Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 12
1.1. Индуцированный мутагенез и его медицинские последствия 12
1.2. Источники генотоксических воздействий 15
1.2.1. Эндогенные 15
1.2.2. Средовые 17
1.2.3. Пищевые 20
1.2.4. Лекарственные 22
1.3. Методология оценки генотоксических повреждений 27
1.3.1. Регистрация первичных повреждений ДНК 27
1.3.2. Регистрация генных мутаций 29
1.3.3. Регистрация хромосомных мутаций 32
1.3.4. Регистрация геномных мутаций 34
1.4. Оценка генотоксичности в системе доклинических исследований безопасности лекарственных средств 36
1.5. Методологические проблемы оценки генотоксических эффектов в половых клетках 41
1.5.1. Методы и подходы к оценке генотоксических эффектов в половых клетках 41
1.5.2. Особенности мужского и женского гаметогенеза как фактор различной чувствительности к генотоксическим воздействиям 47
1.5.3. Методические проблемы детекции цитогенетических нарушений в ооцитах 53
2.Материалы и методы исследования 56
2.1. Материалы 56
2.1.1. Экспериментальные животные 56
2.1.2. Реактивы 57
2.1.3. Расходные материалы 58
2.1.4. Использованные соединения 58
2.2. Методы 62
2.2.1. Метод цитогенетического анализа ооцитов мышей 62
2.2.2. Метод гель-электрофореза изолированных клеток (метод «ДНК-комет») 68
3. Результаты исследования 71
3.1. Разработка метода цитогенетического анализа ооцитов 71
3.1.1. Подбор доз для гормональной суперовуляции 71
3.1.2. Подбор условий гипотонической обработки и спиртовой фиксации 72
3.1.3. Подбор условий гипотонической обработки и фиксации ооцитов параформальдегидом 76
3.1.4. Подбор условий удаления зоны пеллюцида 83
3.1.5. Подбор условий высушивания 85
3.1.6. Подбор условий окрашивания 85
3.2. Цитогенетические эффекты модельных генотоксикантов в ооцитах 88
3.2.1. Колхицин 89
3.2.2. Паклитаксел 89
3.2.3. Этопозид 91
3.2.4. Доксорубицин 95
3.2.5. Мелфалан 96
3.2.6. Циклофосфамид 99
3.2.7. Цисплатин 102
3.2.8. Метотрексат 102
3.2.9. Диоксидин 105
3.3. Цитогенетические эффекты кофеина, акриламида и бисфенола А 107
3.3.1. Кофеин 107
3.3.2. Акриламид 107
3.3.3. Бисфенол А 108
3.4. Оценка мутаген-модифицирующей активности в ооцитах 112
3.4.1. Ацетилцистеин 112
3.4.2. Афобазол 113
3.4.3. Полиоксидоний 117
3.4.4. Бетаин 117
3.5. Оценка уровня повреждений ДНК фолликулярных клеток и ооцитов методом гель-электрофореза отдельных клеток (метод «ДНК-комет») 122
4. Обсуждение результатов 128
5. Выводы 153
6. Практические рекомендации 154
7. Список сокращений 155
8. Список литературы 156
9. Благодарности 184
- Лекарственные
- Методические проблемы детекции цитогенетических нарушений в ооцитах
- Подбор условий гипотонической обработки и фиксации ооцитов параформальдегидом
- Оценка уровня повреждений ДНК фолликулярных клеток и ооцитов методом гель-электрофореза отдельных клеток (метод «ДНК-комет»)
Лекарственные
Интенсивность развития современной фармацевтической промышленности, выпускающей широкий спектр препаратов для лечения различных нозологий, включая препараты новейших классов на основе нанотехнологий или генно-инженерных биологических препаратов, обуславливает постепенное превращение лекарственных средств в существенный компонент среды обитания [26].
У значимого количества фармакологических веществ, были выявлены генотоксические и канцерогенные свойства в различных тест-системах. Обобщенные сведения представлены в монографии А. Д. Дурнева и обзорах G. Brambilla c соавторами [22; 81; 82; 83; 84; 85; 86; 87; 88].
В таблице 4, в качестве извлечения из указанных работ, приведены данные о препаратах некоторых классов лекарственных средств, проявивших позитивные эффекты хотя бы в одной из использованных тест-систем, а также препараты, по которым были получены неоднозначные данные.
Так, из 46 бронхолитических средств, представленных на фармацевтическом рынке, для 25 (54%) не имеется доступных для анализа данных о их генотоксической и/или канцерогенной активности [82]. Из 21 (46%) препарата, оцененного на мутагенную активность, только теобромин, алкалоид растительного происхождения, проявил позитивный результат, индуцируя возникновение генных мутаций в культивируемых клетках млекопитающих in vitro. При этом продемонстрировал противоречивые данные в тестах на микроорганизмах in vitro и цитогенетических исследованиях in vivo. Для шести препаратов была выявлена канцерогенная активность на грызунах in vivo, например, зафирлукаста, зилеутона, салбутамола и сальметерола.
Группа антибактериальных, противовирусных и противогрибковых препаратов является одной из наиболее изученных в плане генотоксической безопасности. В доступной литературе 39 (81%) из 48 препаратов имеют данные исследований генотоксичности и канцерогенности [88]. 16 препаратов продемонстрировали позитивные эффекты хотя бы в одной из использованных тест-систем. Например, такие соединения как аминосалициловая кислота, диданозин и энтекавир индуцировали хромосомные аберрации в лимфоцитах периферической крови человека in vitro. Однако, несмотря на выявленные мутагенные эффекты этих препаратов, большинство из них не изъяты из медицинской практики в силу их незаменимости. Примером может служить отечественный антибактериальный препарат диоксидин, который из-за генотоксической активности применяется только по жизненным показаниям в случаях неэффективности или непереносимости других препаратов [22]. В клиническом исследовании была продемонстрирована возможность купирования мутагенных эффектов диоксидина при сохранении его терапевтической эффективности с помощью соединения с антимутагенной активностью -бемитила, однако данные этого исследования, к сожалению, не получили дальнейшего практического применения [22; 27].
Из 70 антигистаминных препаратов, доксиламин и мепирамин индуцировали повреждения ДНК в тест-системах in vitro и in vivo [81]. Акривастин продемонстрировал кластогенные свойства in vitro, хлорфенамин индуцировал повреждение ДНК в первичной культуре гепатоцитов крыс и хромосомные аберрации в культуре клеток китайского хомячка. Цетиризин и лоратадин проявляли канцерогенную активность на грызунах in vivo.
В группе желудочно-кишечных средств из 71 препарата у половины отсутствуют данные по генотоксичности [84]. Лансопразол и пантопразол проявили канцерогенную активностью и индуцировали хромосомные аберрации in vitro. Также канцерогенную активность на грызунах и индукцию хромосомных аберраций в системе in vitro продемонстрировал фенолфталеин. Препарат дантрон, в некоторых странах используемый самостоятельно или в комбинации с другими препаратами как слабительное средство, проявлял выраженные генотоксические и канцерогенные свойства. Дантрон индуцировал генные мутации у микроорганизмов, ДНК-повреждения и хромосомные аберрации в системе in vitro, проявлял канцерогенную активность в хронических экспериментах на крысах и мышах.
Из 120 анальгезирующих и жаропонижающих средств, представленных на фармацевтическом рынке, около половины 58 (48%) не имели данных о генотоксичности и канцерогенности [87]. 11 препаратов продемонстрировали кластогенные эффекты in vivo. Анальгезирующее средство феназопиридин вызывало генные мутации культивируемых клеток и хромосомные аберрации в системе in vitro, а также проявляло канцерогенную активность у грызунов. Анальгетик дифлунизал вызывал значимое увеличение выхода аберрантных клеток костного мозга мышей. Больше всего данных в этой группе лекарственных средств получено при изучении генотоксических свойств парацетамола и аспирина [87]. Вместе с тем анализ имеющихся данных не позволяет сделать однозначные выводы о генетической безопасности этих препаратов [17; 79; 134]. Так, цитогенетическая активность парацетамола выявлялась только в области токсических и субтоксических доз, тогда как в терапевтических дозировках были получены отрицательные результаты. В проведенных в нашей лаборатории исследованиях не выявлено цитогенетических эффектов и ДНК-повреждающей активности парацетамола в условиях in vivo. При этом методом ДНК-комет были продемонстрированы гепатотоксический эффект препарата [17].
Большое внимание уделяется исследованию генотоксических свойств некоторых групп психотропных веществ. В группах нейролептиков, антидепрессантов и бензодиазепинов, ряд препаратов проявлял генотоксическую активность [83; 86]. 11 препаратов продемонстрировали кластогенные эффекты in vivo, среди них трифлуоперазин и фенелзин. Антипсихотическое средство арипипразол проявлял кластогенные свойства в тест-системах in vitro и in vivo, а также канцерогенную активность у грызунов. При исследовании производных бензодиазепина - диазепама и оксизапама были получены противоречивые данные [22; 86].
В обширной группе антигипертензивных средств из 164 препаратов для 39.6% отсутствовали данные исследований [85]. 32 препарата продемонстрировали позитивный генотоксический ответ хотя бы в одной тест-системе. 10 препаратов проявили как мутагенное, так и канцерогенное действия при испытаниях. Мутагенные свойства проявлял альфа-блокатор феноксибензамин, который индуцировал генные мутации в культивируемых клетках млекопитающих и у микроорганизмов, хромосомные аберрации в культивируемых клетках млекопитающих in vitro, образование микроядер у мышей in vivo, а также обладал канцерогенной активностью. Вазодилататор гидралазин проявлял мутагенное действие в тестах на микроорганизмах, индуцировал генные мутации и повреждение ДНК in vitro. Нитропруссид натрия вызывал индукцию микроядер и генных мутаций в тест-системах in vitro.
Генотоксические свойства на различных тест-системах также выявлены у большого количества антишистоматозных, гормональных, противопаразитарных, иммуносупрессивных и противоопухолевых препаратов [22].
Таким образом, в современной медицинской практике используется значительное количество лекарственных средств, безопасность которых для генетических структур не известна или данные противоречивы или неоднозначны. Несмотря на то, что ежегодно синтезируется большое количество новых химических соединений, тотальная проверка ксенобиотиков на генотоксичность не представляется возможной вследствие огромного объема исследований. Это обусловило внедрение в практику генотоксикологических исследований правила "первоочередности" тестирования, согласно которому обязательному тестированию подлежат существующие и вновь синтезированные лекарственные средства, являющиеся большой группой химических соединений, потребляемых человеком самостоятельно и во многих случаях бесконтрольно [22; 23].
Резюмируя вышеописанное, потенциальные источники генотоксического воздействия на организм человека многочисленны и разнообразны. Негативные медицинские последствия генотоксических воздействий обусловили необходимость разработки методологии, направленной на идентификацию потенциальных генотоксикантов и последующее предупреждение контакта человека с ними.
Методические проблемы детекции цитогенетических нарушений в ооцитах
В итоговом отчете вышеупомянутого VI семинара по генотоксическим испытаниям IWGT вынесено заключение, что в методическом плане основную проблему составляет отсутствие верифицированных и валидизированных методов для оценки мутагенных/генотоксических эффектов в женских половых клетках [265]. Накопленные экспериментальные данные разных независимых лабораторий свидетельствуют о методических сложностях использования в качестве мишени исследования женских половых клеток млекопитающих. На семинаре была заявлена перспективность использования в качестве альтернативного тест-объекта для первичного скрининга химических соединений в половых клетках – ооцитов нематоды Caenorhabditis elegans. Однако с одной стороны, данная модель находится на стадии разработки и накопления фактического материала. С другой стороны, принимая во внимание видовую принадлежность тест-объекта, вызывает сомнение адекватность экстраполяции получаемых результатов на человека.
Для адекватной оценки мутагенных/генотоксических эффектов в половых клетках отечественная научная школа генетической токсикологии рекомендует использовать в качестве тест-систем исключительно млекопитающих [21]. Наиболее адекватно отвечающим задаче, согласно авторитетным мнениям, остается «золотой стандарт» - классический метод цитогенетического анализа [127; 265].
Вместе с тем данные литературы свидетельствуют об ограниченном количестве исследователей, использующих данный метод и его различные модификации в силу требующих усовершенствования недостатков. Впервые суховоздушный метод получения микропрепаратов метафазных хромосом ооцитов мышевидных грызунов был предложен А.Тарковским в 1966 году [247]. Оригинальный протокол включал гипотоническую обработку и последующую фиксацию ооцитов с использованием упрощенного фиксатора Карнуа (3 части абсолютного этилового спирта и 1 часть ледяной уксусной кислоты) на стекле небольшими группами. В ходе применения данного метода были выявлены существенные недостатки, такие как трудоемкость, артефактные потери и невысокое качество хромосомного материала цитогенетических препаратов. Поэтому в дальнейшем метод подвергался различным модификациям. А.П. Дыбаном была предложена методика, предусматривающая использование охлажденного гипотонического раствора хлорида калия и сильно охлажденного фиксатора [112]. В 1976 году Y. Kamiguchi с соавторами предложил модификацию метода с более медленной индивидуальной фиксацией каждого ооцита. Это позволило несколько повысить надежность метода, но исключило возможность анализа большого числа ооцитов [157]. Для увеличения количества одновременно анализируемых ооцитов J.B. Mailhes и Z.P. Yuan в 1987 году была предложена модификация метода с проведением поэтапной мягкой градуальной фиксации в специальных микропробирках [177]. Однако предлагаемая методика требовала большого количества животных и также не исключала дополнительных рисков артефактной потери хромосомного материала. Особо стоить отметить исследователей С.A.Hodges и P.A.Hunt, предложивших использовать в качестве фиксатора 1% раствор параформальдегида с Тритоном Х-100 [147].
Были разработаны и другие различные модификации метода, однако многими исследователями подчеркивалось, что главным недостатком метода остаются артефактные потери хромосомного материала. Следствием являлась недопустимо высокая вариабельность экспериментальных данных: например, по данным разных лабораторий, спонтанный уровень анеуплоидии в ооцитах мышей варьирует - от 2.9 до 29.5% [4; 265]. Также высокую вариабельность демонстрирует выявляемый различными исследователями уровень количественных хромосомных нарушений в МII ооцитах человека - от 4% до 50% [4] . Было выдвинуто предположение, что подобная вариабельность может быть обусловлена факторами, связанными как с процедурой приготовления цитогенетических препаратов хромосом, оказывающих существенное влияние на качество метафазных пластинок, так и с трудностями идентификации при подсчете конденсированных хромосом, следствием чего является завышение или занижение уровня анеуплоидии и соответственно получение ложноположительных или ложноотрицательных результатов.
Следует указать еще один ограничивающий фактор цитогенетического исследования - ограниченное количество выделяемых ооцитов. Так, в условиях гормонально индуцированной суперовуляции максимально возможно получить до 40-45 ооцитов в зависимости от возраста и линии мышей [183]. Соответственно, классический протокол суховоздушной фиксации не может быть применен для столь небольшого количества клеток. Также следует учитывать большие размеры ооцитов (60-80 мкм) и наличие зоны пеллюцида (zona pellucida), так называемой блестящей оболочки, препятствующей изменению объема ооцита в условиях осмотического давления при гипотоническом воздействии.
Данная проблема определила задачи данного исследования - разработку и верифицикацию метода регистрации цитогенетических эффектов в ооцитах мышей, для включения в систему доклинической оценки безопасности лекарственных средств.
Подбор условий гипотонической обработки и фиксации ооцитов параформальдегидом
Вторым по применимости методом фиксации биологического материала после спиртового является фиксация в растворе параформальдегида. В водных растворах параформальдегид деполимеризуется до формальдегида. Формальдегид относится к классу кросс-линкеров, преимуществом которых является возможность сохранения морфологии при фиксации [116]. Качество фиксации кросс-линкерами зависит от рН среды, что учитывалось при подборе условий экспериментов. Ооциты по 20-25, вносили под стереомикроскопом в микрообъемах гипотонических растворов в капли водного раствора 1% параформальдегида, содержащего Тритон Х-100 и дитиотреитол (ДТТ). В данном случае использование стекол с тефлоновым покрытием ограничили фиксатор в пределах лунки, что позволило обеспечить полную неподвижность капель фиксатора при внесении в нее ооцитов и манипуляций со стеклом.
Применение в качестве фиксатора 1% параформальдегида, содержащего 0.2% Тритон Х-100, 1.5 мМ ДТТ [рН 9.2], позволило получить цитогенетические микропрепараты содержащие большее количество метафаз доступных для анализа (58% и более) (таблица 6).
Аналогично первой серии экспериментов были опробованы различные гипотонические растворы при разных сроках обработки.
Как видно из таблицы 6 количество метафаз доступных для анализа на микропрепаратах в этих группах составило 58%, 86%, 90% и 98% соответственно.
Применение цитрата натрия позволило получить 57% ооцитов на стадии метафазы на микропрепаратах, при этом 58% из них были доступны для анализа. 91% ооцитов имели гаплоидное число хромосом. Ооцитов с анеуплоидным набором было зарегистрировано 9% . Однако, как и при первом варианте фиксации, наблюдался чрезмерный разброс хромосом метафазных пластинок по стеклу, что делало их недоступными для анализа (29%). В 13% случаев наблюдалось слипание хромосом.
Цитогенетические препараты лучшего качества удалось получить при замене цитрата натрия на 0.55% хлорид калия с последующей фиксацией параформальдегидом.
Результаты проведенных экспериментов представлены в таблице 6. На микропрепаратах, полученных после гипотонической обработки 0.55% хлоридом калия, не наблюдалось случаев чрезмерного распластывания или разлетевшихся метафазных пластинок (0%), однако в некоторых метафазных пластинках наблюдалось слипание хромосом - в 14% случаях. Пригодных для подсчета метафазных хромосом оказалось 86% ооцитов. Важно отметить, что на микропрепаратах, полученных данным способом приготовления, 100% ооцитов доступных для анализа содержали нормальный кариотип (n=20), анеуплоидных ооцитов (гипоплоидии) выявлено не было. При анализе микропрепаратов метафазных пластинок наблюдались оптимально расправленные удлиненные хромосомы, минимально конденсированные, без наложений (таблица 8).
Комбинированное использование цитрата натрия и хлорида калия в разных вариантах перед данной фиксацией не позволило значимо улучшить качество получаемых микропрепаратов а, напротив, приводило к нарушению морфологии, слипанию хромосом метафазных пластинок (таблица 8). При сочетанном применении гипотонических растворов в соотношении 1:1 в течение 25 минут наблюдалось появление разлетевшихся метафазных пластинок на микропрепаратах, в отдельных случаях с разошедшимися хроматидами.
С целью дальнейшего улучшения качества препаратов был испробован метод гипотонической обработки буферизированными растворами хлорида калия. По литературным данным использование буферизированного гипотонического раствора позволяет значительно улучшить качество цитогенетических препаратов «сложных» в этом плане клеток, в частности эмбриональных стволовых клеток [189]. Оригинальная пропись гипотонического раствора содержит 0.4 % хлорид калия, однако нами были опробованы две концентрации -0.55 и 0.4% растворы.
На микропрепаратах, полученных после гипотонической обработки 0.55% буферизированным хлоридом калия, не наблюдалось случаев чрезмерного распластывания или разлетевшихся метафазных пластинок (0%), однако в некоторых метафазных пластинках наблюдалось слипание хромосом - в 10% случаях. Пригодных для подсчета метафазных хромосом оказалось 90% ооцитов. Цитогенетический анализ не выявил метафаз с гипогаплоидным или гипергаплоидным набором хромосом (0%).
В серии экспериментов с гипотонической обработкой 0.4% буферизированным хлоридом калия выделено и зафиксировано 2864 ооцита, из них 2062 (72%) находились на стадии метафазы II мейоза. В 2% случаях (41 ооцит) наблюдалось компактное распластывание метафаз с наложениями хромосом. Фрагментированных метафазных пластинок, либо отдельно лежащих хромосом выявлено не было. Доступными для цитогенетического анализа оказались 2021 метафазных пластинок (98%). При этом цитогенетический анализ вновь не выявил метафаз с гипогаплоидным или гипергаплоидным набором хромосом (0%).
В экспериментах настоящей работы были опробованы гипотонические растворы буферизированного 0.4 % KCl с рН 7.2 и 8.0. На микропрепаратах, полученных после обработки гипотоническим раствором [рН 8.0] наблюдали в некоторых случаях разлетевшиеся метафазные пластинки на микропрепаратах. Таким образом, для дальнейших экспериментов был отобран буферизированный хлорид калия [рН 7.2].
В процессе поиска оптимального состава фиксатора также изучали влияние различных концентраций от 0.2 до 0.6% неионного детергента Тритон Х-100, применяемого в цитологии для удаления мембранных фосфолипидов в процессе растворения мембран. Результаты исследований продемонстрированы в таблице 9. Показано, что изменение концентрации Тритона Х-100 не влияло на качество полученных микропрепаратов. Однако следует подчеркнуть, что проведенные эксперименты показали, что наличие Тритона Х-100 и ДТТ в фиксирующей смеси является обязательным условием получения препаратов с качественной морфологией метафазных хромосом.
Подбор оптимального рН раствора фиксирующей смеси проводили в диапазоне 7.2-9.2. Было показано, что снижение показателя рН раствора параформальдегида приводило к ухудшению морфологии и окрашиваемости хромосом (таблица 9).
Еще одним представителем фиксаторов относящихся к классу кросс-линкеров является глутаровый альдегид. Однако в проведенных экспериментах с использованием в качестве фиксатора 1% водного раствора глутарового альдегида в течение двух часов оболочки ооцитов не растворялись (данные не представлены). Было показано, что качество цитогенетических препаратов улучшается в ряду: 0.3% цитрат натрия 0.55% хлорид калия 0.55% буферизированный хлорид калия 0.4% буферизированный хлорид калия.
Таким образом, препараты наилучшего качества стабильно (16 независимых серий экспериментов) получаются при использовании в течение 15 минут в качестве гипотонического раствора буферизированного 0.4% хлорида калия с 10 мМ HEPES-КОН и 1 мМ MgCl2 [pH 7.2].
Оценка уровня повреждений ДНК фолликулярных клеток и ооцитов методом гель-электрофореза отдельных клеток (метод «ДНК-комет»)
В ходе приготовлении цитогенетических препаратов ооциты ферментативно высвобождаются из ооцит-кумулюсного комплекса, при этом кумулюсные (фолликулярных) клетки исключаются из дальнейшего эксперимента. Клетки кумулюса окружают ооцит и образуют с ним единый комплекс, сохраняющийся и после овуляции. Взаимодействие между кумулюсными клетками и ооцитом является двунаправленным и происходит в течение всего развития фолликула. Кумулюсные клетки осуществляют многие свои функции за счет межклеточных взаимодействий через щелевые контакты между собой и с зоной пеллюцида ооцита, играя важную роль в его развитии, питании и приобретении компетентности к созреванию. Исходя из этого представилось обоснованным проведение наряду с оценкой в ооцитах цитогенетических эффектов соединений, параллельной оценки их генотоксической активности в кумулюсных клетках методом ДНК-комет.
В таблице 45 представлены результаты исследования влияния модельных мутагенов на уровень ДНК-повреждений кумулюсных клеток.
У животных группы негативного контроля медиана (Ме) показателя ДНК-повреждений составила 1.6 % ДНК в хвосте, интерквартильный размах [Q25%; Q75%] - [0.3; 3.4] (рисунок 22).
В экспериментах с введением колхицина в дозах 0.3, 0.4 и 4.0 мг/кг, показатель уровня ДНК-повреждений в кумулюсных клетках составил 0.74 [0.21; 1.9], 0.03 [0; 0.54], 0.73 [0.15; 3.1] % ДНК в хвосте, соответственно. При этом выявлено снижение показателя ДНК-повреждений в опытных группах, статистически значимые различия с показателем в контрольной группе (критерий Краскела-Уоллиса, р 0.001).
В кумулюсных клетках животных обработанных паклитакселом в дозах 2.5 и 7.5 мг/кг, уровень ДНК-повреждений зарегистрирован на уровне 0.69 [0.16; 1.6] и 0.23 [0; 0.51] % ДНК в хвосте. Сравнение полученных данных с показателем уровня ДНК-повреждений в контрольной группе выявило статистически значимые различия (р 0.001).
В экспериментах с введением этопозида в дозах 10, 40 и 60 мг/кг, показатель уровня ДНК-повреждений в кумулюсных клетках составил 0.36 [0; 1.1], 4.4 [1.5; 6.9], 2.6 [0.78; 5.4] % ДНК в хвосте, соответственно. При этом выявлено снижение показателя ДНК-повреждений в группе животных обработанных этопозидом в дозе 10 мг/кг, статистически значимые различия с показателем в контрольной группе (р 0.001). У животных, обработанных этопозидом в дозах 40 и 60 мг/кг, напротив, наблюдалось увеличение показателя уровня ДНК-повреждений, однако статистически значимые различия (р 0.001) были выявлены только в группе животных обработанных этопозидом в дозе 40 мг/кг (рисунок 23).
В кумулюсных клетках животных обработанных циклофосфамидом в дозе 80 мг/кг одновременно с введением ХГ, уровень ДНК-повреждений зарегистрирован на уровне 0.99 [0; 2.3] % ДНК в хвосте, что статистически значимо отличалось от показателя в контрольной группе (р 0.001). При использовании соединения за 8 и 24 часа до ХГ, показатель уровня ДНК-повреждений в кумулюсных клетках составил 1.7 [0.7; 2.9] и 0.53 [0.22; 1.1] % ДНК в хвосте, соответственно.
Уровень поврежденности ДНК кумулюсных клеток животных, получавших цисплатин в дозах 5.0, 7.5, 10.0 мг/кг, составил 0.3 [0; 0.99], 2.2 [1.2; 3.3], 1.8 [0.79; 3.0] % ДНК в хвосте, соответственно. Выявлено снижение показателя ДНК-повреждений в группе животных обработанных цисплатином в дозе 5.0 мг/кг, статистически значимые различия с показателем в контрольной группе (р 0.001). Сопоставление полученных данных для других доз соединения с показателем негативного контроля не выявило статистически значимых отличий.
В кумулюсных клетках животных обработанных диоксидином в дозе 300 мг/кг одновременно с введением ХГ, уровень ДНК-повреждений зарегистрирован на уровне 0.89 [0.32; 1.6] % ДНК в хвосте, что статистически значимо отличалось от показателя в контрольной группе (р 0.001). При введении соединения за 4 часа до ХГ, наблюдалось статистически значимое (р 0.05) увеличение показателя уровня ДНК-повреждений, составившего 2.4 [1.3; 4.4] % ДНК в хвосте, относительно показателя группы контроля.
В ряде экспериментальных исследований была продемонстрирована применимость метода ДНК-комет для оценки первичных повреждений ДНК в ооцитах [71; 128; 246]. Этапом настоящего исследования явилась оценка ДНК-повреждающего действия модельных мутагенов в ооцитах мышей методом ДНК-комет.
В первой серии экспериментов животных обрабатывали этопозидом в дозе 40 мг/кг. Получали микропрепараты ооцитов с предварительно удаленной зоной пеллюцида. На окрашенных микропрепаратах наблюдали полностью диффундировавший по всему гелю хроматин (рисунок 24).
Поэтому следующим этапом работы, было получение микропрепаратов с ооцитами с сохраненной зоной пеллюцида. Сохранение зоны пеллюцида предотвращало диффузию хроматина в гель за счет формирования полости в агарозе, однако размеры полученной полости не позволяли сформировать соответствующий нуклеоид, характерный для ДНК-комет соматических клеток. Как видно на цифровом изображении с микропрепарата ДНК-комет (рисунок 25), полость сформированная ооцитом на стадии мейоза (60-80 мкм), в несколько раз превосходит размеры полости образованной соматической клеткой. Таким образом, точка формирования хвоста кометы ооцита, состоящего при щелочной версии, из петель и фрагментов однонитевой ДНК, растянутых под действием электрического поля, может быть в середине полости агарозы, что приведет к искажению истинной картины профиля интенсивности флуоресценции (рисунок 25, рисунок 26). Имеющиеся на сегодняшний день программное обеспечение не позволяют обрабатывать соответствующие параметры ДНК-комет такой формы.
Таким образом, проведенные эксперименты показали, что метод ДНК-комет без соответствующих модификаций малопригоден для использования кумулюсных клеток в качестве тест-объекта. Метод ДНК-комет классическом варианте также продемонстрировал неприменимость для оценки ДНК-повреждений в ооцитах.