Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Достижения и перспективы создания комбинированных лекарственных форм на основе фитосубстанций разнонаправленного фармакологического действия для лечения воспалительных заболеваний полости рта (обзор литературы) 12
1.1.Фитопрепараты эвкалипта (Eucalyptus) и эхинацеи (Echinacea) в терапии воспалительных заболеваний полости рта 12
1.2.Виды лекарственных форм для местного применения при воспалительных заболеваниях полости рта 19
1.2.1. Спреи 19
1.2.2. Таблетки для рассасывания 21
1.2.3. Комбинированные препараты 24
1.3. Стандартизация лекарственных средств с экстрактами эвкалипта прутовидного (эвкалимин) и эхинацеи пурпурной (эстифан) 26
Выводы к главе 1 28
Глава II. Объекты и методы исследования 29
2.1. Объекты исследования 30
2.1.1. Лекарственные субстанции 30
2.1.2. Вспомогательные вещества 30
2.2. Методы исследования 31
2.2.1. Физические методы 31
2.2.2. Физико-химические методы 34
2.2.3. Исследования специфической активности лекарственных форм в опытахшу/ го 42
2.2.4. Математические методы 46
Выводы к главе II 46
Глава III. Разработка комбинированного состава и технологии спрея с растительными экстрактами эвкалипта прутовидного и эхинацеи пурпурной . 47
3.1. Анализ современного ассортимента ЛОР - препаратов для местного применения 47
3.2. Обоснование выбора объектов исследования и вида лекарственной формы
3.2.1. Антимикробная и фунгистатическая активность фармацевтической композиции растительных экстрактов эвкалимин и эстифан 50
3.2.2. Химический состав фармацевтической композиции растительных экстрактов эвкалимин и эстифан 52
3.2.3. Обоснование использования полимеров в составе ЛФ 55
3.3. Реологические характеристики полимерных растворов 57
3.4. Получение водорастворимых форм растительных экстрактов эвкалимин и эстифан 62
3.4.1. Исследования по созданиюмицеллярного раствора с растительными экстрактами 63
3.4.2. Исследования по созданию микроэмульсии с лецитином и растительными экстрактами 67
3.5. Определение микробиологической чистоты ЛФ 70
3.6. Исследование адгезивных свойств ЛФ 73
3.7. Разработка методик определения подлинности и количественного содержания основных групп БАВ в ЛФ 76
3.8. Исследование высвобождения БАВ из ЛФ 92
3.9. Изучение специфической активности ЛФ 3.10. Характеристика спрей-флакона, как первичной упаковки для ЛФ 101
3.11. Определение стабильности спрея «Эстилин» при хранении 103
Выводы к главе III 105
Глава IV. Разработка комбинированного состава и технологии таблеток для рассасывания с растительными экстрактами эвкалипта прутовидного (эвкалимин) и эхинацеи пурпурной и (эстифан)
4.1. Технологические свойства растительных экстрактов эвкалимин и эстифан 107
4.2. Разработка состава и технологии таблеток для рассасывания 112
4.3. Разработка методик стандартизации таблеток 117
4.4. Исследование высвобождения БАВ из модельных составов таблеток (показатель «Растворение») 139
4.5. Изучение специфической активности таблеток для рассасывания в опыте invitro 140
4.6. Характеристика ЛФ - таблетки для рассасывания с растительными экстрактами эвкалипта прутовидного и эхинацеи пурпурной 149
4.7. Определение стабильности при хранении таблеток для рассасывания «Эвкафан» 151
Выводы к главе IV 154
Общие выводы 155
Заключение 157
Библиографический список
- Комбинированные препараты
- Исследования специфической активности лекарственных форм в опытахшу/ го
- Химический состав фармацевтической композиции растительных экстрактов эвкалимин и эстифан
- Исследование высвобождения БАВ из модельных составов таблеток (показатель «Растворение»)
Комбинированные препараты
В ротовой полости здорового человека сосуществует множество различных микроорганизмов. При определенных условиях (в частности, снижения местной и общей сопротивляемости организма и др.), они способны вызывать воспалительно-деструктивные заболевания полости рта и глотки [28, 37, 38, 82, 107]. Характер воспалительного процесса в ротоглотке во многом зависит от реактивности иммунной системы, факторов местной защиты, в том числе микробиоценоза слизистой ротоглотки [59, 63, 79].
Особая актуальность данной патологии обусловлена не только распространнностью, но и тем, что, несмотря на все достижения медицины, на протяжении почти столетнего периода, наблюдается увеличение заболеваемости данной патологией [25, 35, 66, 106]. Несмотря на существование резистентности у многих штаммов микроорганизмов к антибиотическим препаратам, прогнозируется их широкое использование в этой области и в будущем [7, 100, 113-115, 121, 126, 127, 129, 131, 143]. Современные антибактериальные препараты, используемые в клинической практике, не позволяют решать проблему лекарственной устойчивости. Они могут лишь ослабить е на короткое время. Известное токсическое действие антибиотиков на жизненно важные органы приводит к подавлению нормальной микрофлоры человека. А это, в свою очередь, приводит к развитию дисбактериоза. Препараты антисептического, антимикробного плана вызывают микроэкологический дисбаланс в ротовой полости, понижают местную иммунореактивность, потенцируя хроническое воспаление. Тем самым происходят изменения механизмов формирования неспецифической резистентности организма, его иммунной системы. Изменение микробиоценоза под действием антибиотиков приводит к грибковой суперинфекции [8, 24, 27]. Поэтому практическая медицина применяет комплексную терапию инфекционно-воспалительных заболеваний ЛОР-органов, которая представлена различными направлениями: -местные физиотерапевтические и лечебные процедуры [45, 48, 53, 63, 136]; -биологические бактерийные препараты на основе микроорганизмов – пробиотиков [3,33, 35, 80, 145]; -комплексные гомеопатические препараты [120]; -коррекция витаминной и минеральной недостаточности [67]; -лекарственные средства растительного происхождения и др. [21,54, 56, 69, 88].
Включение в терапию воспалительных заболеваний ЛОР-органов фитосредств связано с их низкой токсичностью и мягким терапевтическим действием, что выгодно отличает их от лекарственных средств на основе синтетических субстанций. Они легче переносятся. Развитие к ним быстрой лекарственной резистентности микроорганизмов не наблюдается [12, 16, 40, 42, 78, 90, 112, 117]. Одним из источников получения таких лекарственных средств является эвкалипт. Лекарственные средства из эвкалипта пользуются особой популярностью и среди фитопрепаратов им отдается предпочтение [123, 137]. Установлено, что в листьях эвкалипта содержится до 3% эфирного масла, в котором преобладает 1,8 цинеол (эвкалиптол) (до 80%), относящегося к моноциклическим терпенам. Брутто формула (система Хилла) - C10H18O. В числе других компонентов в эфирном масле обнаруживаются из бициклических монотерпенов - -пинен, D-миртенол, D-пинокарвон, из трициклических сесквитерпенов - глобулон и алифатические альдегиды - изовалериановый, капроновый и каприловый. Кроме эфирного масла, в листьях содержатся дубильные вещества и флавоноиды [54, 116]. Научно доказана высокая лечебная эффективность эвкалиптового масла (Oleum Eucalypti) в медицине и ветеринарии, которое часто превосходит даже такие известные средства, как пенициллин, стрептомицин, фенол. Масло эффективно при бронхитах, гриппе, скарлатине, цинге, при лечении расстройств желудка, кожных и других болезней. Широко применяется и настойка эвкалипта (Tinctura Eucalypti). Известны и препараты «Хлорофиллипт» (масляный и спиртовой экстракты листьев эвкалипта шарикового), «Галенофиллипт» (масляный и спиртовой экстракты листьев эвкалипта прутовидного), обладающих антимикробной активностью, применяющиеся в качестве средств для местного лечения заболеваний и поражений пародонта, слизистых оболочек полости рта и глотки [98, 144]. Из листьев и побегов эвкалипта прутовидного разработан способ получения оригинальной отечественной фитосубстанции эвкалимин [64, 95, 96]. Полученная таким способом субстанция, содержит очищенную сумму терпеноидных фенолоальдегидов флороглюцинового ряда (эуглобалей формулы С23Н30О5, с М.м. 454,6) и тритерпеноидов.
Исследования специфической активности лекарственных форм в опытахшу/ го
Микробиологические методы Изучение бактериостатической и фунгистатической активности в опытах in vitro Антимикробное действие выбранных объектов изучали в опытах in vitro методом двукратных серийных разведений субстанции препарата в соответствующих каждому микроорганизму жидких питательных средах при оптимальных для каждого вида микроорганизмов условиях опыта (tС, длительность), а также методом диффузии в агар (метод "агаровых пластин"). Метод двукратных серийных разведений Для изучения бактериостатической активности в качестве питательной среды использовали мясо-пептонный бульон (МПБ), а для фунгистатической активности – питательную среду Сабуро. Антибактериальный и антифунгальный эффект определяли по минимальной ингибирующей рост микроорганизмов концентрации (МИК) в мкг/мл, при которой визуально не наблюдали роста микроорганизмов [23].
В качестве тест-микроорганизмов использовали патогенные грамположительные кокки Staphylococcus aureus АТСС 6538 (209-P), грамотрицательные бактерии Escherichia coli ATCC 25922, Proteus vulgaris ATCC 6896 и Pseudomonas aeruginosa АТСС 9027, дрожжеподобные грибы Candida albicans АТСС 10231 и мицелиальные грибы Microsporum canis 3/84.При определении бактериостатической активности веществ использовали мясо-пептонный бульон (МПБ).
Фунгистатическую активность в опытах in vitro изучали методом двукратных серийных разведений препаратов в жидкой питательной среде Сабуро. Посевы инкубировали при температуре 30-320С: дрожжеподобные грибы – в течение 48 часов, мицелиальные грибы - в течение 10-14 суток. Опыты проводили в трех повторностях.
Бактериостатическую и фунгистатическую активность определяли по минимальной, подавляющей рост бактерий и грибов, концентрации препарата. Метод диффузии в агар (метод "агаровых пластин")
В качестве тест-микроорганизмов использовали патогенные грамположительные кокки Staphylococcus aureus АТСС 6538 (209-P) и дрожжеподобные грибы Candida albicans АТСС 10231.
При определении бактериостатической активности лекарственных форм использовали среду № 1 ГРМ, фунгистатической активности – агар Сабуро. Растопленный на водяной бане и охлажденный до 45С питательный агар в количестве 100 мл смешивали с 1 мл взвеси тест-микроорганизма, содержащей 108 микробных тел/мл по стандарту мутности ОСО 42-28-85-2014 (10 МЕ) и разливали в чашки Петри по 20 мл. Далее таблетки помещали на поверхность застывшего агара. Чашки Петри в течение 1 часа выдерживали при комнатной температуре для того, чтобы действующие вещества из лекарственной формы диффундировали в агар, после чего чашки инкубировали в термостате 24 часа при температуре 37С (для бактерий) и 72 часа при температуре 30-32С (для грибов). Результаты оценивали по величине зоны задержки роста микроорганизмов, определяя величину зон путем измерения расстояния в мм от края тест-образца (от края таблетки) до границы роста микроорганизмов вокруг теста.
Антимикробную активность жидкой лекарственной формы, содержащей эвкалимин и эстифан, изучали методом диффузии в агар в 2-х вариантах: 1) нанесением жидких растворов непосредственно на поверхность застывшего агара; 2) методом «лунок».
Растопленный на водяной бане и охлажденный до 45С питательный агар в количестве 100 мл смешивали с 1 мл взвеси тест-микроорганизма, содержащей 108 микробных тел/мл по стандарту мутности ОСО 42-28-85-2014 (10 МЕ) и разливали в чашки Петри по 20 мл. Исследуемые растворы наливали на поверхность застывшего агара, растирали стерильным шпателем, равномерно распределяя слой образца по поверхности агара. Для 2 варианта методики в агаре делали лунки диаметром 1,0 см с помощью металлического цилиндра из нержавеющей стали и заполняли их образцами исследуемых растворов. Чашки Петри в течение 1 часа выдерживали при комнатной температуре для того, чтобы действующие вещества из лекарственной формы диффундировали в агар, после чего чашки инкубировали в термостате 24 часа при температуре 37С (для бактерий) или 72 часа при температуре 30-32С (для грибов). Результаты оценивали по величине зоны задержки роста микроорганизмов, определяя величину зон путем измерения расстояния в мм от края лунки до границы роста микроорганизмов вокруг теста.
Благодарим зав. лабораторией микробиологических исследований ФГБНУ ВИЛАР Фатееву Т.В. за помощь и содействие при проведении исследований. Исследование противовоспалительной активности ЛФ в опытах in vitro Противовоспалительную активность изучали на 60% водно-спиртовых растворах фитоэкстрактов эвкалипта прутовидного (эвкалимин), эхинацеи пурпурной(эстифан) и их фармацевтической композиции, приготовленной в соотношении 1:1. Исследовали в концентрации 2 мг/мл, 1мг/мл и 0,2 мг/мл.
В работе использовали препарат индуцибельной NO-синтазы (iNOS), полученный из мышиных макрофагов, экспрессированных E. сoli, в буферном растворе 50 мМ HEPES («Sigma-Aldrich», США) с pH 7,4 , содержащем 1мМ ацетат магния и 10% глицерина. Скорость ферментативной реакции, катализируемую iNOS, определяли кинетическим методом по изменению оптической плотности НАДФН при 340 нм на двулучевом спектрофотометре марки «Shimadzu UV1800» (Япония) при температуре 370С [13, 14].
Ферментативную реакцию в условиях in vitro активизировали 0,15 мМ раствором НАДФН. Скорость ферментативной реакции, катализируемой iNOS, определяли до (контроль) и после (опыт) добавления в реакционную среду 20 мкл тестируемых растворов.
Химический состав фармацевтической композиции растительных экстрактов эвкалимин и эстифан
Таким образом, использование МЦ и АН в составе спрея позволяет не только повысить вязкость системы, что важно для регулирования процесса распыления, но и приводит к получению высоковязких тонких пленок.
Значение вязкости, близкое к вязкости муцинового слоя слизистых оболочек, фактор, который открывает возможности создания лекарственных препаратов с необходимой пролонгированностью [124].
Учитывая нерастворимость в воде растительных экстрактов эвкалипта прутовидного и эхинацеи пурпурной, нами проведен поиск подходов к повышению их растворимости в водной среде, что, в значительной мере, позволит повысить биологическую доступность препарата [2]. Максимальная иммобилизация БАВ на поверхности патогенных микроорганизмов может быть обеспечена молекулярной или нанодисперсной формой БАВ лекарственного средства [110].
Такая задача может быть выполнена, например, путем солюбилизации водонерастворимых растительных экстрактов в смешанных мицеллах ПАВ, что можно реализовать введением в лекарственную композицию ПАВ в концентрации выше ККМ [130, 134]. При этом водонерастворимый комплекс БАВ растительных экстрактов солюбилизируется (иммобилизуется) внутри мицеллы ПАВ.
При разработке таких систем необходимо обеспечить оптимальное содержание комплекса БАВ при сохранении седиментационной и агрегативной устойчивости системы (дисперсии).
Известно, что такими свойствами обладают мицеллярные растворы [150], которые представляют собой термодинамически (или коллоидно) устойчивые наноразмерные дисперсии ПАВ. 3.4.1. Исследования по созданию мицеллярного раствора с растительными экстрактами
Для выполнения задачи нами выбраны известные и разрешенные к использованию в фармацевтической технологии ПАВ - твин 80 (полисорбат 80, сорбитан полиоксиэтилен моноолеат) и твин 20 (полисорбат 20, сорбитан полиоксиэтилен монолаурат) [119].
Использовали смесь твинов в соотношении твин-20/твин-80 1:4, что обусловлено их химическим составом иобеспечивает содержание молекул ПАВ с насыщенным углеводородным радикалом 30-35% (масс.) и ненасыщенным углеводородным радикалом 70-65% (масс). Такое соотношение гидрофобных (углеводородных) частей молекул ПАВ определяет оптимальные условия солюбилизации (включения активных веществ в объем мицелл) и позволяет получать смешанные мицеллы ПАВ с большим объемом гидрофобного ядра для повышения солюбилизации БАВ, отличающихся сложным строением.
При проведении исследования предварительно готовили индивидуальные растворы ПАВ, их смеси и спиртовые растворы растительных экстрактов в 96% этиловом спирте. Для установления допустимого интервала изменения концентрации ПАВ в системе получены изотермы поверхностного натяжения растворов индивидуальных ПАВ, их смеси и многокомпонентного раствора на их основе с растительными экстрактами (эвкалимин и эстифан 1:1) 0,00001 0,0001 0,001 0,01 0,1 1 Нижний предел интервала будет определяться значением ККМ, верхний – солюбилизационной емкостью мицелл, необходимой для обеспечения требуемого содержания растительного экстрактов в системе.
Полученные изотермы показывают, что при переходе от растворов индивидуальных ПАВ к их смеси поверхностное натяжение водных растворов снижается во всем исследованном диапазоне концентраций. Введение смеси растительных экстрактов эвкалимин и эстифан (1:1) в раствор смеси твинов, приводит к еще большему снижению поверхностного натяжения, что свидетельствует о формировании комплексов, обладающих более высокими поверхностно-активными свойствами, чем исходные молекулы ПАВ. Переход от индивидуальных ПАВ к их смесям и системам с растительными экстрактами, приводит к изменению величины ККМ, что приводит к активному мицеллообразованию (Таблица 11).
Исследование высвобождения БАВ из модельных составов таблеток (показатель «Растворение»)
С помощью ферментных биотест-систем, разработанных в ВИЛАР на основе индуцибельной NO-синтазы и ксантиноксидазы, в условиях in vitro исследована сравнительная противовоспалительная активность растительных экстрактов эхинацеи пурпурной (эстифана) и эвкалипта прутовидного (эвкалимин), а также экспериментальной фармацевтической композиции (смеси растительных экстрактов эстифан и эвкалимин 1:1) в растворе и в таблетированной форме. Противовоспалительную активность экстрактов, оценивали по ингибирующему действию на скорость ферментативной реакции, катализируемую индуцибельной NО-синтазой и по активности ксантиноксидазы условиях in vitro. Для проведения исследования были приготовлены 60% водно-спиртовые растворы индивидуальных растительных экстрактов эстифан, эвкалимин, их смеси в соотношении 1:1, а также таблетированная форма, включающая оба компонента в том же соотношении.
Противовоспалительную активность растворов исследовали в концентрации 0,2; 1,0; и 2,0 мг/мл. Суммарная концентрация растительных экстрактов в композиции составляла 0,4; 2,0; и 4,0 мг/мл.
Скорость ферментативной реакции, катализируемой iNOS, определяли кинетическим методом при температуре 37 0С при длине волны 340 нм по изменению оптической плотности НАДФН до (контроль) и после (опыт) добавления в реакционную среду 20 мкл тестируемых растворов.
Для изучения противовоспалительной активности таблетированной формы, содержащей 0,025 г растительного экстракта эстифан и 0,025 г растительного экстракта эвкалимин, проводили экстрагирование при комнатной температуре в течение 24 часов. Для этого таблетки массой 0,703-0,706 г измельчали в яшмовой ступке и переносили в бюксы. К полученным порошкам, массой 0,3 г, добавляли по 12,5 мл буферного раствора (50 мМ HEPES рН=7.40) («экстракт №1»). «Экстракт №2» получали при добавлении к измельченным порошкам по 12,5 мл 20% этилового спирта. Приготовленные «экстракты» фильтровали через мелкопористый бумажный фильтр («синяя полоса»).
Полученные результаты показали, что раствор эстифана в концентрации 13,3 мкг/мл ингибирует скорость ферментативной iNOS- реакцииin vitroна 60% по сравнению с контролем, а в концентрации 6.67 мкг/мл – достоверно на 24%. Раствор эвкалимина в тех же концентрациях достоверно ингибирует скорость iNOS- реакции на 25% и 20%, соответственно. При снижении концентрации эстифана и эвкалимина в растворе до 1,33 мкг/мл скорость iNOS-реакции возрастала (Таблица 60). Представленные результаты эффективности ингибирующего действия эстифана и эвкалимина на iNOS-реакцию в концентрации 6,67 мкг/мл совпадают с результатами, полученными на препарате сравнения (диклофенак) и доказывают наличие противовоспалительной активности у обоих компонентов.
Установленная в экспериментах in vitro активация скорости iNOS-реакции при снижении концентрация компонентов в растворе, указывает на наличие БАВ, активирующих ферментативную реакцию, с иммуностимулирующими или противомикробными свойствами.
Результаты исследования влияния фармацевтической композиции (смеси) растительных экстрактов на скорость ферментативной iNОS-реакции представлены в таблице 61. Полученные результаты показывают ингибирующее действие исследуемой композиции на скорость ферментативной iNОS-реакции. При снижении концентрации веществ в растворе с 13,3 мкг/мл до 6,67 мкг/мл ингибирующий эффект на iNОS-реакцию возрастал с 17% до 39%. При снижении концентрации веществ в растворе до 1,33 мкг/мл ингибирование скорости iNОS-реакции составляло 32%, что отличает композицию от растворов индивидуальных веществ.
Представленные в таблице 62 результаты показывают, что БАВ, переходящие в экстракт №1 и экстракт №2 достоверно снижают скорость ферментативной iNOS–реакции на 20% и 26% (при добавлении 20 мкл в пробу) или на 26% и 17% (10 мкл), соответственно. Это свидетельствует об эффективной противовоспалительной активности фармацевтической композиции растительных экстрактов эстифан и эвкалимин (1:1), содержащейся в таблетированной форме.
Получены результаты определения противовоспалительной активности экстрактов по ингибирующему влиянию на активность ксантиноксидазы in vitro, из которых следует, что экстракт «№2» на 20% этиловом спирте содержит БАВ, которые достоверно снижают активность ксантиноксидазы на 11 %, что свидетельствуют о наличии противовоспалительного, а также противовирусного и противомикробного действия (Таблица 63).
Таким образом, с помощью биотест-систем in vitro установлена противовоспалительная активность индивидуальных растительных экстрактов эстифан, эвкалимин, их композиций (смеси) в растворе и в таблетированной форме (исследован состав №8) при соотношении веществ 1:1 в диапазоне концентраций 2,0 мг/мл – 0,2 мг/мл, причем противовоспалительный эффект фармацевтической композиции растительных экстрактов «эстифан+эвкалимин», по сравнению с индивидуальными экстрактами эстифаном и эвкалимином, определяется в более широком диапазоне концентраций.
Полученные результаты позволяют считать разработанную лекарственную форму на основе растительных экстрактов эвкалимин и эстифан в виде таблеток для рассасывания перспективной для оказания противовоспалительного действия