Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Структура, свойства и фармакологическая активность не крахмальных полисахаридов (обзор литературы) 11
1.1 Общая характеристика некрахмальных полисахаридов 11
1.2 Структура и свойства некрахмальных полисахаридов 12
1.3 Фармакологические эффекты некрахмальных полисахаридов 20
1.4 Пектиновые олигосахариды: методы получения и физиологические свойства 33
Глава 2 Материалы и методы 42
Глава 3 Технология получения и характеристика низкомолекулярных пектинов и альгинатов 58
3.1 Получение низкомолекулярных пектинов и альгинатов 58
3.1.1 Выделение пектина из морской травы Phyllospadix iwatensis .. 58
3.1.2 Выделение олигогалактуронидов из продуктов гидролиза пектина 60
3.1.3 Получение низкомолекулярных образцов альгината натрия 64
3.2 Молекулярно-массовое распределение высокомолекулярных и низкомолекулярных пектинов и альгинатов 70
3.2.1 Молекулярно-массовое распределение пектина из Phyllospadix iwatensis, его гидролизата и олигогалактуронидов... 70
3.2.2 Молекулярно-массовое распределение альгината, его гидролизата и олигоуронидов 72
Глава 4 Оценка кишечной проницаемости для пектина из Phyllospadix iwatensis, альгината и их низкомолекулярных производных на модели изолированной кишки крыс ex vivo 77
Глава 5 Антитоксические свойства низкомолекулярных пектинов и альгинатов з
5.1 Металл-связывающая активность низкомолекулярных и высокомолекулярных пектинов и альгинатов 82
5.1.1 Кадмий-связывающая активность пектинов и альгинатов 83
5.1.2 Свинец-связывающая активность пектинов и альгинатов 85
5.2 Антиоксидантная активность пектинов и альгинатов 89
5.2.1 Восстанавливающая активность пектинов и альгинатов 90
5.2.2 Ингибирование Fe -аскорбатиндуцированного окисления твина-80 до малонового диальдегида пектинами и альгинатами.. 91
5.3 Влияние пектинов и альгинатов на токсичность циклофосфамида 96
5.3.1 Влияние пектинов и альгинатов на лейкопеническое действие циклофосфамида у интактных мышей 97
5.3.2 Влияние пектинов и альгинатов на эффективность циклофосфамида при экспериментальной карциноме легких Льюис у мышей 100
5.3.3 Влияние альгинатов на лейкопеническое действие циклофосфамида у мышей с карциномой легких Льюис 106
Заключение 111
Выводы 120
Список литературы
- Фармакологические эффекты некрахмальных полисахаридов
- Выделение пектина из морской травы Phyllospadix iwatensis
- Кадмий-связывающая активность пектинов и альгинатов
- Влияние пектинов и альгинатов на лейкопеническое действие циклофосфамида у интактных мышей
Фармакологические эффекты некрахмальных полисахаридов
Пектиновые полисахариды. Пектиновые полисахариды являются структурными элементами первичных клеточных стенок и межклеточного пространства высших растений, функционирующими в качестве гидратирующего агента и цементирующего материала целлюлозной сети. Они составляют треть сухой массы клеточных стенок, и самая высокая концентрация обнаруживается в срединной пластинке с постепенным снижением от первичной клеточной стенки к плазматической мембране. В стенке вегетативных тканей и зернах злаков пектиновые полисахариды являются минорными компонентами, хотя существенные количества обнаружены в клеточной стенке эндосперма риса (3%) и в кукурузных отрубях (9%) (Senechal et al., 2014). Основная цепь пектинов состоит из а-(1— 4)-связанных остатков D-галактуроновой кислоты, прерываемых вставками из (1— 2)-связанных остатков a-L-рамнопиранозы. Рамногалактуро-наны характеризуется разнообразием боковых ответвлений на остатках рамно-зы, состоящими из арабинановых, арабиногалактановых и более сложных комплексов боковых олигосахаридов. Ряд авторов выделяют три типа пектинов: первый - линейный гомополимер, или гомогалактуронан; второй - разветвленный полимер, или рамногалактуронан I; третий - замещенный галактуронан, или рамногалактуронан II (Ridley et al., 2001). Гомогалактуронан состоит из цепи 1,4-связанной a-D-галактопиранозилуроновой кислоты, в которой от 8 до 74% карбоксильных групп могут быть этерифицированы метиловым спиртом. Пектины со степенью этерификации более 50% обозначаются как высокоме-токсилированные, а менее 50% - как низкометоксилированные пектины. Степень полимеризации гомогалактуронановых сегментов в яблочных, свекольных и цитрусовых пектинах составляет от 70 до 100. Рамногалактуронан I состоит из основной цепи рамногалактуронана, в которой от 20 до 80% рамноз могут быть замещены L-арабинанами, D-галактанами или арабиногалактанами. Боковые ветви включают а-1,5- и а-1,3-связанные арабинаны, Р-1,4-связанные или Р-1,3- и Р-1,6-связанные галактаны и арабиногалактаны. В рамногалактуронане I могут присутствовать фрагменты ксилогалактуронана, в котором одиночные остатки ксилопиранозы присоединены к главной углеводной цепи 1,3-связями. Для пектина из морских трав семейства Zosteraceae характерно присутствие апиогалактуронана, в котором остатки D-апиозы присоединяются 1,2- и/или 1,3-связями к остаткам D-галактуроновой кислоты (Оводов, 2009). Рамногалактуронан II состоит из основной цепи с четырьмя боковыми ветвями очень сложной структуры, в состав которой могут входить до 12 различных типов Сахаров (O Neill et аі., 2004). Сложная структура пектинов позволяет получить множество вариантов соединений с разной биологической активностью.
Арабинаны, галактаны и арабиногалактаны - три основных типа нейтральных полисахаридов, сопутствующие пектинам. Арабинаны являются разветвленными полимерами, состоящими из цепи а-1,5-связанных остатков L-арабинозы, содержащими а-1,3- и а-1,2-связанные арабинозные боковые цепи. Они обеспечивают до 9% массы первичной клеточной стенки двудольных растений. Галактаны - в основном линейные /?-1,4-связанные полимеры D-галактозы с редко встречающимися одиночными ветвями L-арабинозы; они обнаруживаются главным образом в цитрусовых пектинах. Арабиногалактаны содержат /?-1,4-связанные галактозные цепи, несущие арабинозные остатки в 3 и 6 положениях, которые дальше замещаются. В стенках растительных клеток ара 18
биногалактаны встречаются в виде двух подтипов. Подтип І в плодах бобовых характеризуется наличием /?-(1— 4) галактановой оси с замещениями 5-связанными и терминальными арабинозными остатками. Подтип II в семенах рапса характеризуется /?-(1— 3,6)-связанными полимерами галактозы, ассоциированными с 3- или 5-связанными остатками арабинозы. В отличие от подтипа I, подтип II не является структурным компонентом клеточной стенки, но ассоциирован с внеклеточным содержимым и плазмалеммой (Wefers et al., 2015). Пектиновые полисахариды применяются в фармацевтической и биотехнологической промышленности, используются в производстве пищи и напитков в качестве загустителей и желирующих агентов, а также коллоидных стабилизаторов. Важное применение пектинов основывается на их способности формировать гели, и это свойство позволяет использовать их в качестве матрикса для удержания и доставки лекарств, протеинов и клеток.
Каррагинаны. Особую группу галактанов составляют анионные полимеры красных морских водорослей, агары и каррагинаны, построенные из линейных цепей галактозы с чередующимися а-(1— 3) и /?-(1— 4) связями. В обоих галактанах / -связанная галактоза находится в / -конфигурации, в то время как а-связанные галактозные остатки в агаре находятся в L-конфигурации, а в кар-рагинанах - в / -конфигурации. В каррагинанах 4-О-замещенный остаток может быть как галактозой, так и ее 3,6-ангидропроизводным. Различают не менее шести типов каррагинанов, различающихся содержанием 3,6-ангидрогалактозы, положением и количеством сульфатных групп. Каппа-каррагинан содержит дисахарид 1,3-связанного Р-/ галактопираноза-4-сульфата и 1,4-связанной 3,6-ангидро-а-/ галактозы. Иота-каррагинан имеет ту же структуру, но во 2-м положении ангидрогалактозного остатка находится вторая сульфатная группа. Лямбда-каррагинан содержит три сульфатные группы. Различные типы каррагинанов могут быть превращены в другие типы щелочной или ферментативной модификацией. Природные каррагинаны редко соответствуют идеализированным структурам; чаще наблюдается комбинация двух и более предельных структур в одной полимерной молекуле даже у одного вида водорослей (СоПёп etal.,2009 .
Альгиновая кислота и ее соли (альгинаты) - основные полисахариды морских бурых водорослей. Они состоят из остатков /Ш-маннуроновой и a-L-гулуроновой кислот, соединенных 1,4-связями. Полимерная цепь альгинатов состоит из гомополимерных полиманнуроновых и полигулуроновых блоков, между которыми могут находиться чередующиеся остатки обеих кислот. Отношение остатков маннуроновой кислоты к остаткам гулуроновой кислоты у разных водорослей варьирует от 0,34 до 1,79. Альгинаты способны к формированию геля при низких значениях рН (кислые гели) и при взаимодействии с одно-, двух- (кальций) и трехвалентными (железо) металлами. Для образования геля требуются концентрации полисахарида в растворе не менее 0,2%, при этом, чем больше в полисахариде гулуроной кислоты, тем выше прочность геля, которая линейно возрастает с увеличением молекулярной массы до 400-500 KAa(d Ayalaetal.,2008).
Фукоиданы - фукозосодержащие сульфатированные полисахариды, находящиеся во внеклеточном матриксе бурых водорослей, в яйцевых оболочках морских ежей и стенке тела голотурий. Выделяют два типа фукоиданов. Тип I состоит из 1,3-связанных остатков a-L-фукопиранозы, а тип II построен из чередующихся 1,3- и 1,4-связанных остатков a-L-фукопиранозы. Главные цепи обоих типов могут содержать углеводные (L-фукопиранозу, D-глюкуроновую кислоту) и неуглеводные (сульфатные и ацетильные группы) компоненты. В качестве минорных компонентов могут присутствовать галактоза, глюкоза, манноза, ксилоза и глюкуроновая кислота (Cumashi et al, 2007).
Хитозан - полимер (3-1,4-2-амино-2-дезокси- -глюкозы, получаемый из хитина наружного скелета ракообразных и клеточных стенок грибов, насекомых и дрожжей. При деацетилировании хитина ацетильные группы удаляются, в результате образуется новое соединение (хитозан) с большим количеством химически реактивных аминогрупп. Полимерная цепь хитозана содержит более 5000 ацетилглюкозаминовых и глюкозаминовых остатков, что соответствует молекулярной массе около 1000 кДа. По структуре хитозан напоминает целлюлозу, и различие между ними состоит в том, что хитозан в положении С-2 содержит аминогруппу, а в целлюлозе в этом положении находится гидроксиль-ная группа. Благодаря положительному заряду молекулы хитозана способны связываться с отрицательно заряженными молекулами липидов, белков и других макромолекул. Высокомолекулярные хитозаны обладают большой вязкостью и водонерастворимы. Низкомолекулярные хитозаны, получаемые путем химического или ферментного гидролиза, обладают низкой вязкостью, растворимы в воде и в той или иной степени могут абсорбироваться в кишечнике млекопитающих (Younes, Rinaudo, 2015).
Выделение пектина из морской травы Phyllospadix iwatensis
Определение металл-связывающей активности пектинов, альгинатов и их производных in vitro. В емксть объемом 20,0 мл вносили 0,08-2,7 мл 0,1 М раствора кадмия или свинца, 1,0 мл 1 М ацетатного буфера с необходимым значением рН и 10,0 мл раствора уронидов с концентрацией 5 мг/мл. Фактическая концентрация металлов в смеси составляла 0,93-7,46 г/мл. рН среды корректировали 0,1 М раствором гидроксида натрия и (или) НС1 . Объем смеси доводили до 20,0 мл дистиллированной водой. Смесь инкубировали при перемешивании в течение 100 мин. Жидкую фазу отделяли от образовавшегося плотного гелеобразного осадка фильтрацией через мембранный фильтр с диаметром пор 5 мкм. Концентрацию свинца и кадмия в фильтрате определяли на атомно-адсорбционном спектрофотометре Shimadzu АА-6800 (Shimadzu, Япония). Количество связавшегося кадмия или свинца вычисляли по формуле: q=V(C0-Ce)/M, где q - количество связавшегося сорбентом металла, мг/г; V - объем раствора в инкубационной емкости, л; Со - начальная концентрация металла в растворе, мг/л; Се - равновесная концентрация металла в растворе, мг/л; М - масса уро-нида, г.
По результатам эксперимента были построены изотермы сорбционного равновесия согласно сорбционной модели Лэнгмюра. Коэффициент сродства уронидов к ионам кадмия и свинца и их максимальную сорбционную емкость определяли по формуле: где q - связывание ионов кадмия или свинца, мг/г сухой массы уронида; Се -равновесная концентрация кадмия или свинца в растворе, мг/л; к - коэффициент сродства экспериментального образца к ионам кадмия или свинца, л/мг; чтах - максимальное связывание ионов кадмия или свинца в данных условиях, мг/г уронидов.
Исследование абсорбции пектинов, альгинатов и их низкомолекулярных производных в тонкой кишке крыс ex vivo. Методы исследования транспортных и метаболических функций кишечного эпителия, основанные на выделении фрагмента вывернутой тонкой кишки крысы, применяются для изучения механизмов всасывания Сахаров, липидов, аминокислот и различных лекарственных веществ (Barthe et al, 1999; Dixit et al., 2012; Luo et al, 2013).
Для исследования фармакокинетки поли- и олигоуронидов у крыс-самцов весом 150-160 г под эфирным наркозом после срединной лапаротомии извлекали фрагменты проксимального отдела тонкой кишки длиной 4 см и промывали буфером Кребса. С фрагментов удаляли серозную оболочку и мышцы, эвер-тировали и фиксировали в инкубационной камере, заполненной буферным раствором Кребса, на экспериментальной установке, разработанной автором. Схема экспериментальной установки приведена на рисунке 5. Внутреннюю полость эвертированной тонкой кишки также заполняли раствором Кребса (рН 6,0). Во внешний раствор, насыщаемый кислородом, вносили образец в конечной концентрации 5-10 мг/мл. Инкубация продолжалась в течение 15, 30, 45, 60, 75, 90 мин при 37С. Для оценки жизнеспособности фрагментов кишки определяли электрические показатели, такие как потенциал покоя и силу тока при переменном сопротивлении (2000 и 4000 Ом).
Сопротивление ткани кишки рассчитывали по формуле: где AR- сопротивление ткани; aU - разница в напряжении при переменном сопротивлении тока 2000 и 4000 Ом; al - разница в силе тока при переменном сопротивлении тока 2000 и 4000 Ом. В экспериментах использовали фрагменты, ткани которых имели сопротивление 258±10%. і к Схема установки
Определение антиоксидантной активности. Об антиоксидантной активности пектинов и альгинатов судили по их способности восстанавливать трехвалентное железо в условиях in vitro фотометрическим методом FRAP (Ferric Reducing/Antioxidant Power) (Benzie, Strain, 1996) и по ингибированию Fe -аскорбатиндуцированного окисления твина-80 до малонового диальдегида (Коленченко, 2004).
В первом случае к 0,3 мл свежеприготовленного реагента (0,5 мкМ раствор FeCb 6Н20, 0,25 мкМ раствор 2,4,6-трипиридил- s-триазина в 1 мкМ НС1 и 75 мкМ ацетатный буфер, рН 3,6) добавляли 0,04 мл 0,085%, 0,425%, 0,85% или 1,7% раствора исследуемого вещества для получения конечной концентрации 0,1, 0,5, 1,0 и 2,0 мг/мл, соответственно. В контрольную пробу вносили 0,04 мл дистиллированной воды. Через 1, 10, 20, 40 и 60 мин пробы фотометрирова-ли при длине волны 593 нм.
Во втором случае к 2,0 мл 1% твина-80 добавляли 0,2 мл 1 мМ раствора FeS04 7Н20, 0,2 мл 10 мМ раствора аскорбиновой кислоты и 0,2 мл 0,13%, 0,65%, 1,3% и 2,6% растворов полисахаридов для получения конечной концентрации 0,1, 0,5, 1,0 и 2,0 мг/мл, соответственно. В контрольную пробу добавляли 0,2 мл дистиллированной воды. Полученную смесь инкубировали при температуре 37С в течение 48 ч. К 2,0 мл смеси приливали 1,0 мл 40% раствора трихлоруксусной кислоты, оставляли на 60 мин при комнатной температуре и центрифугировали при 8000 об./мин в течение 15 мин. К 1,0 мл надосадочной жидкости добавляли 2,0 мл 0,25% раствора тиобарбитуровой кислоты и помещали в кипящую водяную баню на 15 мин. Пробирки охлаждали, и оптическую плотность измеряли при длине волны 532 нм.
Экспериментальные модели. Эксперименты на лабораторных животных проводили на самцах и самках беспородных белых мышей (массой 20-30 г) в виварии Института биологии моря им. А.В.Жирмунского Дальневосточного отделения РАН и на мышах-самцах линии C57BL/6 (массой 19-26 г), полученных из Отдела экспериментального биомоделирования НИИ фармакологии и регенеративной медицины им. Е.Д.Гольдберга Сибирского отделения РАН (сертификат качества № 188-05). Содержание животных осуществляли по правилам, принятым Европейской Конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей. Эксперименты проводили в соответствии с приказом Министерства здравоохранения РФ № 267 от 19.06.2003 г. «Об утверждении правил лабораторной практики» и «Руководством по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» (Москва, 2005). Дизайн экспериментов одобрен Этическим комитетом ИБМ ДВО РАН. По окончании экспериментов животных умерщвляли дислокацией шейного отдела позвоночника, соблюдая «Правила проведения работ с использованием экспериментальных животных».
Эксперимент с циклофосфамидом. Опыты продолжались в течение 14 суток. С 1-го дня контрольным животным внутрижелудочно с помощью зонда вводили 0,3 мл дистиллированной воды. На 4-е сутки опыта второй группе животных внутримышечно однократно вводили циклофосфамид в дозе 150 мг/кг массы в 0,1 мл воды для инъекций. Третьей группе животных вводили тестируемые поли- и олигосахариды с 1-го дня внутрижелудочно в 0,3 мл дистиллированной воды ежедневно, и на 4-е сутки им же вводили однократно циклофосфамид в той же дозе. Еще через 10 суток опыт прекращали, животных умерщвляли, и показатели периферической крови определяли стандартными гематологическими методами (Гольдберг и др., 1992).
Кадмий-связывающая активность пектинов и альгинатов
При вычислении свинец-связывающей емксоти экспериментальных образцов было установлено, что она значительно выше кадмий-связывающей активности, в среднем в 2 раза. Связывание ионов свинца также зависела от рН среды. У полигалактуронида А этот показатель при рН 6,0 в 2,5 раза больше, чем при рН 2,0, у полигалактуронида В в 1,53 раза, у октагалактуронида С в 3,14 раза и у гептагалактуронида D в 3,1 раза. При этом, также, как и в случае с ионами кадмия, наиболее эффективным сорбентом иона свинца при всех рН среды оказался полигалакутронид В (Mw 112,21 кДа). Неожиданным результатом оказался тот факт, что сорбционная емкость полигалактуронида В при рН 2,0 сохранялась на достаточно высоком уровне, тогда как все остальные вещества демонстрируют значительное снижение связывающей активности, а у образца олигоуронида Н с Mw 3,64 кДа она полность отсутствовала.
Максимальная свинец-связывающая емкость октагалактуронида С и гептагалактуронида D при рН 6,0 была ниже таковой полигалактуронида А, но всего лишь на 5,7% и 3,4%, соответственно, и ниже активности полигалактуронида В на 11,6% и 9,81%, соответственно.
Коэффициент сродства октагалактуронида С к ионам свинца выше такового полигалактуронида А в 2,1 раз и полигалактуронида В - в 7,1 раза. Этот же показатель у гептагалактуронида D выше, чем у полигалактуронида А в 2,2 раза и полигалактуронида В - в 7,6 раза (Таблица 10).
Высокомолекулярный альгинат натрия показал сорбционную активность по отношению к ионам свинца на уровне октагалактуронида С и гептагалактуронида D. Максимальная свинец-связывающая емкость полиуронида G при рН 6,0 превышала этот показатель полиуронида F на 5,6%. В этих же условиях максимальная связывающая емкость по свинцу олигоуронида Н ниже таковой полиуронида F на 52,2%, а полиуронида G на 54,7%. Коэффициент сродства полиуронида F к ионам свинца при рН 6,0 ниже, чем у высокомолекулярного альгината натрия на 45,5%. Этот же показатель у полиуронида G больше, чем альгината натрия в 4,8 раза и больше, чем у полиуронида F в 8,8 раза. Наконец, у олигоуронида Н коэффициент сродства к ионам свинца меньше, чем у альгината натрия на 52,5% и практически такой же как у полиуронида F.
Таким образом, полученные низкомолекулярные пектины, октогалактуронид С и гептагалактуронид D, средневесовая молекулярная масса которых в 82,6 раза и 89,7 раза меньше средневесовой молекулярной массы нативного пектина, сохраняют, а в некоторых случаях превышают металл-связывающую емкость нативного высокомолекулярного пектина, выделенного из морской травы P. iwatensis. Низкомолекулярные альгинаты натрия, полиуронид G и олигоуронид Н, имея средневесовую молекулярную массу в 13,6 раза и 92,3 раза меньше таковой высокомолекулярного альгината натрия, обладают максимальной кадмий-связывающей емкостью в 1,6 и 2,5 раза меньше, а максимальной свинец-связывающей емкостью - в 2,8 и 6,3 раза.
Антиоксидантную активность некрахмальных полисахаридов ранее исследовали на различных моделях. На экспериментальных животных проводились опыты по оценке профилактического и лечебного действия высокомолекулярных полисахаридов на модели окислительного стресса, вызванного активаторами перекисного окисления липидов, такими как тетрахлорметан, ацетат свинца и этиловый спирт, которые, несмотря на различные начальные механизмы повреждающего действия, в конечном итоге активируют перекисное окисление липидов. Было установлено, что высокомолекулярные пектины, альгинаты, хитозан и фукоидан в условиях in vivo способствуют нормализации биохимических показателей прооксидантных и антиоксидантных систем. На модели Ре2+-аскорбатиндуцированного перекисного окисления липидов мембран гепатоцитов было показано, что перечисленные полисахариды при энте-ральном введении животным оказывают антиокислительное действие. На экспериментальных in vitro моделях оценивалась восстанавливающая активность полисахаридов методом FRAP и по ингибированию Fe 90
аскорбатиндуцированного окисления твина-80 до малонового альдегида. Было показано, что максимальной восстанавливающей способностью обладают пектин, выделенный из морской травы Zostera marina, и фукоидан, выделенный из бурых морских водорослей Laminaria saccharina, менее выраженной активностью - цитрусовый пектин и лямбда- и каппа-каррагинаны, а наименьшей активностью - хитозан и альгинат натрия (Хасина и др., 2003; Коленченко, 2004; Коленченко и др., 2005; Хотимченко, Коленченко, 2007). На этих моделях эффект полисахаридов был более выражен, чем таковой у лекарственных препаратов эмоксипина и милдроната
В ряде работ показано, что в проявлении антиоксидантной активности полисахаридов важную роль играет молекулярная масса (Zhou et al, 2008; Hwang et al., 2010), причем способность захватывать супероксидные радикалы увеличивается с уменьшением молекулярной массы полисахарида (Qi et al., 2005). Исследование фукоиданов, выделенных из L. japonica, показало, что их антиоксидантная активность связана не только с величиной молекулярной массы, типом доминирующего сахара, степенью разветвления и общим содержанием сульфатных групп, но и с содержанием глюкуроновой кислоты, фукозы и нейтральных Сахаров (Camara et al, 2011).
В нашем исследовании эффект низкомолекулярных пектинов и альгинатов проверяли методом FRAP, позволяющим провести оценку антиоксидант-ных свойств по восстановлению трехвалентного железа в условиях in vitro. На первом этапе исследовали кинетику образования двухвалентного железа. На рисунках 25 и 26 приведены кривые, иллюстрирующие процесс восстановления железа во времени, позволяющие провести количественную оценку антиоксидантной активности исследуемых соединений. Уже через 1 мин после добавления в среду с трехвалентным железом пектинов в конечной концентрации 2 мг/мл образовалось двухвалентного железа в среднем от 24,6% до 26,9% от того количества, которое накапливалось за 60 мин инкубации. Через 10 мин эти значения составляли 43,6-44,3%, через 20 мин - 69,4-71,4% и через 40 мин - 83,4-86,6% (Рисунок 25). Примерно такую же картину наблюдали при внесении в инкубационную среду альгинатов натрия: через 1 мин образовывалось 29,8-31,0% двухвалентного железа, через 10 мин - 46,8-53,4%, через 20 мин - 72,6-75,7% и через 40 мин - 85,0-88,7% (Рисунок 26).
Зависимость восстанавливающей активности полисахаридов от их концентрации в среде показана на рисунках 27 и 28. Эффект и пектинов и альгинатов определенно зависел от внесенной в инкубационную среду дозы полисахаридов. Кроме того, сравнение эффектов пектинов показало, что наибольшую восстанавливающую активность проявил октагалактуронид С (Mw 3,94) и наименьшую активность проявил нативный пектин (Mw 325,45 кДа) из морской травы P. iwatensis (Р 0,05) (Рисунок 27).
Из альгинатов наибольшую восстанавливающую активность проявил олигоуронид Н со средневесовой молекулярной массой 3,64 кДа, промежуточное положение занял полиуронид G со средневесовой молекулярной массой 24,70 кДа, и наименьшую из трех образцов проявил высокомолекулярный аль-гинат натрия (Mw 335,94) (Рисунок 28).
Влияние пектинов и альгинатов на лейкопеническое действие циклофосфамида у интактных мышей
Третья модель токсического воздействия была выбрана, исходя из известных фактов о высокой токсичности противоопухолевых лекарственных препаратов и точных данных об их токсических дозах. Циклофосфамид - противоопухолевый препарат широкого спектра действия с высокой противоопухолевой активностью и не менее высокой токсичностью (Morandi et al., 2005; Schwartz et al., 2005; Amudha et al., 2007; Chamorro-Cevallos et al, 2008; Xu, Zhang, 2015). Оценивали влияние полисахаридов и олигосахаридов на лейкопе-нический эффект циклофосфамида. Проведенные исследования показали, что пектины и альгинаты способны ослабить цитотоксические эффекты циклофосфамида, связанные с подавлением им лейкопоэза. Мы считаем, что это может быть результатом прямого связывания циклофосфамида молекулой полисахарида и вследствие этого снижения его концентрации в крови или результатом стимуляции лейкопоэза.
Эксперименты с перевиваемыми клетками карциномы легких Льюис показали, во-первых, что высокомолекулярный полигалактуронид А и полигалак-туронид В со средневесовой молекулярной массой 112,2 кДа не влияют на противоопухолевый и антиметастатический эффект циклофосфамида на модели карциномы легких Льюис у мышей; во-вторых, октагалактуронид С с молекулярной массой 3,94 кДА достоверно ослабляет антиметастатический эффект циклофосфамида; в-третьих, высокомолекулярный альгинат натрия и полиуро-нид G с молекулярной массой 24,70 кДа усиливают антиметастатический эффект циклофосфамида, а олигоуронид Н с молекулярной массой 3,64 кДа и по-лиуронид G с молекулярной массой 24,70 кДа ослабляют лейкопенический эффект циклофосфамида у мышей с карциномой легких Льюис. Последний эффект представляет большой интерес с практической точки зрения, так как дает основание для дальнейших исследований низкомолекулярных альгинатов в качестве корректоров противоопухолевой химиотерапии. Можно предположить, что низкомолекулярные альгинаты оказывают стимулирующее действие на гранулоцитарный росток кроветворения, поврежденный введением цитостатика.
Установлено, что растительные полисахариды, в частности, глюкозами-ногликаны, входящие в состав водорастворимых растительных полисахаридов, способны изменять функциональные свойства лимфоцитов в направлении приобретения ими противоопухолевых свойств (Данилец и др., 2011). Авторы этой работы полагают, что полисахариды замедляют рост первичного опухолевого узла и метастазирования за счет активации Ml клеток (классически активированных макрофагов) и переключения Thl/Th2 в сторону эффективного противоопухолевого иммунного ответа (ТЫ). Лекарственные средства, стимулирующие ТЫ-зависимые иммунологические реакции, используются в иммунотерапии онкологических заболеваний. Механизм снижения гематотоксичности циклофосфамида с помощью альгинатов может быть опосредован стимуляцией иммунной системы организма. Показано, что введение альгината кальция мышам линии BALB/c приводит к стимуляции ТЫ иммунных реакций и подавлению Th2 иммунного ответа (Данилец и др., 2011). Эти эксперименты дали основание для дальнейшего изучения олигоуронида Н со средневесовой молекулярной массой 3,64 кДа, так как его введение приводило к ускоренному восстановлению лейкопоэза.
В клинической онкологии химиотерапия, как правило, проводится курсами, а возникающая при этом длительная лейкопения является препятствием для проведения полноценной терапии. Это является основанием для поиска веществ, влияющих на гемопоэз без снижения противоопухолевой активности. На модели умеренного торможения роста первичного опухолевого узла и метастазов у мышей с карциномой легких Льюис с сопутствующей лейкопенией в периферической крови после 3-х кратном введении циклофосфамида в дозе 83,3 мг/кг было обнаружено усиление противоопухолевого действия циклофосфамида при введении альгината натрия с молекулярной массой 1-10 кДа (Рыбалкина и др., 2012, 2013). Одновременно было обнаружено увеличение количества лейкоцитов и сегментоядерных нейтрофилов в периферической крови мышей. Анализ миелограмм животных с карциномой легких Льюис показал, что на фоне длительной депрессии костномозгового кроветворения, вызванной введением циклофосфамида, альгинат натрия способствовал увеличению числа зрелых и незрелых нейтрофильных гранулоцитов в костном мозге, что свидетельствовало о стимуляции гранулоцитарного ростка кроветворения (Рыбалкина и др., 2015). Было также показано, что введение животным с карциномой легких Льюис альгината натрия с молекулярной массой 1-10 кДа приводит к снижению лейкоцитоза, вызванного опухолевой процессом. В костном мозге этих мышей, получавших альгинат натрия, отмечали увеличение количества гранулоцитарных нейтрофилов на 8-24 сутки и уменьшение числа лимфоцитов на 10, 12 и 24 сутки эксперимента относительно таковых у контрольных животных. Эти результаты наводят на мысль, что в условиях курсового введения циклофосфамида альгинат натрия с молекулярной массой 1-10 кДа препятствует угнетению костномозгового кроветворения, вызванного цитостатиком, и способствует более быстрому восстановлению миелоидного ростка кроветворения.
Важное место в контроле над кроветворением занимает гранулоцитарный колониестимулирующий фактор, действующий на пролиферацию и дифферен-цировку клеток-предшественников гранулоцитарного ростка кроветворения. Экспериментально показано что у животных с карциномой легких Льюис, получавших только альгинат натрия, колониеобразующая активность предшественников гранулоцитопоэза не изменяется, но при совместном введении альгината натрия с циклофосфамидом наблюдается стимуляция активности гранулоцитарных предшественников, подавленной циклофосфамидом. Возможно, один из механизмов ослабления гематотоксичности циклофосфамида под влиянием альгината натрия обусловлен его способностью стимулировать деление и созревание гранулоцитарного колониестимулирующего фактора,в костном мозге мышей с карциномой легких Льюис.
Важную роль в регуляции процессов пролиферации и дифференцировки кроветворных клеток-предшественников играет гемопоэзиндуцирующее микроокружению. Полисахариды повышают функциональную активность клеток микроокружения через активацию макрофагов и синтез цитокинов, ответственных за пролиферацию и дифференцировку клеток-предшественников (Yang, Jones, 2009; Liu et al., 2010). При гемодепрессии, вызванной циклофосфамидом, использование альгината натрия с молекулярной массой 1-10 кДа приводило к стимуляции гранулоцитарного ростка кроветворения за счет активации кло-нальной активности предшественников гранулоцитопоэза в костном мозге мышей с опухолью, в результате чего происходило увеличение количества ней-трофильных гранулоцитов в костном мозге и периферической крови (Рыбалки-наи др., 2015).
Полученные результаты являются основой для проведения дальнейших исследований с низкомолекулярными альгинатами, как перспективными источниками фармацевтических субстанций, снижающих гематотоксичность противоопухолевых препаратов.