Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 13
1.1. Современный взгляд на Болезнь Альцгеймера 13
1.2. Течение и клинические проявления болезни Альцгеймера 18
1.3. Фармакотерапия при болезни Альцгеймера 24
1.4. Эффективность терапии мемантином пациентов с болезнью Альцгеймера 29
1.5. Фармакокинетические аспекты изучения мемантина 36
1.6. Показания к применению мемантина 43
Глава 2. Материалы и методы исследования
2.1. Препараты, средства измерений, вспомогательные устройства 47
2.2. Реактивы и приготовление растворов 49
2.3. Тактика фармакокинетического исследования на животных 50
2.4. Тактика фармакокинетического исследования на добровольцах 50
2.5. Расчет фармакокинетических параметров 54
2.6. Статистическая обработка результатов 56
Результаты собственных исследований 57
Глава 3. Разработка методики количественного определения мемантина в плазме крови
3.1. Условия хроматографического анализа мемантина 57
3.2. Условия хромато-масс-спектрометрического определения мемантина 59
3.3. Количественное определение мемантина в плазме крови 61
3.4. Валидация методики количественного определения мемантина в плазме крови
Глава 4. Изучение фармакокинетики препарата меманейрин у животных и человека 72
4.1. Изучение фармакокинетики препарата Меманейрин у животных 72
4.2. Сравнительное исследование биоэквивалентности изучаемых препаратов 77
4.3. Сравнительный анализ экспериментальной и клинической фармакокинетики мемантина 97
Заключение 106
Выводы 109
Список литературы
- Течение и клинические проявления болезни Альцгеймера
- Реактивы и приготовление растворов
- Количественное определение мемантина в плазме крови
- Сравнительный анализ экспериментальной и клинической фармакокинетики мемантина
Введение к работе
Актуальность темы. В соответствии с Поручением Правительства Российской Федерации в Стратегию «Фарма 2020» вошел перечень МНН (международных непатентованных наименований) лекарственных средств (ЛС), не производящихся на территории Российской Федерации, производство которых должно быть налажено в стране к 2020 году. В данный перечень вошел препарат из группы антогонистов N-метил-D-аспартат-рецепторов (NMDA-рецепторов) – мемантин. Широкое клиническое применение данного препарата для лечения болезни Альцгеймера, обуславливает необходимость увеличения его производства и разработку методик по эффективной оценке взаимозаменяемости препаратов мемантина в соответствии с Постановлением Правительства РФ от 28.10.2015 №1154 «О порядке определения взаимозаменяемости лекарственных препаратов для медицинского применения».
Деменция представляет собой тяжелое расстройство высшей нервной деятельности, вызванное органическим поражением головного мозга, и проявляющееся, в первую очередь, резким снижением умственных способностей. Прежде всего, выделяются специфические виды деменции, при которых деструкция коры головного мозга является самостоятельным и ведущим патогенетическим механизмом заболевания: болезнь Альцгеймера (БА); деменция с тельцами Леви; болезнь Пика (Левин О.С., 2008; Mao P., 2012; Reitz C. and Mayeux R., 2014).
Болезнь Альцгеймера (синоним – деменция альцгеймеровского типа) представляет собой наиболее распространенную форму первичных дегенеративных деменций позднего возраста, которая характеризуется постепенным малозаметным началом в пресенильном или старческом возрасте, неуклонным прогрессированием расстройств памяти и высших корковых функций вплоть до тотального распада интеллекта и психической деятельности в целом, а также типичным набором нейропатологических признаков (Гаврилова С.И., Колыханов И.В., 2012; Hort J. et. al. 2010). Патология при БА включает экстрацеллюлярное накопление сенильных бляшек, преимущественно состоящих из -амилоида и интрацеллюлярных нейрофибриллярных клубочков, которые в свою очередь, состоят из патологического гиперфосфорилированного тау-протеина микротубул (Попова Т.Ф. и др., 2011; Kerchner G.A. et al, 2011). Несмотря на то, что традиционно БА рассматривается как нейродегенеративное расстройство несосудистой природы, научные исследования показывают, что факторами риска развития данной патологии являются гипертензия, атеросклероз, диабет и гиперхолестеринемия, которые непосредственно связаны с сосудистой деменцией (Кугаевская Е.В., 2013).
В настоящее время отсутствуют терапевтические средства, которые бы кардинально модифицировали течение этого заболевания. Для лечения БА одобрено использование ингибиторов ацетилхолинэстеразы и мемантина (Колыхалов И.В., 2014). В многочисленных исследованиях показано, что применение этих препаратов замедляет прогрессирование деменции и
положительно влияет на когнитивные функции, поведенческие нарушения и повседневную активность пациентов (Kutzing M.K. et al., 2012).
Терапевтическое действие мемантина (акатинол-мемантина) при деменции, в частности, при болезни Альцгеймера, обусловлено неконкурентным антагонистическим сродством мемантина к N-метил-D-аспартатным рецепторам (NMDA-рецепторам) глутамата. Связываясь с NMDA-рецепторами, контролирующими кальциевые каналы, препарат блокирует поступление кальция внутрь клетки и уменьшает патологически повышенное содержание глутамата, оказывающего повреждающее действие на нервные клетки (токсическое возбуждение), которое приводит к дисфункции нейронов (Peng D. et al., 2013).
В соответствии с провозглашенной Правительством РФ лекарственной политикой (Федеральный закон №61-ФЗ от 12 апреля 2010 года «Об обращении лекарственных средств»), направленной на импортозамещение, в Российской Федерации разработан отечественный аналог препарата Акатинол Мемантин – Меманейрин в виде капель для внутреннего применения. Перед внедрением в производство воспроизведенного лекарственного средства Меманейрин должны быть проведены фармакодинамические и фармакокинетические исследования. Поскольку в настоящее время для количественного определения мемантина в биологических жидкостях в основном используют сложную и трудоемкую методику – газожидкостную хроматографию (Kornhuber et al., 2007), целесообразно разработать методику количественного определения методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрической детекцией, являющейся наиболее точной и менее трудоемкой. Кроме того, данная методика позволяет также проводить на ее основе исследование фармакокинетики исследуемого лекарственного средства Меманейрина.
В рамках проблемы эффективности и безопасности воспроизведенных ЛС важное место отводится изучению их биодоступности и биоэквивалентности в первую очередь по сравнению с зарегистрированными оригинальными лекарственными препаратами. В связи с этим, представляется актуальным проведение сравнительного исследования отечественного воспроизведенного ЛС и оригинального лекарственного препарата.
Степень разработанности темы. Препараты группы адамантанов имеют очень низкий предел количественного обнаружения в биологических жидкостях, поэтому разработка чувствительной методики их определения чрезвычайно важна.
Одной из первых методик определения мемантина в биологических жидкостях использовался метод газовой хроматографии - весьма трудоемкий и с высокой степенью погрешности измерений. В последние годы проблеме разработки методики количественного определения мемантина в биологических жидкостях уделяли внимание такие авторы как Toker S.E., Puente B., Hassan M.G., Zarghi A. Данные исследователи в своих работах использовали флюорометрический детектор, который предусматривает химическую дериватизацию действующего вещества.
На сегодняшний день, наиболее чувствительной методикой определения является масс-спектрометрический детектор. Данный метод был изучен и описан в литературе следующим авторами: Pan R.N., Bharathi P.V., Bhateria M.
В представленной диссертационной работе, исследование сравнительной фармакокинетики и дальнейшее определение биоэквивалентности препаратов Меманейрин и Акатинол Мемантин было проведено впервые по стандартным методикам, используемым в подобных исследованиях.
Цель исследования: разработка методики количественного определения
мемантина методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с
масс-детектированием и проведение сравнительной оценки
фармакокинетических параметров оригинального и воспроизведенного лекарственных средств, содержащих мемантин.
Задачи исследования.
-
Разработать и валидировать методику количественного определения мемантина в плазме крови методом ВЭЖХ с селективным масс-детектированием.
-
Определить динамику концентрации мемантина в плазме крови животных после однократного перорального введения препарата Меманейрин.
-
Установить основные фармакокинетические параметры в плазме крови животных после однократного перорального введения препарата Меманейрин.
-
Провести сравнительную оценку фармакокинетиких параметров в плазме крови добровольцев после однократного приема внутрь препаратов Меманейрин и Акатинол Мемантин.
-
Осуществить сравнительный анализ экспериментальной и клинической фармакокинетики мемантина в плазме крови животных и добровольцев после однократного перорального введения препарата Меманейрин.
Научная новизна исследования. Впервые разработана методика количественного определения мемантина в плазме крови животных и человека методом ВЭЖХ с селективным масс-детектированием. Впервые проведен корреляционный анализ экспериментальной и клинической фармакокинетики исследуемых лекарственных препаратов. Впервые на основе разработанной методики изучена фармакокинетика Меманейрина у животных и проведено сравнительное исследование биоэквивалентности препаратов Меманейрин и Акатинол Мемантин.
Теоретическая и практическая значимость работы. Разработана методика количественного определения мемантина методом ВЭЖХ с селективным масс-детектированием, позволяющая с высокой чувствительностью и точностью определять концентрацию действующего вещества в плазме крови животных и человека. Доказана целесообразность использования данной методики при проведении контроля качества и экспертизы лекарственных средств, содержащих мемантин.
Методология и методы исследования. Дизайн исследования и основные результаты согласуются с основными положениями и принципами проведения
фармакокинетических исследований, а так же разработки и валидации аналитических методов. Работа проводилась с соблюдением правил научных исследований.
Теоретической и методологической основой исследования послужили фундаментальные и прикладные исследования отечественных и зарубежных ученых по данной проблеме, публикации в периодических изданиях, методические рекомендации. Теоретический анализ обзора литературы подкреплялся экспериментальными исследованиями.
Внедрение результатов в практику. Разработанная нами методика количественного определения мемантина методом ВЭЖХ с селективным масс-детектированием используется при проведении научных исследований ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России. Установленная нами биоэквивалентность Меманейрина и Акатинол Мемантин явилась одним из факторов выведения на фармацевтический рынок России воспроизведенного отечественного лекарственного препарата Меманейрин, что соответствует Постановлению Правительства России «О порядке определения взаимозаменяемости лекарственных препаратов для медицинского применения».
Полученные результаты фармакокинетических исследований используются в аналитической и клинической практике Филиала «Клиническая фармакология» Федерального государственного бюджетного учреждения науки «Научный центр биомедицинских технологий Федерального медико-биологического агентства» и на кафедре клинической фармакологии и пропедевтики внутренних болезней ФГБОУ ВО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России. Научные результаты, полученные в ходе проведенных исследований используются в учебном процессе и при проведении научных работ кафедры фармацевтической технологии и фармакологии ФГБОУ ВО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России. Получены соответствующие Акты о внедрении.
Связь диссертации с проблемным планом. Диссертационная работа выполнена в соответствии с тематикой и планом научно-исследовательских работ ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России по теме: «Научный обзор и разработка методов оценки концентрации ЛС в биологических жидкостях» (номер Государственной регистрации – 01.3.009.6593).
Положения, выносимые на защиту:
-
Разработанная методика количественного определения мемантина методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с селективным масс-детектированием в плазме крови, позволяет определять низкие концентрации мемантина в плазме крови крыс и добровольцев после однократного перорального приема препаратов, содержащих мемантин и использовать ее при исследовании фармакокинетики лекарственных средств, содержащих в своем составе мемантин.
-
Результаты сравнительной оценки биоэквивалентности препаратов Меманейрин и Акатинол Мемантин позволяют выявить сходство основных фармакокинетических параметров изучаемых препаратов.
3. Проведенный сравнительный анализ экспериментальной и клинической фармакокинетики после однократного перорального приема препарата Меманейрин животными и добровольцами показывает высокую корреляцию фармакокинетических параметров.
Апробация работы. Основные результаты доложены на: совместной научно-практической конференции Филиала «Клиническая фармакология» НЦ БМТ РАМН, кафедры клинической фармакологии и пропедевтики внутренних заболеваний ГБОУ ВПО Первого МГМУ им. И.М. Сеченова (Москва, 2011); XIX Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2012); IV Всероссийском научно-практическом семинаре молодых ученых с международным участием «Современные проблемы медицинской химии. Направленный поиск новых лекарственных средств» (Волгоград, 2012); II Научно-практической конференции молодых ученых «Научные подходы к повышению качества экспертизы лекарственных средств: реалии и перспективы» (Москва, 2013); VIII Международной научно-практической конференции «Образование и наука без границ» (Польша, 2013), заседании секции № 2 Ученого совета ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России (Москва, 2015).
Личный вклад автора. Автору принадлежит основная роль в разработке методики количественного определения мемантина в плазме крови методом ВЭЖХ с селективным масс-детектированием; подготовке биологического материала к проведению аналитического исследования, анализе биопроб на ВЭЖХ; расчете фармакокинетических параметров с использованием необходимых компьютерных программ; анализе результатов исследования; проведении статистической обработки полученных данных; подготовке научных публикаций; оформлении автореферата и диссертации. Личный вклад автора составляет более 85%.
Публикации. По результатам диссертационного исследования опубликовано 8 печатных работ, в том числе 2 публикации в зарубежной печати и 2 статьи – в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки России.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 132 страницах, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, собственных исследований, заключения, выводов и практических рекомендаций, иллюстрирована 19 рисунками и 27 таблицами и. Библиографический список включает 197 источников литературы, в том числе 145 – на иностранных языках.
Течение и клинические проявления болезни Альцгеймера
Проблема деменций является весьма актуальной, что в значительной мере определяется существующей тенденцией к постарению [41]. Деменция представляет собой тяжелое расстройство высшей нервной деятельности, вызванное органическим поражением головного мозга, и проявляющееся, в первую очередь, резким снижением умственных способностей [163]. Одной из наиболее частых причин деменции является болезнь Альцгеймера (БА) [9] Это заболевание, относящееся к первично-дегенеративным деменциям, характеризуется прогрессирующим снижением когнитивных дисфункций, в первую очередь памяти, и развитием поведенческих расстройств [11, 14, 153]. Предполагается, что всего в мире около 24 миллионов пациентов с БА и в течение ближайших 3-4 десятилетий их количество увеличится втрое [6, 75, 169]. По данным ВОЗ БА входит в десятку болезней, которые являются причиной смертности в развитых странах. БА является смертельным прогрессирующим заболеванием со средней продолжительностью около 8,5 лет между проявлением клинических симптомов и смертью [7]. БА клинически характеризуют прогрессирующей потерей памяти, познавательной способности, мышления, способности к умозаключениям и эмоциональной стабильности, что постепенно приводит к глубоким психическим нарушениям и, в конечном итоге, к фатальному исходу [68].
Современные представления о патогенезе БА включают в себя признание важности нескольких патологических процессов – повреждение и гибель нейронов (апоптоз, аутофагия), нарушение нейрогенеза и межклеточных взаимодействий, развитие нейровоспаления, развитие васкулопатии, тогда как аккумуляция поврежденных белков в равной степени может быть как тригерным механизмом, так и следствием указанных событий [173]. БА представляет собой нейродегенеративное заболевание, которое характеризуется двумя патологическими признаками – наличием в ткани головного мозга сенильных бляшек и нейрофибриллярных клубков. [16, 34, 35]. Бляшки представляют собой внеклеточные отложения амилоида, состоящие в основном из бета-амилоида, образованного путем протеолиза белка предшественника амилоида – секретазами. Различные доказательства дали возможность предположить, что непосредственно патологическое накопление бета-олигомеров амилоида в нервных окончаниях может привести к симпатическому повреждению и в конечном итоге – к нейродегенерации при БА [25, 85]. Нейрофибриллярные клубки являются интранейрональными скоплениями гиперфосфорилированного тау-белка. [79, 92, 183]. По мнению H. Braak и E. Braak [72], патогенетически более значимым процессом, вызывающим гибель нейронов и развитие деменции, является не аномальный амилоидогенез, а накопление гиперфосфорилированного нерастворимого тау-протеина, который составляет основу парноскрученных филамент, образующих нейрофибрилярные клубки. Причем высокий уровень тау белка сопровождается более выраженными когнитивными расстройствами [78].
Доказательством справедливости этой гипотезы служат данные об иерархическом распространении нейрофибриллярной патологии, соответствующей последовательным переходам в развитии болезни от инициальных доклинических симптомов к мягкой и далее к умеренной и тяжелой деменции [72]. Другим нейроморфологическим феноменом, который обнаруживает параллелизм с прогрессированием когнитивного снижения, является уменьшение числа синапсов в лобной и височной коре и в гиппокампе [88]. Была изучена корреляция утраты синапсов в различных морфофункциональных структурах мозга с клиническими проявлениями заболевания. На основании результатов такого анализа высказано предположение, что развитие деменции при БА прямо связано с утратой синаптических контактов в специфических корковых и подкорковых областях мозга [66, 105, 144]. Предположения о патогенетических механизмах БА представлены тремя основными гипотезами – холинергической, гипотезой А-каскада и т.н. тау-гипотезой [65].
Согласно холинергической гипотезе, когнитивное ухудшение, наблюдаемое при БА, в значительной мере обусловлено потерей холинергической функции центральной нервной системой (ЦНС), связанной с ослаблением активности нейротрансмиттера ацетилхолина (Ach) [22].
БА связана с массовой гибелью холинергических нейронов в базальном ядре Мейнерта [69]. Передача сигнала этими нейронами опосредована высвобождающимся из клеток нейромедиатором ацетилхолином (Ach) [145]. В пользу этой гипотезы свидетельствуют данные о том, что при БА в мозге наблюдается снижение синтеза и изменение транспорта Ach, селективная потеря холинергических нейронов, прерывание Ach-рецепторного сигналинга, снижение уровня рецепторов Ach. Действительно, главным симптоматическим лечением БА является применение лекарственных препаратов, ингибирующих активность ацетилхолинэстреазы (отвечающей за снижение уровня Ach), что способствует замедлению скорости прогрессирования БА за счёт увеличения количества Ach и пролонгированию его жизни в мозге [160].
Реактивы и приготовление растворов
Исследование фармакокинетики проводили на беспородных крысах-самцах весом 200 – 250 г. Животных содержали в стационарных условиях при естественном световом режиме и стандартном рационе (комбикорм, вода). Препарат Меманейрин вводили крысам с помощью металлического зонда в дозе 0,8 мг/кг (дозу рассчитывали в соответствие с Руководством по экспертизе лекарственных средств [45]). Исследование лекарственного средства для медицинского применения с использованием животных проводилось в соответствии с правовыми нормами использования животных при проведении доклинических исследований [37]. Пробы крови после декапитации крыс в объеме 6-7 мл отбирали в стеклянные пробирки до и через 1; 1,5; 2; 3; 4; 5; 6; 8; 12; 24; 48; 72 и 96 часов после приема препарата. Пробирки маркировали с указанием шифра животного, номера пробы, названия препарата. Промежуток времени между отбором крови и ее обработка не превышал 5 минут. Плазму отделяли центрифугированием и хранили при температуре -35C до проведения анализа. Пробы с сопроводительным направлением, соответствующие шифру на пробирке, предоставляли в лабораторию.
Исследование БЭ исследуемых препаратов проводили с использованием плазмы крови, получаемой из неврологического отделения ГКБ №23 им. Давыдовского (договор о сотрудничестве № 0-318/12 - ДВ от 27.12.2012), открытым методом по перекрестной и рандомизированной схеме на здоровых добровольцах. Этические аспекты исследования Участие здоровых субъектов в исследовании биоэквивалентности лекарственных препаратов является добровольным. Субъект исследования имеет право отказаться от участия в проводимых исследованиях на любой их стадии. Субъекты исследования подписывают письменное информированное согласие, один экземпляр которого выдается субъекту исследования наряду с «Информацией для субъектов, участвующих в исследовании биоэквивалентности лекарственного препарата».
Тактика ведения субъектов исследования. Во время проведения исследования никакие лекарственные средства не назначаются. В случае необходимости использования других медикаментов в экстренной ситуации субъект исследования выбывает из исследования.
Исследование проводили открытым методом по перекрестной и рандомизированной схеме на здоровых добровольцах.
Для проведения фармакокинетического исследования препаратов было отобрано 18 здоровых добровольцев, мужского (n=8) и женского (n=10) пола (возраст – 36,2±5,5лет; масса тела – 78,2±12,4 кг; рост – 173,6±9,5 см). Демографические и антропометрические характеристики которых представлены в таблице 3.
В качестве добровольцев были привлечены лица, добровольно изъявившие желание участвовать в испытаниях, прошедшие клинико-физиологическое обследование и допущенные к участию в данных испытаниях врачом исследователем. Критериями включения в исследование являлись: - Возраст 18-45 лет; - Масса тела добровольцев не выходит за пределы 20% от «идеальной» массы тела для данного пола, возраста, роста; - Отсутствие патологии желудочно-кишечного тракта, печени, почек, сердечно-сосудистой системы (предварительно проведенные клинико-лабораторные и инструментальные исследования не выявили наличия каких-либо заболеваний); - Для женщин – отрицательный тест на беременность и согласие придерживаться адекватных методов контрацепции; - Наличие информированного письменного согласия добровольца на включение в исследование. Критериями исключения из исследования являлись: - Отягощенный аллергологический анамнез и лекарственная непереносимость; - Кормление грудью; - Хирургические вмешательства в анамнезе на желудочно-кишечном тракте (за исключением аппендэктомии); - Острые инфекционные заболевания (грипп, ОРВИ) менее чем за 4 недели до начала исследования; - Регулярный прием лекарственных препаратов менее чем за 2 недели до начала исследования; - Прием лекарственных препаратов, оказывающих выраженное влияние на гемодинамику, функцию печени и др. (барбитураты, омепразол, циметидин и т.д.), менее чем за 30 дней до начала исследования; - Донорство (450 л крови или плазмы или более) менее чем за 2 месяца до начала исследования; - Прием более чем 10 ед. алкоголя в неделю (1 ед. алкоголя эквивалентна л пива, 200 мл вина или 50 мл спирта) или анамнестические сведения об алкоголизме, наркомании, злоупотреблении лекарственными препаратами; - Курение более 10 сигарет в день; - Участие в другом клиническом испытании препаратов менее чем за 3 месяца до начала исследования. Изучаемые препараты назначали в соответствие в планом рандомизации, представленным в таблице 4.
Отбор проб крови осуществляется из кубитального катетера. Через 10-15 минут после установки катетера, натощак, до применения препарата отбиралась исходная проба крови. После этого добровольцы принимали внутрь 10 мг одного из препаратов (в соответствии с планом рандомизации). Далее отбор крови производился через 1; 1,5; 2; 3; 4; 5; 6; 8; 12; 24; 48; 72 и 96 часов после приема препарата. Прием пищи предлагался спустя 4 часа после приема препарата (стандартный обед). Повторное исследование проводили через 14 дней по идентичной схеме. Кровь в количестве 5 мл отбирали в стеклянные пробирки. Пробирки маркировали с указанием шифра испытуемого, номера пробы, названия препарата. Промежуток времени между отбором крови и ее обработкой не превышал 5 минут. Отобранную кровь центрифугировали при 3000 об/мин в течение 15 минут для отделения плазмы. Отделенную плазму хранили при температуре -35C до проведения анализа. Пробы с сопроводительным направлением (с указанием инициалов испытуемого, пола, возраста, массы тела, роста, соответствующим шифру на пробирке) предоставляли в лабораторию.
Количественное определение мемантина в плазме крови
Как видно из представленных данных истинное содержание препарата в пробах находилось в рассчитанных доверительных границах, а представленная методика количественного определения мемантина в плазме крови свободна от систематических ошибок.
Воспроизводимость результатов с учетом критерия приемлемости достигался во всем интервале концентраций. Критерии приемлемости - Воспроизводимость метода считается удовлетворительной, если средняя величина 6 повторов каждой исследованной концентрации находится в пределах 80 – 120% от номинальной концентрации на каждом ее уровне; - Точность считается допустимой, если коэффициент вариации (CV) при 6 измерениях каждой концентрации не превышает 10% для концентраций свыше 5 нг/мл и 20% - для концентраций ниже 5 нг/мл. Степень извлечения Степень извлечения мемантина из плазмы крови человека определялась путем сравнения площадей пиков проб, экстрагированных из образцов с площадями пиков неэкстрагировнных рабочих стандартных растворов, представляющих 100% извлечение по формуле (2) Нм 100 R = , (2) Hст m где Нст - площадь хроматографического пика стандартного образца в растворе; Нм - площадь пика сывороточного образца той же концентрации после экстракции; m - коэффициент концентрации пробы. Измерение для каждой концентрации стандартов (5, 10 и 25 нг/мл) проводилось в пяти повторах. Полученные значения представлены в таблице 13 и удовлетворяют критериям приемлемости.
Расчет степени извлечения мемантина из плазмы крови человека (или крысы) Площадь пика в растворе 132972 5 нг/мл 246010 10 нг/мл 360126 25 нг/мл Площадипиковконтрольныхобразцов 99256 167436 256079 98492 172132 246230 93471 185831 276493 96211 156938 258215 93265 176240 284652 Ср.значение 96139 171715 264333 Ст. отклонение 2768 10683 15763 CV, % 3 6 6 Степень извлечения, % 72,3 69,8 73,4 Средняя степень извлечения мемантина из плазмы крови составила 71,8%. Критерии приемлемости - степень извлечении анализируемого вещества не должна превышать 100%; - степень извлечения анализируемого вещества должна быть воспроизводимой (СV15%). Таким образом, разработанная методика отвечает основным требованиям, предъявляемым к аналитическим методам, которые используются для определения концентрации лекарственных препаратов в биологических жидкостях [3, 29].
Основной целью фармакокинетических исследований лекарственных препаратов является повышение эффективности и безопасности их использования в клинической практике. Проблемы фармакокинетики: анализ скорости и интенсивности процессов всасывания, распределения по органам и тканям, направленности и количественной оценки процессов биотрансформации, путей и скорости выведения – в последние годы приобретают решающее значение при создании, испытании и разработке оптимального режима фармакотерапии лекарственными препаратами.
Экспериментальное исследование проводилось на беспородных крысах самцах массой 200-250 г. Препарат вводили перорально с помощью металлического зонда, усредненная доза препарата составила 0,8 мг/кг. Кровь для анализа отбирали в дискретные промежутки времени. Концентрацию мемантина в плазме крови животных после однократного приема Меманейрина в дозе 10 мг определяли методом ВЭЖХ с масс-спектрометрическим детектированием (см. гл. 3). Динамика концентраций мемантина после однократного перорального введения у животных представлена в таблице 14 и на рисунке 9. Рисунок 9 – Индивидуальные профили фармакокинетических кривых после введения крысам Меманейрина
Как видно из представленных данных, максимальная концентрация мемантина в плазме крови животных в среднем составляет 20,1±2,2 нг/мл и наступает в среднем через 3 часа после введения препарата. Однако у 4-х животных (№ 3, 8, 9, 12) наблюдается смещение этого показателя на 1 час.
Статистический анализ данных показал, что наблюдается умеренный разброс индивидуальных значений концентраций во всех точках отбора проб (коэффициент вариации CV= 7-31%). Таблица 14 – Динамика концентрации мемантина в плазме крови крыс после однократного перорального введения
Как видно из представленных данных мемантин достаточно быстро всасывается из ЖКТ, затем препарат медленно выводится из организма животных. К 96 часам после введения препарата обнаруживается в среднем 3,1±0,8 нг/мл мемантина. Снижение концентрации мемантина носит биэкспоненциальный характер, предполагая более быструю фазу распределения, сменяющуюся медленной фазой элиминации.
По полученным данным были рассчитаны фармакокинетические параметры. В таблице 15 представлены данные фармакокинетических параметров после однократного перорального введения препарата Меманейрин.
Сравнительный анализ экспериментальной и клинической фармакокинетики мемантина
Пик максимальной концентрации (Cmax) у подопытных животных наблюдался через 3 часа после однократного перорального введения препарата Меманейрин и составляет в среднем 20,3±1,8 нг/мл. У добровольцев максимальная концентрация наступает через 5 часов после приема изучаемого препарата и составляет в среднем 11,97±1,8 нг/мл. У добровольцев значение максимальной концентрации ниже в 1,7 раз, чем у крыс.
Проведенный корреляционный анализ выявил сильную прямую линейную статистически достоверную корреляционную связь между значениями концентрации мемантина в плазме крыс и здоровых добровольцев, что графически представлено на рисунке 18.
График регрессионной зависимости концентрации мемантина в плазме крови крыс и добровольцев после однократного приема (введения) препарата Меманейрин в дозе 10 мг Видно, что линия тренда линейна. Коэффициенты регрессионной зависимости составил 0,8715. В таблице 24 представлены усредненные результаты расчетов фармакокинетических параметров Меманейрин у крыс и добровольцев.
Представленные данные свидетельствуют о том, что средние значения максимальной концентрации (Стах), площади под фармакокинетической кривой (AUCo-), а также коэффициент полуэлиминации (Кабс) препарата Меманейрин после однократного введения животным достоверно не различаются с теми же показателями у добровольцев. Средние значения площади под фармакокинетической кривой (AUC0.t) выше в 1,5 раза у животных, чем у добровольцев. Период полуэлиминации Тт продолжительней у добровольцев, чем у крыс. Объем распределения препарата (условный параметр, характеризующий степень захвата препарата тканями из плазмы крови) у добровольцев в 1,7 раза выше, чем у крыс. Возможно различия фармакокинетики мемантина у крыс и человека, обусловлены в большей степени различиями в метаболизме.
На рисунке 19 приведена сравнительная фармакокинетика мемантина у здоровых добровольцев в % по отношению к животным.
Анализ данных показал, что время достижения максимальной концентрации (Тmax) у добровольцев выше в среднем в 1,5 раза (53,1 %), а значение Cmax у добровольцев ниже, чем у крыс (в среднем в 1,7 раза, - 41,2 %). Период полуэлиминации T1/2 продолжительней у добровольцев (в 1,5 раза, 50,4 %), чем у крыс. Значения площади под фармакокинетической кривой AUCо у добровольцев ниже в 1,6 раза (- 38 %), чем у животных, однако значения площади под фармакокинетической кривой AUCо- практически совпадают. Значения периода полуэлиминации и среднего времени удерживания препарата в организме в 1,5 раза статистически достоверно выше у добровольцев по сравнению с животными, а также значение удельного объема распределения препарата в организме у добровольцев выше в 1,7 раза (66,7 %). При этом скорость всасывания изучаемого препарата одинаковая у крыс и добровольцев (Cmax/AUCо = -1 %).
Выявлены статистически достоверные различия в фармакокинетике мемантина у экспериментальных животных и человека несмотря на то, что, по видимому, обусловлены видовыми различиями в процессах всасывания, метаболизма и выведения препаратов, а именно длиной желудочно-кишечного тракта, активностью ферментов биотрансформации и особенностью выделительной системы, тем не менее имеют сходную направленность. Это особенно важно для моделирования фармакокинетических процессов. Наряду с параметрическими показателями для измерения корреляционной зависимости между признаками применяются и непараметрические показатели. Из непараметрических показателей связи наиболее широкое применение нашел коэффициент корреляции рангов (rs), изложенный К. Спирменом.
В данном исследовании произведен расчет коэффициента ранговой корреляции rs по формуле (3): где d = Rx – Ry – разность между рангами сопряженных значений признаков X и Y; N – число парных членов ряда, или объем выборки.
При этом данный коэффициент основан на учете не знаков отклонений, а их абсолютных значений, поэтому данный коэффициент может принимать значения от -1 до +1. При положительной корреляции он имеет положительный, а при отрицательной – отрицательный знак. Для оценки наличия корреляционной связи рассчитанный коэффициент сравнивали с критической точкой rst, которую определяли по формуле (3) [26]. В данном исследовании мы использовали рассчитанную критическую точку для p = 0,05 и она имела значение 0,58. Данные представлены в таблице 25.
Динамика концентраций 13 0,56 0,901 AUC0_t 12 0,58 -0,858 AUCo- 12 0,58 - 0,552 Сmax 12 0,58 -1,387 Tmax 12 0,58 - 0,154 Tm 12 0,58 -0,609 Kабс 12 0,58 -0,797 MRT 12 0,58 - 0,530 Cl/F 12 0,58 - 0,143 Vss/F 12 0,58 -0,252 Примечание: - корреляция по данным параметрам статистически значима. - корреляция по данным параметрам статистически не значима. Как видно из представленных данных, найденные величины коэффициентов корреляции для AUCo, T1/2, Kабс превосходят значение критической точки для принятого уровня значимости и объема выборки, поэтому корреляцию между сравниваемыми фармакокинетическими параметрами статистически значима.
А для фармакокинетических параметров AUCo-, Cmax, Tmax, MRT, Cl/F, Vss/F величины коэффициентов корреляции не превосходят значение критической точки для принятого уровня значимости и объема выборки, поэтому корреляция между этими параметрами статистически не значима.
Проведенное исследование показывает, что имеется высокая линейная статистически значимая достоверная корреляция между значениями динамики концентрации мемантина в плазме крови крыс и человека. Также наблюдается статистически значимая корреляция между площадью под фармакокинетической кривой, периодом полуэлиминации и константой абсорбции. При проведении фармакокинетических исследований возможно использование крыс в качестве возможной экспериментальной модели человека. Полученные результаты показывают возможность использования крыс в ряде фармакокинетических исследований, вместо человека