Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Обзор литературы 15
1.1. Основные направления разработки препаратов для рецептор-ассоциированной антиагрегационной терапии 15
1.2. Гликопротеин IIb-IIIa тромбоцитов - цель современной антитромботической терапии 27
1.2.1. Строение гликопротеина IIb-IIIa тромбоцитов и его роль в системе гемостаза 27
1.2.2. Анализ опыта применения препаратов блокаторов ГП IIb-IIIa тромбоцитов 30
Глава 2 Скрининг новых производных ксантина, триазола и имидазола, влияющих на систему гемостаза 44
2.1. Материалы и методы исследования 44
2.1.1. Разработка растворителя для малорастворимых в воде соединений 44
2.1.2. Скрининг новых соединений в отношении антиагрегационной активности 47
2.2. Оценка биологической инертности нового растворителя для малорастворимых в воде соединений 49
2.3. Результаты скрининга производных ксантина, триазола и имидазола 55
2.4. Анализ биологической активности в отношении системы гемостаза наиболее активных производных ксантина 56
Глава 3 Эффективность соединения I в условиях in vitro 58
3.1. Материалы и методы исследования 58
3.2. Оценка гемосовместимости растворов соединения I в условиях in vitro 65
3.3. Антиагрегационная активность соединения I и препаратов сравнения на крови здоровых доноров 65
3.4. Изучение способности соединения I связываться с рецепторами ГП IIb-IIIa по CD41а и СD61 интегринам 67
3.5. Влияние соединения I и препаратов сравнения на экспрессию Р-селектина 71
3.6. Влияние соединения I и препаратов сравнения на кинетику формирования фибринового сгустка и активность плазминогена 73
3.7. Эффективность соединения I и препаратов сравнения при гиперкоагуляции системы гемостаза, смоделированной в условиях ex vivo 74
3.8. Эффективность соединения I и препаратов сравнения у пациентов с состоявшимся острым тромбозом в условиях ex vivo 77
3.8.1. Анализ исходных данных . 77
3.8.2. Оценка эффективности влияния соединения I и препаратов сравнения на тромбоциты пациентов с состоявшимся острым тромбозом в условиях ex vivo 84
3.9. Оценка антиоксидантных свойств соединения I с применением модельных состояний 87
3.10. Резюме 88
Глава 4 Эффективность соединения I в условиях in vivo 89
4.1. Материалы и методы исследования 89
4.2. Результаты фармакокинетического анализа 93
4.3. Острая токсичность соединения I и препаратов сравнения 100
4.4. Изучение антиагрегационной активности соединения I и препаратов сравнения при введении интактным крысам 102
4.5. Оценка гемосовместимости соединения I 103
4.6. Влияние соединения I и препаратов сравнения на простациклин-генерирующую активность сосудистой стенки лабораторных животных 105
4.7. Оценка противовоспалительной активности соединения I 106
4.8. Изучение антитромботической активности соединения I и препаратов сравнения на модели тромбоза сонной артерии крыс, индуцированного аппликацией 50% хлорида железа (III) 107
4.9. Резюме 110
Глава 5 Эффективность соединения I при тромбозе нижней полой вены 111
5.1. Материалы и методы 111
5.2. Динамика тромбообразования и показатели системы гемостаза у крыс с тромбозом нижней полой вены 115
5.3. Оценка адекватности модели тромбоза нижней полой вены 121
5.4. Оценка эффективности соединения I и препаратов сравнения как средств профилактики тромбоза нижней полой вены 122
5.5. Оценка эффективности соединения I и препаратов сравнения, как средств лечения тромбоза нижней полой вены 128
5.6. Эффективность препаратов сравнения и соединения I как средств лечения тромбоза на 1 и 7-е сутки тромбоза нижней полой вены 130
Глава 6 Эффективность соединения I при тромбоэмболии легочной артерии 151
6.1. Материалы и методы исследования 152
6.2. Оценка валидности, адекватности и возможности экстраполяции оригинально разработанной модели тромбоэмболии легочной артерии 156
6.3. Оценка соединения I и препаратов сравнения в качестве средств тромболитической терапии при тромбоэмболии легочной артерии 162
6.4. Резюме 163
Глава 7 Эффективность соединения I в условиях экспериментального инфаркта миокарда 164
7.1. Материалы и методы 165
7.2. Течение острого инфаркта миокарда у крыс без лечения и профилактики 168
7.3. Эффективность соединения I и препаратов сравнения как средств профилактики инфаркта миокарда при необратимой ишемии 180
7.4. Эффективность соединения I и препаратов сравнения, как средств профилактики инфаркта миокарда на модели "ишемия-реперфузия" 185
7.5. Резюме 192
Заключение 194
Выводы 202
Практические рекомендации 204
Список сокращений и условных обозначений 205
Список литературы 206
- Анализ опыта применения препаратов блокаторов ГП IIb-IIIa тромбоцитов
- Анализ исходных данных
- Оценка эффективности соединения I и препаратов сравнения как средств профилактики тромбоза нижней полой вены
- Эффективность соединения I и препаратов сравнения, как средств профилактики инфаркта миокарда на модели "ишемия-реперфузия"
Введение к работе
Актуальность темы исследования. Основная цель использования антиагрегационных препаратов - снижение вероятности тромбоза после разрыва атеросклеротической бляшки, профилактика и лечение острого инфаркта миокарда, нарушения мозгового кровообращения по ишемическому типу и тромбоза стента после интервентационных кардиологических вмешательств. В связи с тем, что тромбоциты играют ключевую роль в инициации тромбообразования, ингибирование их активности представляет собой один из наиболее перспективных способов профилактики и терапии тромбозов (Подоплелова Н.А. и др., 2016). Современной тенденцией является разработка рецептор-ассоциированной антиагрегационной терапии. Активно продолжаются исследования среди блокаторов рецептора PAR-1 (Muller K.A. et al., 2011), P2Y12 (Goto S. et al., 2015), фактора фон Виллебранда (Goto S. et al., 2015) и гликопротеинов Ib (Gresele P. et al., 2012) и VI (Nieswandt B. et al., 2001; Ohlmann P. et al., 2008; Ungerer M. et al., 2013). Однако центральным рецептором, реализующим связывание тромбоцитов с фибриногеном/фибрином, является ГП IIb-IIIa, и именно его блокада должна обеспечивать наиболее эффективное ингибирование агрегации тромбоцитов и образование тромбов.
В настоящее время в качестве антиагрегационных средств, блокирующих тромбоцитарные рецепторы - ГП IIb-IIIa, в клинических условиях используются три препарата для парентерального введения (Giugliano R.P. et al., 2000). Первым, получившим одобрение FDA в 1994 году, было рекомбинантное моноклональное антитело абциксимаб (Centocor/Eli Lilly, Нидерланды) (Fratantoni J.C., 1983). Вторым - эптифибатид (Glaxo Operations UK Limited, Великобритания), был одобрен в 1998 году, в его основу легли дезинтегрин и барбурин, полученные из змеиного яда, с последовательностью Lys-Gly-Asp (KGD). Третий одобренный препарат тирофибан (Correvio, Великобритания) представляет собой непептидное соединение, которое моделируется на основе лиганд-миметического пептида RGD. Успех многоцентровых контролируемых исследований позволил внедрить блокаторы ГП IIb-IIIа в широкую клиническую практику, в первую очередь для профилактики тромботических осложнений при эндоваскулярных вмешательствах. Указанные лекарства оказались более эффективными, чем другие антитромбоцитарные препараты (аспирин, тиенопиридины) (Patrono C. et al., 2011).
Результаты ранее проведенных собственных исследований свидетельствуют о высокой вероятности связывания рецептора - ГП IIb-IIIa тромбоцита, у некоторых производных ксантина (Самородов А.В., 2012). В связи с этим разработка новых отечественных блокаторов ГП IIb-IIIа среди производных данного ряда представляется весьма перспективным направлением в профилактике и лечении тромбозов.
Степень разработанности темы. В настоящее время на разных этапах клинических и доклинических испытаний находятся препараты, блокирующие рецепторы PAR-1 (Muller K.A. et al., 2011), P2Y12 (Goto S. et al., 2015), фактора Виллебранда (Goto S. et al., 2015) и гликопротеинов Ib (Gresele P. et al., 2012) и VI (Ungerer M. et al., 2013). Однако и гликопротеин IIb-IIIa (интегрин IIb3, CD41/CD61) по-прежнему остается перспективной мишенью антитромбоцитарной терапии (Giugliano R.P. et al., 2000) по причине достаточного клинического опыта применения препаратов данной группы у разных категорий пациентов.
В ФГБОУ ВО "Башкирский государственный медицинский университет" Минздрава России совместно с ФГБОУ ВО "Ижевская государственная медицинская академия" Минздрава России инициировались попытки поиска потенциальных антитромботических препаратов на основе конденсированных азотсодержащих гетероциклов. Были выявлены активные вещества, которые по уровню и спектру антиагрегационной активности значительно превосходили препараты сравнения (патент 2373929RU от 11.11.2008; патент 2459825RU от 31.05.2011; патент 2459826RU 31.05.2011). Установлено, что в химической основе тиетанилксантина возможна реализация нескольких механизмов антиагрегационного эффекта (Самородов А.В., 2012; Камилов Ф.Х. и др., 2015; Халиуллин Ф.А. и др., 2017). В связи с этим важной является перспектива разработки новых потенциальных блокаторов ГП IIb-IIIa среди производных данного ряда и углубленное изучение их фармакологических свойств.
Целью исследования являются выявление и разработка потенциального блокатора тромбоцитарного рецептора - ГП IIb-IIIa среди тиетансодержащих производных гетероциклов.
Задачи исследования:
-
Провести скрининг ряда производных ксантина, триазола и имидазола на систему гемостаза с выбором наиболее перспективного соединения.
-
Изучить механизм антиагрегационного действия 3-метил-8-пиперазино-7-(тиетанил-3)-1-этилксантина гидрохлорида.
-
Оценить активность 3-метил-8-пиперазино-7-(тиетанил-3)-1-этилксантина гидрохлорида в условиях in vitro.
-
Оценить эффективность 3-метил-8-пиперазино-7-(тиетанил-3)-1-этилксантина гидрохлорида в условиях in vivo при введении интактным животным и в условиях модельных тромбозов.
-
Разработать модель тромбоэмболии легочной артерии и оценить эффективность терапии и профилактики 3-метил-8-пиперазино-7-(тиетанил-3)-1-этилксантина гидрохлоридом.
-
Изучить роль в поражение миокарда продуктов перекисного
окисления липидов в условиях экспериментальной тотальной ишемии и ишемии-реперфузии с последующей оценкой эффективности фармакологических средств коррекции.
Научная новизна. Впервые проведено изучение in vitro новых 250
тиетансодержащих производных ксантина, триазола и имидазола в отношении
антиагрегационной и антикоагуляционной активностей. Для малорастворимых в
воде соединений разработан биологически инертный растворитель (патент
2537260RU от 08.10.2013). Установлено, что в химической основе
пиперазинсодержащего тиетанилксантина возможна реализация и
антиагрегационной, и гемостатической активностей (патент 2373929RU от
11.11.2008; патент 2404181RU от 02.06.2009; патент 2459825RU от 31.05.2011;
патент 2459826RU от 31.05.2011). В результате скрининга найдено 20 активных
производных 7-тиетанил-8-пиперазиноксантинов, среди которых наиболее
перспективным является соединение 3-метил-8-пиперазино-7-(тиетанил-3)-1-
этилксантина гидрохлорид (патент 2404181RU от 02.06.2009). Впервые
установлено, что пиперазинсодержащие производные тиетанилксантина
обладают способностью связывания с рецептором тромбоцитов - ГП IIb-IIIa
(патент 2643336RU от 31.01.2018). Установлены и изучены у 3-метил-8-
пиперазино-7-(тиетанил-3)-1-этилксантина гидрохлорида антиагрегационная,
дезагрегационная, противовоспалительная и антиоксидантная активности и
способность снижать тромбогенный потенциал сосудистой стенки. Впервые
проведена оценка токсичности и фармакокинетических параметров 3-метил-8-
пиперазино-7-(тиетанил-3)-1-этилксантина гидрохлорида. В условиях
модельного тромбоза нижней полой вены у крыс установлена эффективность 3-
метил-8-пиперазино-7-(тиетанил-3)-1-этилксантина гидрохлорида как в качестве
средства профилактики, так и средства лечения тромбоза. На оригинальной
разработанной нами модели тромбоэмболии легочной артерии (патент
2610212RU от 24.12.2015) продемонстрировано, что применение 3-метил-8-
пиперазино-7-(тиетанил-3)-1-этилксантина гидрохлорида способствует
реканализации ранее пораженных эмболией сосудов легких аналогично
стандартной тромболитической терапии. Впервые проведена оценка
эффективности действия стандартных антиагрегационных препаратов и 3-
метил-8-пиперазино-7-(тиетанил-3)-1-этилксантина гидрохлорида на
метаболизм миокарда в условиях тотальной ишемии и ишемии-реперфузии.
Биохимическими и инструментальными методами доказано, что применение экспериментального вещества эффективно снижает зону повреждения миокарда и препятствует обусловленному инфарктом ремоделированию миокарда. По результатам впервые проведенного комплекса оценки влияния соединения 3-метил-8-пиперазино-7-(тиетанил-3)-1-этилксантина гидрохлорида на систему гемостаза в условиях in vitro, ex vivo и in
vivo оно рекомендовано для клинических испытаний.
Теоретическая практическая значимость работы. По результатам скрининга определены перспективные базовые структуры для поиска и последующего изучения новых тиетансодержащих производных ксантина и триазола, проявляющих антиагрегационную и антикоагуляционную активности. Полученные экспериментальные данные позволяют проводить дальнейший направленный поиск антиагрегационных веществ среди азотсодержащих производных гетероциклов с заданным механизмом действия.
Выявленные закономерности между антиагрегационной и антикоагуляционной активностями и химической структурой используются при синтезе новых веществ в ФГБОУ ВО "Башкирский государственный медицинский университет" Минздрава России (г. Уфа) и ФГАОУ ВО "Самарский национальный исследовательский университет им. академика С.П. Королева" (г. Самара).
Результаты работы внедрены в лекционные курсы кафедры фармакологии ФГБОУ ВО "Ижевская государственная медицинская академия" Минздрава России, кафедры органической, биоорганической и медицинской химии ФГАОУ ВО "Самарский национальный исследовательский университет им. академика С.П. Королева", кафедрах фармакологии и фармацевтической, аналитической и токсикологической химии ФГБОУ ВО "Башкирский государственный медицинский университет" Минздрава России.
Методологические подходы к изучению влияния азотсодержащих производных гетероциклов на систему гемостаза, оригинальный растворитель малорастворимых в воде веществ и экспериментальная модель тромбоэмболии легочной артерии на крысах используются при проведении исследований в лабораториях кафедр фармакологии ФГБОУ ВО "Башкирский государственный медицинский университет" Минздрава России (г. Уфа), ФГБОУ ВО "Ижевская государственная медицинская академия" Минздрава России (г. Ижевск) и лабораториях ФГАОУ ВО "Самарский национальный исследовательский университет им. академика С.П. Королева" (г. Самара).
Модель прогноза развития тромбоэмболических осложнений у пациентов с высоким риском внедрена в практику клинических отделений ГБУЗ "Республиканская клиническая больница им. Г.Г. Куватова" (г. Уфа), ГБУЗ "Самарская городская клиническая больница № 1 им. Н.И. Пирогова" (г. Самара), ООО "Клинический институт мозга" (г. Екатеринбург), ГАУЗ "Центральная городская клиническая больница №18" (г. Казань).
Установлен механизм действия, определена область применения и
целесообразность доклинических и клинических исследований для нового
синтетического блокатора тромбоцитарных рецепторов ГП IIB-IIIa 3-метил-8-
пиперазино-7-(тиетанил-3)-1-этилксантина гидрохлорида. Результаты
исследования легли в основу заявки для получения разрешения I фазы клинических испытаний.
Методология и методы исследования. Исследовательская работа проведена в строгом соответствии с рекомендациями «Руководства по экспериментальному изучению новых фармакологических веществ» (Москва, 2012).
Работа выполнена в период 2012-2017 гг. на кафедрах биологической химии ФГБОУ ВО "Башкирский государственный медицинский университет" Минздрава России и общей и клинической фармакологии ФГБОУ ВО "Ижевская государственная медицинская академия" Минздрава России с использованием научной методологии, основанной на системном подходе с применением формально-логичных, общенаучных и специфических методов. Для решения поставленных задач применялся весь разрешенный комплекс доклинических исследований, который включает в себя изучение активности в условиях in vitro на крови здоровых добровольцев, ex vivo у пациентов с состоявшимся тромбозом, in vivo на здоровых лабораторных животных и экспериментальную работу в условиях модельных тромбозов нижней полой вены, тромбоэмболии легочной артерии и модели тотальной ишемии и ишемии-реперфузии миокарда. Все эксперименты проведены с учетом требований международных и российских законодательных актов о юридических и этических принципах исследований с использованием лабораторных животных.
Для решения поставленных цели и задач исследования использовались следующие методы: тромбоэластография, тромбодинамика, проточная цитофлоуметрия, индуцированная агрегация тромбоцитов, стандартные клоттинговые тесты, иммунотурбидиметрический метод и метод хромогенных субстратов, спектрометрия, иммуноферментный анализ, хемилюминесценция, хроматография, гистологические исследования и методы прижизненного мониторинга основных витальных функций. Статистическая обработка результатов экспериментов проводилась с помощью пакета прикладных программ «Statistica 10.0» (StatSoft, США), «Kinetica 5.0» (Thermo Fisher Scientific Inc., США) и «GraphPad Prism» (GraphPad Software, Inc., США).
Все исследования были одобрены этическим комитетом ФГБОУ ВО «Башкирский государственный медицинский университет» Минздрава России (протокол №1 от 14.02.2018).
Положения, выносимые на защиту
1. Соединение 3-метил-8-пиперазино-7-(тиетанил-3)-1-этилксантина
гидрохлорид - новый синтетический блокатор тромбоцитарного рецептора ГП
IIb-IIIa.
2. В условиях эксперимента на этапах in vitro и in vivo соединение 3-
метил-8-пиперазино-7-(тиетанил-3)-1-этилксантина гидрохлорид в качестве
средства профилактики и лечения тромбоза превосходит по уровню антиагрегационной активности и эффективности все используемые в клинике современные антиагрегационные препараты.
3. Соединение 3-метил-8-пиперазино-7-(тиетанил-3)-1-этилксантина
гидрохлорид в условиях экспериментальной ишемии и ишемии-реперфузии
миокарда протектирует интенсивность процессов перекисного окисления
липидов, уменьшая зону повреждения миокарда.
4. Обоснована целесообразность дальнейшей оценки безопасности
соединения 3-метил-8-пиперазино-7-(тиетанил-3)-1-этилксантина гидрохлорида
для получения разрешения на проведение клинических испытаний.
Степень достоверности и апробации результатов. Достоверность результатов и обоснованность выводов базируется на адекватности экспериментальных моделей in vitro и in vivo, достаточном объеме исследований, использовании сертифицированного оборудования и современных методов исследования, корректной статистической обработке результатов исследования. Анализ данных и их обобщение проведены с применением методов математической статистики и прикладной математики, соответствующих характеру полученных данных и задачам диссертационной работы. Все выявленные закономерности, эффекты, обобщения и выводы подтверждались сериями независимых экспериментов, компьютерными расчетами и результатами статистического анализа.
Основные материалы диссертации докладывались и обсуждались на 80-й, 81-й республиканских научных конференциях студентов и молодых ученых «Вопросы теоретической и практической медицины» (Уфа, 2015 и 2016 годы), ежегодном международном конгрессе "Experimental Biology" (США, 2014 и 2017 годы), Российской научно-практической конференции с международным участием, посвященной памяти профессора Д.М. Зубаирова «Актуальные вопросы медицинской биохимии и клинической лабораторной диагностики» (Казань, 2013 год), VII и VIII Российских научно-практических конференциях «Здоровье человека в XXI веке» (Казань, 2015 и 2016 годы), Российской научно-практической конференции «Зубаировские чтения: новое в коагулологии» и российской научно-практической конференции «Медицинская биохимия: достижения и перспективы» (Казань, 2015 год), XLVIII-XLIX международной научно-практической конференции "Современная медицина: актуальные вопросы" (Новосибирск, 2015 год), IV Международной научной конференции «Перспективы развития биологии, медицины и фармации» (Казахстан, 2016 год), 7-м европейском конгрессе по фармакологии EPHAR-2016 (Турция, 2016 год), 3-м всемирном конгрессе «Controversies in Thrombosis and Hemostasis (CiTH)», проводимом совместно с 8-й Всероссийской конференцией по клинической гемостазиологии и гемореологии (Москва, 2016 год),
Всероссийской конференции молодых ученых "Химия и технология гетероциклических соединений" (Уфа, 2017 год), Российском конгрессе «Обоснованная терапия нарушений гемостаза» (Казань, 2017 год).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 45 работ, в том числе
19 статей в научных журналах и изданиях, которые включены в перечень
российских рецензируемых научных журналов и изданий для опубликования
основных научных результатов диссертаций, и 8 патентов на изобретения. 18
работ опубликованы в материалах всероссийских и международных
конференций и симпозиумов.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 279 страницах машинописного текста, иллюстрирована 56 рисунками, 50 таблицами, содержит 12 приложений. Состоит из введения, обзора литературы, шести глав собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы, включающего 51 отечественных и 264 зарубежных источников.
Личный вклад автора. Автору принадлежит определяющая роль в формировании научной тематики, обосновании цели и постановке задач. Автор принимал непосредственное участие в создании базы данных соединений и проведении экспериментов in vitro, ex vivo и in vivo. Интерпретация и анализ полученных результатов, их публикация в научных изданиях и обсуждение на конференциях, формулировка выводов и практических рекомендаций, а также написание диссертации выполнены автором лично.
Анализ опыта применения препаратов блокаторов ГП IIb-IIIa тромбоцитов
Гликопротеин IIb-IIIa (интегрин IIb3, CD41/CD61) является наиболее интересной мишенью для антитромбоцитарной терапии, обеспечившей, с одной стороны, беспрецедентный клинический и коммерческий успех, с другой -крупнейшую неудачу, повлекшую значительные финансовые потери [84]. На сегодняшний день в качестве антиагрегационных средств, блокирующих тромбоцитарные рецепторы ГП IIb-IIIa, известны и разрешены к клиническому применению три препарата для парентерального введения [84, 97, 265]. Первым препаратом, получившим одобрение FDA в 1994 году, было рекомбинантное моноклональное антитело abciximab (ReoPro) [60]. Вторым - эптифибатид (L цистеинамид, N6-(аминоиминометил)-N2-(3-меркапто-1-оксопропил)-L лизилглицил-L--аспартил-L-триптофи-L-пропил-,циклический(1-6)-дисульфид («Интегрилин», Glaxo Operations UK Limited, Великобритания)), который был одобрен в 1998 году, в его основу легли дезинтегрин и барбурин, полученные из змеиного яда, последовательностью Lys-Gly-Asp (KGD). Третий одобренный препарат тирофибан (N-(бутилсульфаонил)-4-[4-(4-пиперидин)бутокси]- фенилаланина моногидрохлорид моногидрат, «Аграстат», Correvio, Великобритания), представляет собой непептидное соединение, которое моделируется на основе лиганд-миметического пептида RGD [45, 50].
Объединенный анализ пяти рандомизированных исследований, включавших 11612 пациентов, демонстрирует снижение риска эпизодов сосудистой катастрофы на 31% в течение 30-дневного наблюдения после инфузии блокаторов ГП IIb-IIIa [262]. Эти результаты принимались безоговорочно на протяжении 3 лет и легли в основу клинических рекомендаций [275]. Несмотря на исходно широкие показания к применению блокаторов ГП IIb-IIIa сразу после разработки, в настоящее время их использование относительно ограничено небольшой группой пациентов, которые подвергаются вмешательствам на коронарные артерии без предварительной нагрузки ингибиторами P2Y12 или пациентов с высоким риском тромбоза стента [97]. В некоторых странах получены отрицательные результаты клинических испытаний данных трех лекарственных средств [150]. К примеру, в Японии нет ни одного разрешенного ингибитора рецептора ГП IIb-IIIa тромбоцитов.
По результатам клинического применения преимуществами внутривенных форм блокаторов ГП IIb-IIIa, выступающих в качестве мишени для антиагрегационной терапии являются:
1. ГП IIb-IIIa - центральный рецептор, обеспечивающий связывание тромбоцитов с фибриногеном/фибрином, образование тромбов. Блокада этого рецептора эффективно ингибирует агрегацию тромбоцитов и образование тромбов.
2. Рецептор представлен только на тромбоцитах и мегакариоцитах, что обусловливает отсутствие системных нежелательных эффектов.
3. ГП IIb-IIIa подвергается конформационному изменению после активации тромбоцитов, что позволяет специально блокировать активированные тромбоциты и сохранять неизменным гемостаз.
Однако ГП IIb-IIIa как мишень для антиагрегационной терапии имеет ряд недостатков, которые могут являться серьезной проблемой:
1. Рецепторов ГП IIb-IIIa чрезвычайно много на тромбоцитах, порядка 60 000 - 80 000 рецепторов на каждом тромбоците. Следовательно, для полной блокировки всех рецепторов на всех циркулирующих тромбоцитах требуются высокие дозы лекарственных средств (например от 20 до 30 мг абсциксимаба) и, как правило, это приводит к частичной блокировке рецептора.
2. «Мимикрия» лигандов является основой всех блокаторов ГП IIb-IIIa, которые в настоящее время находятся в клиническом применении, и всех тех, что тестировались в клинических испытаниях и в конечном итоге были оставлены. При этом взаимодействие лиганд-миметических блокаторов с ГП IIb-IIIa провоцирует конформационное изменение рецептора, что приводит к связыванию фибриногена (прайминг). Кроме того, данное конформационное изменение не предотвращает дальнейшую передачу сигнала, тем самым вызывая парадоксальную активацию тромбоцитов [92].
3. Блокада ГП IIb-IIIa, независимо от причины, всегда препятствует нормальному гемостазу и, таким образом, вызывает кровотечение, что также проявляется в фенотипе заболевания тромбостении Гланцмана. Тромбостения Гланцмана - это наследственное заболевание, связанное с уменьшением экспрессии или функции рецептора тромбоцитов ГП IIb-IIIa [56, 63].
Повышенный риск кровотечения, особенно при редких событиях, таких как легочное кровотечение, чаще наблюдается у пациентов, которые получали комбинацию блокаторов рецептора ГП IIb-IIIa и фибринолитической терапии [155].
Пероральные формы ингибиторов ГП IIb-IIIa рецептора тромбоцита разрабатывались различными компаниями. Всего было завершено пять клинических испытаний III фазы (более 42 000 пациентов), в которых изучались четыре разных соединения. Эти исследования или не обнаружили значительного преимущества по сравнению с традиционной терапией (аспирином) или продемонстрировали высокую смертность, в том числе смертность от сердечнососудистых заболеваний. Полученный отрицательный клинический результат положил конец развитию пероральных ингибиторов ГП IIb-IIIa с большими финансовыми потерями многих фармацевтических компаний [121]. Однако представляется интересным анализ причин неэффективности пероральных форм блокаторов ГП IIb-IIIa тромбоцитов - связаны они с особенностью самого рецептора или недостатками разрабатываемых лекарственных препаратов.
Разработано несколько гипотез, которые могли бы объяснить данное явление. К основным причинам неэффективности пероральных форм блокаторов ГП IIb-IIIa относятся трудности, связанные с оценкой целевого уровня ингибирования функции тромбоцитов, индуцирование активации тромбоцитов, генерации тромбина и некорректно проведенные исследования.
Целевое значение ингибирования функции тромбоцитов.
Ранние исследования на моделях артериального тромбоза на животных с применением блокаторов гликопротеина IIb-IIIa, проведенные Coller и др. [66], показали, что максимальный терапевтический эффект в предотвращении реокклюзии достигнут в дозировке, равной 80% ингибированию агрегации тромбоцитов с использованием 20 мкм АДФ методом турбидиметрической агрегометрии. Выбранная доза абциксимаба для достижения такого уровня ингибирования функциональной активности тромбоцитов продемонстрировала свою эффективность в первых клинических исследованиях на пациентах с высокой степенью риска ангиопластики коронарной артерии или атерэктомии [37]. С тех пор принято, что 80% ингибирование АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов необходимо для получения оптимального клинического эффекта.
Данный факт был подтвержден в исследованиях с другими блокаторами ГП IIb-IIIa, такими как эптифибатид. Результаты клинического испытания IMPACT II демонстрируют низкую эффективность малых доз эптифибатида. Тогда как более высокие дозировки, используемые в PURSUIT, демонстрируют лучшие клинические эффекты в аналогичной популяции пациентов [24, 44]. В последнее время эта концепция была подтверждена в обсервационном испытании, проведенном на 469 пациентах, получавших абциксимаб, тирофибан или эптифибатид во время чрескожного коронарного вмешательства, демонстрируя очень низкую частоту тромбоза у больных с более 70% ингибированием агрегации тромбоцитов на протяжении 8 часов после процедуры по сравнению с трехкратным увеличением основных неблагоприятных сердечных событий у больных с низким уровнем ингибирования агрегации тромбоцитов [90].
Теоретически высокий уровень ингибирования агрегации тромбоцитов также желателен и при длительном пероральном приеме блокаторов рецепторов ГП IIb-IIIa. Тем не менее у пациентов, получающих перорально эти агенты в высоких дозах в течение нескольких месяцев, выраженное ингибирование ГП IIb-IIIa приводило к неприемлемым геморрагическим осложнениям [139, 166]. Например, в исследовании APLAUD lotrafiban вводили два раза в день в различных дозах и сравнивали обе дозировки с плацебо и аспирином в дозе 325 мг. Lotrafiban хорошо переносится в нижней дозе, но в высокой дозе (100 мг дважды в день) у 70% пациентов регистрировались "малые" кровотечения, особенно заметны у пожилых людей и/или у пациентов с нарушением функции почек. "Серьезные" кровотечения, включающиеся в себя внутричерепные кровоизлияния или кровотечения, требующие переливания крови или госпитализации, имели место в 11 и 8% случаев [139]. Эта высокая доза lotrafiban соответствовала ингибированию АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов 98% и 80% соответственно. Прямая связь между обеими дозировками, уровнем препаратов и процентом ингибирования показаны для sibrafiban [103], а также для xemilofiban в исследовании ORBIT. В большинстве из II фазы исследований уровень ингибирования АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов был значительно меньше 80%. У пациентов, получающих дозу 20 мг xemilofiban, процент ингибирования среднего АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов колебалась в пределах 51-87%. Максимальный эффект наблюдался через 4 часа после приема внутрь (73-87%) [35, 218]. После 8 часов уровень ингибирования агрегации тромбоцитов снижался (51-58% ингибирования) [236]. Подобный пик и плато уровней ингибирования были зарегистрированы и для sibrafiban, orbofiban и lotrafiban [103, 232, 139].
Giugliano и др. [165] сообщили о результатах первого испытания совместного внутривенного и перорального приема блокаторов ГП IIb-IIIa. После в/в введения ингибиторов гликопротеина IIb-IIIa в течение 24-96 ч начинали вводить перорально в течение 4 недель в дозах 350-600 мг дважды или трижды в день. Пероральный прием препарата демонстрировал снижение пика уровня агрегации тромбоцитов в 40-60% и нагрузочной дозы примерно на 20%, для АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов, взятых в дозировке 20 мкг. В этом исследовании, несмотря на широкий диапазон дозировок, длительный прием перорального блокатора ГП IIb-IIIa не ингибировал более чем на 50% функцию тромбоцитов [165]. Таким образом, уровни ингибирования агрегации тромбоцитов при пероральном приеме препаратов могут быть слишком низкими, чтобы оказаться эффективнее и/или достигать показателей, полученных при внутривенном использовании препаратов в текущих дозах.
Анализ исходных данных
Анализ исходных данных начали с оценки группы здоровых добровольцев и пациентов с состоявшимся тромбозом. С применением модуля Statistica Power Analysis была проведена оценка мощности критерия для ключевых показателей: агрегация тромбоцитов, индуцированная АДФ, коллагеном, и концентрация D-димеров. Общее число наблюдений составляет 150, в группе контроля - 60 здоровых добровольцев, в группе тромбоза - 90 пациентов. Расчетное SD для данных показателей в среднем составляет 2,0, размер эффекта принимаем для каждого показателя отдельно исходя из данных литературы [235]. Установлено, что для основных показателей мощность критерия при данной выборке превышает 95%.
Из данных таблицы 17 видно, что показатели функциональной активности тромбоцитов артериальной и венозной крови не имеют статистических различий. Это полностью соотносится с данными литературы [227].
На сегодняшний день проведены многочисленные исследования, посвященные эпидемиологии тромбозов различной локализации, выявлены группы риска и установлены спектр и частота различных эпизодов тромботических и тромбоэмболических осложнений. На данном этапе исследовательской работы необходимо оценить репрезентативность собственной выборки в рамках основной цели исследования. Для этого в качестве критериев анализа выбрали демографические характеристики и данные анамнеза. Для оценки частоты сахарного диабета, онкологической патологии и курения у пациентов с тромбозом провели анализ исходных данных методом сопряженных таблиц с применением Пирсона. Установлено, что частота тромбоза не зависит от пола (p=0.337) в данной возрастной группе, что полностью соотносится с данными литературы [79]. Курящие лица в данной выборке преимущество распределены в группу тромбоза ( = 3,947368, p=0.04694), что не противоречит данным литературы о вкладе курения в увеличение частоты тромбозов [124]. Сопутствующие заболевания - сахарный диабет ( = 3,875271, p=0.03612) и онкологическая патология ( = 4,159431, p=0.04235) - с разной частотой статистически значимо способствуют развитию тромбоза в данной выборке, что подтверждается результатами [221]. Так как основной целью исследования является характеристика эффективности антиагрегантов и нового соединения I на тромбоцитах в состоянии гиперагрегации, для оценки частоты гиперагрегации была введена дополнительная бинарная категориальная переменная, характеризующая показатели агрегации тромбоцитов, отличные от референсных значений. Далее методом сопряженных таблиц с применением Пирсона установлено, что тромбозы различной локализации сопровождаются гиперагрегацией тромбоцитов ( = 3,875271, p=0.0031) [180]. По частоте показателя синусовый ритм статистически значимого различия в группах тромбоза и контроля не было. Однако анализ данных литературы показывает, что данный показателей не относится к точному предиктору развития тромбоза [180]. Таким образом, по спектру маркерных точек сформированная выборка достаточно адекватно соотносится с основными популяционными характеристиками пациентов с тромбозом и приемлема для оценки терапевтической эффективности лекарственных средств в условиях ex vivo.
Далее пациенты были распределены на 5 групп согласно основному заболеванию. Клинические характеристики групп представлены в таблице 18.
Данные представлены как абс.(%) и М±SD для возраста. Здесь и далее в таблицах: ТЭЛА - тромбоэмболия легочной артерии, ОКС - острый коронарный синдром, ОНМК - острое нарушение мозгового кровообращения, ТГВ/МТ -тромбоз глубоких вен/мезентериальный тромбоз.
Группа ОКС исходно включала 33 пациента. Первичный диагноз выставлялся на основании клинической картины, данных электрокардиографии и биохимических маркеров инфаркта миокарда. Далее из 33-х 22-м пациентам был выставлен диагноз инфаркт миокарда, из них гиперагрегация регистрировалась у 18 пациентов. Показатели тромбоэластографии (таблица 19) свидетельствовали о различной напряженности гемостатического потенциала в артериальном и венозном участках кровотока. Время реакции (R), характеризующее первую стадию свертывания крови (свертывание плазмы), в венозном участке кровообращения увеличивалось в среднем на 30% (p=0.007) по сравнению с контролем, а в артериальном участке оно возрастало незначительно (p=0.3).
Значительно возрастает показатель МА, характеризующий способность тромбоцитов к агрегации, ретракции и реакции высвобождения, в 2,7 раза для венозной и в 4,2 раза для артериальной крови. Резко снижено время достижения максимальной прочности сгустка – ТМА, значение которого снижалось на 29,5% относительно контроля для венозной и на 37,5% для артериальной крови. Показатель прочности сгустка (G) в венозной крови был выше на 45,8% контрольных значений и практически в 1,5 раза больше в артериальной в сравнении с венозной кровью (p=0.005). Таким образом, у пациентов с острым инфарктом миокарда состояние гемостаза по данным полирегиональной тромбоэластографии в различных участках сосудистого русла характеризуется неоднородной напряженностью свертывающего потенциала. Интенсивность этого потенциала наиболее высокая в венозном русле, снижается на артериальном уровне, хотя значительно превышает те же показатели у здоровых людей. Показатели фибринолиза максимальны в артериальном русле, уменьшаются на венозном участке с отсутствием статистической разницы (р=0,2).
Показатели Wu-Hoak увеличиваются более чем в 15 раз (p 0,01) как в артериальной, так и в венозной крови в сравнении с группой контроля. Показатели агрегации тромбоцитов демонстрируют гиперагрегацию на всех индукторах как на артериальной, так и на венозной крови (таблица 20).
В группу ТЭЛА исходно был распределен 41 пациент, при этом у 11 пациентов диагноз ТЭЛА не подтвердился, у 7 пациентов не регистрировалась гиперагрегация тромбоцитов. В группу ТГВ/МТ исходно распределено 32 пациента, но у 7 пациентов гиперактивности тромбоцитов при скрининге выявлено не было. Практически с одинаковой частотой гиперагрегация тромбоцитов сопровождает ТЭЛА и мезентериальный тромбоз. Показатели Wu-Hoak в опытных группах, аналогично группе ОКС, увеличиваются более чем в 15 раз (p 0,01) как в артериальной, так и в венозной крови в сравнении с группой контроля.
Изучение агрегации тромбоцитов демонстрирует гиперагрегацию на всех индукторах как на артериальной, так и на венозной крови. Результаты тромбоэластографии характеризуются повышением активности тромбоцитарного звена гемостаза - МА возрастает в среднем на 46,9%, повышением времени формирования сгустка – ТМА снижается в среднем на 39%, увеличением прочности сгустка – G возрастает практически в 2,3 раза относительно контроля равнозначно как в артериальном, так и в венозном участке кровотока. Показатели фибринолиза, вероятно, компенсаторно характеризуются повышением активности преимущественно в венозном участке кровотока – параметр CLT снижается на 17,5% для артериальной и на 21,4% для венозной крови относительно контроля. Среди выбранных нозологий группа ОНМК практически не сопровождалась гиперагрегацией тромбоцитов и гиперкоагуляцией. Анализ показателей системы гемостаза, регистрируемых на разных участках кровотока, не выявил статистически значимых изменений относительно контроля. Возможно, это объясняется иными патогенетическими путями развития ОНМК, преобладанием гемодинамических расстройств, длительным приемом антитромбоцитарной, антигипертензивной, гиполипидемической терапией.
Оценка эффективности соединения I и препаратов сравнения как средств профилактики тромбоза нижней полой вены
Анализ суточной выживаемости (таблица 36 и рисунок 25) демонстрирует, что в группе ложнооперированных крыс падеж отсутствовал, в группе физиологического раствора летальность животных от тромбоза составила 15%, в группах лекарственных препаратов и соединения I убыль животных до вывода из эксперимента не превышала 10%.
Результаты исследования функциональной активности тромбоцитов при внутривенном введении соединения I и препаратов сравнения представлены в таблицах 37-38. Установлено, что в группе ложнооперированных крыс образование тромба не происходило. Средняя масса влажного тромба в контрольной группе физиологического раствора составила 11,3 г, сухого - 4,4 г. Это превышает показатели масс влажных тромбов, полученных в группе пентоксифиллина, на 27,4%, однако данные статистически не достоверны (р 0,05).
Аспирин и пентоксифиллин статистически значимо снижали массивность тромбоза на 34,5% (р 0,001) и 27,4% (р 0,001) соответственно в сравнении с контролем. Несмотря на регистрацию циркулирующих тромбоцитарных агрегатов 15% (р 0,0001) методом Wu-Hoak, показатели агрегации тромбоцитов оставались на уровне контрольных значений. Данные тромбоэластографии демонстрируют эффективную коррекцию состояния гиперкоагуляции и гиперагрегацию тромбоцитов, вызванную тромбозом. Показатели ТЭГ соответствуют значениям интактных животных.
Внутривенное введение блокаторов тромбоцитарных рецепторов ГП IIb-IIIa в исследуемых дозировках не приводило к образованию визуально различимого тромба, пригодного к взвешиванию. Агрегация тромбоцитов, индуцированная АДФ и коллагеном, статистически значимо снижалась практически в 2 раза. Количество тромбоцитарных агрегатов, рассчитанных по методу Wu-Hoak, при перевязке нижней полой вены оставалось в пределах контрольных значений. По данным тромбоэластографии (таблица 38), установлено, что введение препаратов группы блокаторов ГП IIb-IIIa до индукции тромбоза эффективно снижало системную гиперкоагуляцию. Изменения, регистрируемые методом тромбоэластографии при внутривенном введении тирофибана, монофрама и эптифибатида, статистически не различались между собой и носили однотипный характер. Они проявлялись снижением показателей, характеризующих функциональную активность тромбоцитов и коагуляционного звена системы гемостаза, - R, K и МА находились на уровне значений интактных и ложнооперированных животных. При этом регистрировалась и повышенная фибринолитическая активность крови. Значения CL30 и LY30, характеризующие систему фибринолиза, составляли в среднем 98,7% (p=0.01) и 47,4% (p=0.007), что по-прежнему превышает показатели интактных крыс. Время полного лизиса сгустка (СLT) в среднем для препаратов группы блокаторов ГП IIb-IIIa составило 34,4 мин, что эффективнее контрольных значений крыс группы физиологического раствора на 28,6% (p=0.0003). При этом индекс общего коагуляционного потенциала (СI) находился в диапазоне 1,0-2,0, что свидетельствует о незначительной гиперкоагуляции, параметры ТМА и TPI соответствовали значениям интактных крыс. Эффективно препятствовал образованию тромбов в участке перевязанной нижней полой вены и эноксапарин натрия. Подкожное введение эноксапарина натрия в 100% случаев предотвращало развитие тромбоза.
Введение соединения I, аналогично эптифибатиду, монофраму и тирофибану, эффективно препятствовало образованию тромба в условиях полной окклюзии - при визуальном осмотре участков нижней полой вены признаков тромбоза не обнаруживалось. Агрегация тромбоцитов статистически значимо снижалась при активации АДФ в 2,2 раза (р 0,001) и коллагеном в 1,8 раза (р 0,001) в сравнении с контрольными значениями.
Следует отметить, что разница масс свежих и сухих тромбов для групп контроля, пентоксифиллина и аспирина статистически не имела различий и в среднем составляла 4,4%. Группа эноксапарина натрия по данным тромбоэластографии характеризовалась снижением активности коагуляционного компонента гемостаза. Показатели К и R удлинялись на 24,4% и 27,7% соответственно в сравнении с группой физиологического контроля. Параметр МА, характеризующий процесс фибриноген-фибрин трансформации, снижался на 25,6% в сравнении с группой интактных крыс. Повышенная активность фибринолитической системы не регистрировалась - уровни CL30 и LY30, характеризующие систему фибринолиза, составляли в среднем 87,9% (p=0.6) и 31,4% (p=0.7), что соответствует значениям интактных крыс. Время полного лизиса сгустка составило 45,3 мин (p=0.4). При этом значение индекса общего коагуляционного потенциала (СI) находилось в диапазоне -1,0/-1,5, что свидетельствует о незначительной гипокоагуляции, а параметры ТМА и TPI соответствовали значениям интактных крыс.
Внутривенное введение соединения I, аналогично препаратам-блокаторам рецепторов ГП IIb-IIIa, приводило к снижению функциональной активности тромбоцитов - МА снижался на 35,7% (p 0,001) относительно группы физиологического контроля и на 17,8% (p 0,001) относительно интактных крыс. Это смещало общий коагуляционный потенциал в сторону гипокоагуляции: значение индекса общего коагуляционного потенциала (СI) находилось в диапазоне -1,7-2,6.
Эффективность соединения I и препаратов сравнения, как средств профилактики инфаркта миокарда на модели "ишемия-реперфузия"
По результатам проведенного исследования значимого влияния пентоксифиллина на площадь и характер поражения миокарда при гистологической оценки не выявлено. Динамика биохимических показателей представлена на рисунках 54-55. В ткани миокарда содержание креатинфосфата определялось больше контрольной группы без лечения на 58,8% (p=0.002), но меньше группы интактных животных на 12,2% (p=0.001) для первых суток эксперимента. Далее статистических различий на 3-и, 7-е, 14-е сутки разницы с группой интактных животных не регистрировалось. При этом уровень лактата в ткани миокарде был ниже на 24,1% (p=0.001) в первые сутки, на 19,7% (p=0.002) в третьи, на 11,1% (p=0.001) - в седьмые сутки наблюдения, к 14-му дню эксперимента уровень лактата был ниже контрольных значений на 19,5% (p=0.003) и статистически не различался с уровнем лактата у интактных животных. Активность каталазы и концентрация МДА в миокарде на всем протяжении эксперимента соответствовали группе крыс без лечения.
Применение основных препаратов из группы антиагрегантов на этапе реканализации положительно влияло на морфофункциональные и метаболические характеристики миокарда. Использование препаратов группы селективных блокаторов рецепторов тромбоцитов ГП IIb-IIIa при этом было наименее эффективно. Содержание основного макроэрга - креатинфосфата и уровень продуктов ПОЛ статистически не отличались от группы контроля. Однако зона поврежденного миокарда по результатам световой микроскопии и данных ЭХоКГ на всех сроках эксперимента свидетельствовала о менее выраженной кардиомиопатии и сократительной дисфункции, что может быть объяснено нивелированием гемостазиологического компонента, усугубляющего стаз в месте нарушения кровотока. Уровень фракции выброса был выше контрольных значений в течение всего периода наблюдений в среднем на 8,5% и 10,4% для эптифибатида и тирофибана соответственно. Конечный диастолический диаметр левого желудочка для эптифибатида был меньше в первые сутки на 3,5% (p=0.2), в третьи сутки -на 7,5% (p=0.01), седьмые сутки -на 2,6% (p=0.4), четырнадцатые сутки - на 6,3% (p=0.03) в сравнении с группой контроля. Этот же показатель был меньше в группе тирофибана в первые сутки на 2,9% (p=0.6), в третьи сутки -на 8,7% (p=0.02), седьмые сутки - на 1,3% (p=0.5), четырнадцатые сутки - на 4,7% (p=0.3) в сравнении с группой контроля.
Наиболее эффективным оказался аспирин. Применение ацетилсалициловой кислоты снижало отек и дилатацию камер и стенок сердца, возникающих в результате реперфузии, препятствуя отсроченному ремоделированию миокарда и развитию сердечной недостаточности. О данном факте свидетельствовало значение NT-proBNP, который был больше показателя интактных животных только на 15% (p 0.05). Установлено, что конечный диастолический диаметр левого желудочка был ниже, чем в группе без лечения, на 10% независимо от временной точки наблюдения. Фракция выброса до 7 суток в группе лечения аспирином был больше, чем в группе контрольных животных, на 13,5% (p 0.005), на 14-е сутки наблюдения показатель фракции выброса соответствовал значениям интактных животных (p=0.6). Следует отметить, что содержание креатинфосфата, пирувата и лактата было меньшими в каждой временной точке эксперимента по сравнению с группой контроля, но различия не достигали статистической значимости.
Соединение I эффективнее аспирина влияло на процессы энергетического обмена в миокарде. В ткани миокарда животных данной группы содержание креатинфосфата определялось выше контрольной группы ишемия-реперфузия без лечения на 36,9% (p=0.002) и было меньшим на 12,6% (p=0.001) у интактных животных в первые сутки наблюдения. Содержание пирувата в ткани миокарда крыс группы I в первые сутки после реперфузионного синдрома больше группы контроля на 47,7% (p=0.003), но меньше интактных животных на 23,3% (р=0.002). Далее на 3-и, 7-е и 14-е сутки статистической разности между группами контроля, группой соединения I и интактными животными в концентрации креатинфосфата и пирувата в миокарде не регистрировалось. При этом уровень лактата в ткани миокарда в период всего наблюдения был ниже контрольной группы на 24,1% (p=0.001) для первых суток и на 19,7% (p=0.003), 11,1% (p=0.002) и 19,5% (p=0.001) для третьих, седьмых и четырнадцатых суток эксперимента соответственно. На четырнадцатые сутки исследования уровень лактата соответствовал его значению у интактных животных. Активность каталазы в первые сутки развития реперфузионного синдрома снижалась на 24,6% (p=0.001), далее, вплоть до 14 суток показатель оставался на уровне интактных животных. Малоновый диальдегид в группе соединения I на всем протяжении эксперимента характеризовался самым низким содержанием в сравнении с группами препаратов сравнения и контроля. Однако в первые сутки его содержание было выше на 19,4% (p=0.001), в третьи - на 15,5% (p=0.002) по сравнению с интактными животными, а на седьмые и четырнадцатые сутки не отличалось от таковых.
Общая динамика сывороточных маркеров инфаркта миокарда в группе соединения I соответствует картине группы животных с ишемией-реперфузией без лечения, но характеризуется менее выраженной интенсивностью. Активность ЛДГ статистически значимо был ниже группы контроля в среднем на 25,5% (p 0.002) для 1 и 3 суток наблюдения и на 15,6% (p=0.001) и 8,6% (p=0.003) соответственно для 7 и 14 суток. Активность КФК регистрировалась меньше относительно показателей группы без лечения на 4,02% (p=0.5), 9,8% (p=0.002), 14,9% (p=0.003) и 2,3% (p=0.2) соответственно для 1, 3, 7 и 14 суток. Для КФК-МВ эта разница по суткам наблюдения соответственно составила 7,2% (p=0.2), 10,5% (p=0.003), 16,1% (p=0.007) и 21,5% (p=0.0001). Аналогичная динамика прослеживалась и в плазме крови в уровнях тропонина I и миоглобина. Установлено, что на 1-е, 3-и и 7-е сутки наблюдения различия с группой контроля при определении тропонина I составили 14,3% (p=0.007), 22,2% (p=0.003) и 15,0% (p=0.004) соответственно, а для миоглобина - 20,0% (p=0.001) и 25,0% (p=0.004) для первых и третьих суток соответственно. Статистических различий в содержании миоглобина на седьмые и четырнадцатые сутки в группе соединения I не отмечалось как в сравнении с контролем, так и с группой интактных животных.
Так, ФВ в группе соединения I на 16,5% (p=0.002) и 10,2% (p=0.003) больше в группе контроля без лечения на первые и третьи сутки эксперимента. При этом на седьмые и четырнадцатые дни наблюдения это различие сохранялось, составляя 10,6% (p=0.007) и 9,2% (p=0.008) соответственно, но уже не имело статистически значимых различий с группой интаткных животных. В первые сутки реперфузионного синдрома конечный диастолический диаметр левого желудочка был меньше на 20% (p=0.001) в сравнении с группой без лечения и с разницей около 15,0% (p 0.002) сохранялся на остальных временных точках наблюдения. Важно подчеркнуть, что на седьмые и четырнадцатые сутки эксперимента различий КДДЛЖ между группой интактных животных и группы соединения I не выявлялось. Об эффективной профилактике развития сердечной недостаточности путем введения соединения I свидетельствует и динамика показателя NT-proBNP; разница с группой животных без лечения сохранялась на уровне 16,0% (p 0.001) во все дни наблюдения.