингвальных таблетках.
Pabari R. M с соавт. изучая эффекты дезинтеграции таблеток во рту отметили, что на распадаемость твёрдой лекарственной формы большее влияние оказывает время смачиваемости, нежели её пористость [146].
Из представленных материалов следует, что таблетки для рассасывания относятся к буккальным таблеткам, которые должны отвечать нормативным фармацевтико-технологическим требованиям [160, 159, 18].
Проведенный Рязановой Т. К. с соавт. анализ фармацевтического рынка России [50] показал, что для лечения воспалительных заболеваний полости рта наиболее распространённой лекарственной формой являются таблетки для рассасывания (Рисунок 3)
Мукеш Гоэль с соавт. предложили технологию получения таблеток для применения в полости рта с нимесулидом [108]. Jitinder Singh Wilkhu с соавт. разработали везикулы, включающие антигены к вирусам гриппа. Используя комбинацию трегалозы, декстрана и маннита получили таблетки для применения в полости рта, которые при регидрации высвобождали бислойные везикулы, содержащие антиген [185].
В составы экспериментальных таблеток для рассасывания предложены экстракты: эвкалипта прутовидного [17, 31], тимьяна ползучего [9], босвеллии [12, 53].
Перечень лекарственных препаратов в форме таблеток для рассасывания с растительными субстанциями, включенные в Государственный реестр лекарственных средств, представлены в Таблице 1 [48]. Анализ лекарственных препаратов из Государственного реестра лекарственных средств Российской Федерации [48] показывает, что наиболее часто встречаются таблетки для рассасывания, обладающие антимикробным действием (40,9 %) (Рисунок 4), при этом только 20,0 % из них содержат субстанции растительного происхождения [32].
Данные, представленные в Таблице 1, свидетельствуют, что ассортимент таблеток для рассасывания с растительными активными компонентами на российском фармацевтическом рынке незначителен, что является обоснованием необходимости разработки новых лекарственных растительных препаратов в форме таблеток для рассасывания, оказывающих противовоспалительное и антимикробное действие.
Однако, следует учитывать, что многие лекарственные растительные препараты, предназначенные для использования в полости рта требуют коррекции вкуса [97], особое внимание вкусовым качествам лекарственных препаратов следует уделять в педиатрической и гериатрической практиках [135, 141, 140]. Анализ ассортимента вспомогательных веществ из группы корригентов, используемых в таблетках для рассасывания показывает преобладание корригентов вкуса [48] (Рисунок 5).
Среди корригентов вкуса, применяемых в таблетках для рассасывания, наиболее часто используют аспартам (Тантум Верде, Шалфей, Нимулид, КальцийОстеон, Рисполепт Квиклет, Зофран, Блогир-3, Эриус, Мотилиум ЭКСПРЕСС, Ломилан Соло, Эхинацея) [48].
Коррекция вкусовых качеств таблеток осуществляется разными способами, среди которых использование структурообразующих вспомогательных веществ (далее - ВВ) – маннит, желатин, крахмал, камеди [170], введением эфирных масел (например, масло мяты входит в состав Доритрицина (комбинированное антисептическое средство), Гексорала табс классик (антисептическое средство), Рисполепта (антипсихотическое средство), Мотилака (противорвотное средство – дофаминовых рецепторов блокатор центральный) и др.) [48]. При этом, для самого эфирного масла мяты отмечают бактерицидное действие в отношении стафилококка [43], грамотрицальных бактерий, а также синергизм с аминогликозидами и -лактамными антибиотиками [52].
Многие препараты содержат вещества мятного вкуса: левоментол включен в состав Септолете тотал (антисептическое средство + НПВС), а также ТераФлю ЛАР Ментол (антисептическое средство + местноанестезирующее средство); ментол в - Вакцину чумную живую; рацементол в Тантум Верде (нестероидное противовоспалительное средство) [48]. При этом отмечают, что российский потребитель предпочитает вкусы лимона и апельсина [27], эфирное масло последнего используют только в составе Гексорал табс классик (антисептическое средство) [48].
Таким образом, составы таблеток для рассасывания включают не только активные фармацевтические субстанции, но и вспомогательные вещества, обеспечивающие получение пацентоориентированной лекарственной формы, соответствующей требованиям нормативной документации.
Перевод жидкого растительного экстракта в сыпучее состояние
Учитывая, что в ходе дальнейших исследований экстракт будет включен в состав твёрдой лекарственной формы – таблетки, изучено влияние сушки на его свойства.
Влияние температурного режима сушки на свойства экстракта
Сушку осуществляли при нормальных условиях ((20±5) С), и в вакуум-сушильном шкафу при (50±1) С, (80±1) С и (105±1) С до постоянной массы.
При высушивании при (20±5) С, (50±1) С и (80±1) С жидкий экстракт превращался в клейкую массу с глянцевой пленкой на поверхности, не обладающая необходимыми технологическими свойствами. Режим сушки при (105±1) С позволяет получать сухую массу, однако при её измельчении, за счёт высокой гигроскопичности в течение 1 – 2 минут порошок превращался, как и остальные образцы, в клейкую массу.
В лекарственном растительном сырье (цветки ромашки аптечной, цветки ноготков лекарственных, трава тысячелистника обыкновенного), которое используют для получения экстракта, содержится эфирные масла, которые легко растворимы в спирте этиловом с концентрацией выше 90 %. Экстрагентом в производстве экстракта является спирт этиловый 40 %, который может извлечь минорные количествах эфирных масел. При температурном воздействии на экстракт при его сушке летучие компоненты эфирных масел могут быть утеряны.
Методом ГЖХ установили, что в исходном экстракте имеются следующие терпены в минорных количествах: цинеол, - и -туйон, камфора, борнеол и -терпинеол, которые практически полностью улетучиваются при 80 С и выше (Таблица 6).
Полученные результаты свидетельствуют о нецелесообразности использования такого способа перевода жидкого экстракта в сыпучую массу.
В связи с чем, использован другой подход перевода экстракта в сыпучую массу – адсорбция.
Адсорбция экстракта на сорбентах различной природы
Адсорбция экстракта на сорбционно-активные вещества является перспективным способом получения сыпучего материала.
Для выбранных сорбционно-активных вспомогательных веществ и микрочастиц полученных ex tempore определяли сорбционную ёмкость в отношении модельных сорбтивов (метиленовый синий – далее МС, метиленовый красный – далее МК, метиленовый оранжевый – далее МО), имеющих характерный спектр поглощения (Рисунок 10) и близкие с флавоноидами экстракта молекулярные массы (Приложение 15).
К сорбционно-активным вспомогательным веществам добавляли экстракт до появления капельной влаги и интенсивно перемешивали при нормальных условиях до влажности не более 5 %. Установили, что модифицированные оксилы в среднем способны сорбировать 3,2 - 3,5 мл/г, МКЦ 1,8 - 2,0 мл/г. Микрочастицы ватерита сорбировали 0,8 - 1,0 мл/г, при этом наблюдали изменение окраски от коричнево-оранжевой до жёлтой.
Образцы после адсорбции высушивали при нормальных условиях и измельчали до рекомендуемого Dziemidowicz K. с соавт. [97] размера частиц 200 мкм, что позволит пациентам не ощущать твёрдые, не растворимые в физиологических жидкостях частицы.
Для выбора оптимального сорбента изучили их технологические характеристики до и после адсорбции экстракта (Таблицы 8 и 9).
Полученные экспериментальные значения технологических характеристик обработали методом сферических диаграмм позволяющего оценить пригодность компонентов для прямого прессования (Рисунок 11).
Рассчитали факторы SeDeM диаграмм для адсорбентов до и после адсорбции экстракта. Учитывали, что, если значение фактора меньше 5, требуется коррекция технологических свойств для прессования порошка (Таблица 10).
С помощью сканирующей электронной микроскопии изучили морфологию частиц сорбентов и установили, что при адсорбции экстракта происходит переход полиморфной формы кальция карбоната из ватерита в кальцит (МКВМКВ-РЭ), изменяется морфология частиц aerosil 200 и 380, что отражается на их технологических характеристиках. Видимого изменения морфологии других сорбционно-активных ВВ не установлено (Рисунок 12).
Полученные данные свидетельствуют о возможности использования для прямого прессования после адсорбции экстракта только микрокристаллической целлюлозы 112, остальные сорбционно-активные ВВ требуют коррекции технологических характеристик путём добавления других ВВ.
Результаты высвобождения БАВ показали, нецелесообразность использования микрочастиц ватерита (отсутствие десорбции) и микрочастиц МКЦ, которые при десорбции образовывали тонкодисперсные неразделимые суспензии, вследствие чего, осуществить спектрофотометрический анализ не представляется возможным. На основании фармацевтико-технологического и физико-химического анализов сделали выводы о перспективах разработки твёрдой лекарственной формы с использованием следующих веществ в качестве адсорбентов экстракта: адсорбент неорганической природы – aeroperl 300 (A300); адсорбент органической природы – микрокристаллическая целлюлозы 112 (М112), в связи с чем они использованы для дальнейших исследований по разработке состава и технологии таблеток для рассасывания.
Изучили их противомикробную активность с адсорбированным экстрактом в отношении наиболее чувствительного микроорганизма S. aureus (Таблица 11).
Полученные результаты показывают, что в десорбате сохраняется антимикробная активность, свойственная жидкому экстракту в отношении S. aureus.
Результаты микробиологических исследований антимикробной активности экстракта (Таблицы 5, 11) позволили выбрать дозу БАВ, соответствующую 336 мкг суммы флавоноидов в таблетке, при которой отсутствует рост всех изучаемых микроорганизмов.
Биологически активные вещества экстракта, также, как и ЛРС, из которого он изготавливается, нормируются по сухому остатку и сумме флавоноидов по лимитированному нижнему пределу количественного содержания, вследствие чего возникает необходимость перерасчета в зависимости от фактического содержания этих показателей перед адсорбцией.
Сухой остаток экстракта может составлять, по результатам собственных исследований, от 9 до 12 % (по ФСП должен быть не менее 9%) [58], при этом прямо пропорциональной зависимости содержания сухого остатка от содержанием суммы флавоноидов не обнаружили. В связи с чем выведены формула расчёта коэффициента увеличения массы после адсорбции и высушивания (Khm, формула 12), который необходим для определения массы: адсорбент-экстракт, содержащей заданное количество суммы флавоноидов (WMAE, формула 13)
Совершенствование методики количественного определения суммы флавоноидов жидкого экстракта
Контроль качества использованных в эксперименте экстрактов осуществляли в соответствии с ФСП [58], по которой количественное определение проводится в присутствии реактива Фолина в пересчёте на сумму фенольных соединений (не менее 0,15 %). Методика включает в себя следующие этапы:
1) кислотный гидролиз образца с обратным холодильником в течение 60 мин с последующим упариванием до половины объема;
2) фильтрование и промывание до нейтральной реакции по универсальному индикатору (около 300 мл воды очищенной);
3) количественный перенос осадка в мерную колбу путём растворения в горячем спирте 96 %;
4) добавление реактива Фолина;
5) спектрофотометрическое определение суммы фенольных соединений.
Методика многоэтапная и длительная, занимает более 3 часов.
При этом, оптическая плотность исследуемого раствора, приготовленного в соответствии с методикой, находится ниже рекомендуемого предела обнаружения (Рисунок 18). Несмотря на то, что флавоноиды относятся к фенольных соединениям, данная методика не позволяет оценить их реальное содержание в экстракте, так как реактив Фолина, являющий реактивом для определения фенольных соединений, не обладает избирательностью к флавоноидам.
Более специфичным подходом для их анализа является взаимодействие с алюминия хлоридом, основанное на образовании хелатного комплекса с флавоноидами.
Для количественного контроля суммы флавоноидов разработали методику спектрофотометрического анализа в присутствии алюминия хлорида с пересчётом на СО лютеолина (Рисунок 19).
Выбор стандартного образца для пересчёта осуществили по результатам ВЭЖХ-анализа компонентов экстракта. В связи с тем, что цветки ромашки и календулы стандартизируют по сумме флавоноидов в пересчёте на рутин, а трава тысячелистника по сумме флавоноидов в пересчёте на лютеолин [11], провели скрининг по рутину, кверцетину, лютеолин-7-гликозиду и лютеолину (Рисунок 20). Анализ показал, что во всех изучаемых образцах доминирует лютеолин (Рисунок 21).
Провели валидацию разработанной методики количественного определения суммы флавоноидов в пересчёте на лютеолин в экстракте. Полученные экспериментальные данные позволяют оценить методику положительно по параметрам (Приложение 6):
Совпадение максимумов поглощения при длине волны (400±2) нм отвечает критерию специфичность.
Коэффициент корреляции между оптической плотность и концентрацией экстракта составляет 0,9987, что отвечает критерию линейность.
Процент восстановления имеет среднее значение 98,91 %, что отвечает критерию правильность (точность).
Коэффициент вариации сходимости методики составляет 1,011 %; коэффициент вариации воспроизводимости методики не превышает 2 %, что отвечает критерию внутрилабораторная прецизионность.
На основании полученных результатов разработана Спецификация на субстанцию (Приложение 1).
Для дальнейших исследований были приготовлены 3 партии таблеток для рассасывания «Ротокан-Табс», которые были использованы для их стандартизации, валидации методики количественного определения в них суммы флавоноидов, а также изучения стабильности при хранении, специфической активности и безопасности.
Изучение специфической активности «Ротокан-Табс» in vitro и безопасности in vivo
Подтверждение противовоспалительной активности таблеток получили в опытах in vitro, оценивая их влияние на скорость iNOS-реакции (Рисунок 26).
Полученные результаты показывают наличие ингибирующего влияния экстракта на скорость iNOS – реакции, что свидетельствует о сохранении в Ротокан-Табс противовоспалительной активности.
Иммуностимулирующую активность таблеток оценивали in vitro по влиянию на активность лимитирующего фермента терминальной стадии фагоцитоза – НАДФН-оксидазы (Рисунок 27).
Адаптогенную, антиоксидантную и противомикробную активность таблеток оценивали in vitro по влиянию на скорость глутатионредуктазной (ГР) и каталазной (КАТ) реакций (Рисунок 28).
Характер влияния на ГР и КАТ реакции «Ротокан-Табс» подтверждает сохранение противомикробных свойств.
При изучение противомикробной активности таблеток для рассасывания содержащих 336 мкг суммы флавоноидов установили, что они подавляли рост всех использованных музейных штаммов микроорганизмов, в то время как для таблеток плацебо активность не установлена (Таблица 20).
Для сравнения активности разработанной лекарственной формы с имеющимися готовыми лекарственными формами с аналогичным действием. провели изучение их противомикробной активности в отношении S. aureus (Таблица 21).
Таким образом, разработанная лекарственная форма «Ротокан-Табс» показала более высокую противомикробную активностью в отношении S. aureus, чем у готовых лекарственных препаратов: «Эвкалипт-М», «Шалфей» и «Анжисепт», и сопоставимую с активностью таких препаратов как: «Эхинацея» и «Стрепсилс». Изучение безопасности «Ротокан-Табс» in vivo
Результаты субхронического токсикологического исследования (Приложение 5) показали, что таблетки «Ротокан-Табс» не влияют на: динамику массы тела; гематологические показатели периферической крови; биохимические показатели сыворотки крови; показатели активности некоторых ферментов сыворотки крови, а также не оказывали кардиотоксического влияния, повреждающего действия на внутренние органы и не раздражали слизистую щеки (место введения препарата) экспериментальных животных.
Таким образом «Ротокан-Табс» является перспективным лекарственным средством для лечения воспалительных заболеваний полости рта.