Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 8
1.1. Фармакотерапия инсулиннезависимого сахарного диабета 8
1.2. Поиск потенциальных противодиабетических средств в ряду производных бензойных кислот 21
1.3. Фармакологическая активность гуанидиниевой соли 2,4-дихлор-5-карбоксифенилсульфокислоты (гуакарбен, глидифен) 26
2. Материалы и методы исследований 31
3. Результаты исследований 42
3.1. Противодиабетическая активность гуанидиниевой соли 2,4-дихлор-5-карбоксифенилсульфокислоты при длительном применении 42
3.1.1. Введение молодым интактным крысам 42
3.1.1.1. Влияние на уровень тощаковой гликемии 42
3.1.1.2. Влияние на углеводную толерантность и гипогликемический эффект инсулина 43
3.1.1.3. Влияние на метаболические эффекты адреналина 50
3.1.1.4. Влияние на жировой обмен и гликолиз 53
3.1.1.5. Влияние на морфологию поджелудочной железы 56
3.1.2. Введение старым крысам 59
3.1.2.1. Характеристика тест-модели 59
3.1.2.2. Влияние на уровень тощаковой гликемии 61
3.1.2.3. Влияние на углеводную толерантность и гипогликемический эффект инсулина 62
3.1.2.4. Влияние на жировой обмен 65
3.1.2.5. Влияние на морфологию поджелудочной железы 66
3.1.3. Введение крысам со стероидным диабетом 68
3.1.3.1. Характеристика тест-модели 68
3.1.3.2. Влияние на уровень тощаковой гликемии 73
3.1.3.3. Влияние на углеводную толерантность и гипогликемический эффект инсулина 73
3.1.3.4. Влияние на жировой обмен и гликолиз 75
3.1.3.5. Влияние на морфологию поджелудочной железы 77
3.1.4. Введение крысам с аллоксановым диабетом 80
3.1.4.1. Характеристика тест-модели 80
3.1.4.2. Влияние на уровень тощаковой гликемии 88
3.1.4.3. Влияние на углеводную толерантность и гипогликемический эффект инсулина 89
3.1.4.4. Влияние на жировой обмен и гликолиз 91
3.1.4.5. Влияние на морфологию поджелудочной железы 93
3.2. Скрининг гипогликемической активности и острой токсичности в ряду аминопроизводных 2,4-дихлор-5-карбоксифенилсульфокислоты 96
3.3. Скрининг гипогликемической активности и острой токсичности в ряду гуанидиниевых производных фенилсульфокислот 101
3.4. Противодиабетическая активность и острая токсичность структурных аналогов гуанидиниевой соли 2,4-дихлор-5-карбоксифенилсульфокислоты 105
3.4.1. Острая токсичность 105
3.4.2. Влияние на уровень гликемии интактных животных разных видов 106
3.4.3. Влияние на уровень гликемии крыс с аллоксановым диабетом 110
3.4.4. Влияние на углеводную толерантность и гипогликемический эффект инсулина 111
3.4.5. Влияние на метаболические эффекты адреналина 113
3.4.6. Влияние на гликолиз 115
4. Заключение 120
5. Выводы 131
6. Практические рекомендации 132
7. Список сокращений и условных обозначений 133
8. Список литературы 134
- Поиск потенциальных противодиабетических средств в ряду производных бензойных кислот
- Введение крысам со стероидным диабетом
- Противодиабетическая активность и острая токсичность структурных аналогов гуанидиниевой соли 2,4-дихлор-5-карбоксифенилсульфокислоты
- Влияние на метаболические эффекты адреналина
Введение к работе
Актуальность работы.
Сахарный диабет является одним из самых распространенных эндокринных заболеваний и представляет значительную проблему для национального здравоохранения в связи с развитием сосудистых осложнений, приводящих к ранней инвалидности и высокой смертности. Из общего количества таких больных около 90 % приходится на пациентов с диабетом 2 типа, в терапии которого требуется применение пероральных противодиабетических средств.
Существующие препараты: производные сульфонилмочевины, бигуаниды, глитазоны, меглитиниды, ингибиторы -глюкозидазы и дипептидилпептидазы-IV – не лишены серьезных побочных свойств, снижающих их клиническую эффективность и усугубляющих течение основного заболевания. Известно также, что комбинированная терапия имеет ряд преимуществ перед монотерапией диабета, позволяя воздействовать на различные звенья патогенеза заболевания, и менее опасна в плане возможных осложнений. В связи с этим актуальным является поиск противодиабетических веществ, обладающих комбинированным типом действия и низкой токсичностью.
Цель исследования.
Поиск потенциальных сахароснижающих средств среди аминопроизвод-ных 2,4-дихлор-5-карбоксифенилсульфокислоты и гуанидиниевых производных некоторых фенилсульфокислот и изучение противодиабетической активности гуанидиниевой соли 2,4-дихлор-5-карбоксифенилсульфокислоты (гуа-карбен, глидифен) при ее длительном применении на различных тест-моделях в опытах на животных.
Задачи исследования.
-
Изучить гипогликемическую активность и острую токсичность амино-производных 2,4- дихлор-5-карбоксифенилсульфокислоты.
-
Изучить гипогликемическую активность и острую токсичность гуаниди-ниевых производных некоторых фенилсульфокислот.
-
Изучить противодиабетическаую активность и токсичность структурных аналогов гуанидиниевой соли 2,4-дихлор-5-карбоксифенилсульфокислоты.
-
Изучить специфическую активность гуанидиниевой соли 2,4-дихлор-5-кар-боксифенилсульфокислоты (гуакарбен, глидифен) при длительном введении интактным крысам разного возраста, а также животным с аллоксановым и стероидным диабетом.
Научная новизна.
Проведен скрининг 25 производных фенилсульфокислот с определением некоторых качественных характеристик зависимости сахароснижающего эффекта от их структуры.
Впервые проведено углубленное фармакологическое исследование трёх наиболее перспективных веществ – гуанидиниевой соли 2-аминофенил-
сульфокислоты (соед.2ж), дигуанидиниевой соли 2,4-дихлор-5-карбо-ксифенилсульфокислоты (соед.1е) и триэтиламина 2,4-дихлор-5-карбо-ксифенилсульфокислоты (соед.1к).
Впервые изучено противодиабетическое действие гуанидиниевой соли 2,4-дихлор-5-карбоксифенилсульфокислоты (гуакарбен, глидифен) в условиях длительного введения старым интактным крысам, а также крысам с модельным стероидным диабетом.
Практическая значимость.
Среди 25 веществ выявлены активные гипогликемические соединения, превосходящие по выраженности действия некоторые современные противо-диабетические препараты.
Для доклинического исследования в качестве потенциального лекарственного средства терапии сахарного диабета предложена гуанидиниевая соль 2-аминофенилсульфокислоты (соед.2ж).
Материалы и методы исследования.
Опыты проведены на животных обоего пола: 768 аутбредных мышах массой 18–20 г, 1668 нелинейных крысах массой 180–240 г, в том числе – на 768 животных с модельным аллоксановым диабетом и на 204 животных с модельным стероидным диабетом, 30 морских свинках массой 350–550 г, 48 кроликах «шиншилла» массой 2,0–2,5 кг. Все животные поступили из питомника НПО «Биомед» (сертификат качества №121-05). Животные содержались на стандартном пищевом рационе вивария в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» и требованиями Фармкомитета РФ к проведению доклинических испытаний. Опыты на животных выполнены в соответствии с Европейской конвенцией по защите и использованию позвоночных животных для экспериментальных и других целей EST №123 (1986 г.), ст. 37 и ст. 40 Федерального закона «О лекарственных средствах» (1998 г.), «Правилами лабораторной практики в Российской Федерации» (2003 г.). Животные содержались в контролируемых условиях окружающей среды при температуре воздуха +18–26 С, влажности не более 50 %, объеме воздухообмена (вытяжка-приток) – 8:10. В комнате поддерживался 12-часовой цикл освещения. Животные находились в стандартных пластиковых клетках, в качестве подстила использовалась резаная автоклавированная бумага. Регулярно проводилась рутинная проверка подстила на микробиологическое загрязнение. Животные адаптировались в лаборатории в течение как минимум 5 дней до начала введения исследуемых веществ. Животные распределялись по группам рандомизированно. В качестве критерия принималась масса тела, таким образом, чтобы её индивидуальное значение не отклонялось от среднего значения в пределах одного пола более чем на 10 %.
Содержание глюкозы в крови определяли глюкозооксидазным методом (Цюхно З.И., 2000). Содержание общего холестерина, -липопротеидов и триг-лицеридов определяли с помощью наборов реактивов «Olvex» и «Vital» на биохимическом анализаторе «Stat Fax 4500». При выполнении функциональных нагрузочных тестов (Цюхно З.И., 1981) помимо динамики гликемии у крыс
рассчитывали гипергликемический коэффициент Бодуэна по формуле В-А/А, где А – уровень глюкозы в крови натощак, а В – ее максимальная концентрация после нагрузки. Кроме того, по ходу выполнения инсулиновой пробы у крыс вычисляли гипогликемический коэффициент Рафальского по формуле С/А, где А – исходное содержание сахара; С – минимальный уровень гликемии после введения препаратов. Для изучения влияния длительного введения гуакарбена на состояние поджелудочной железы проводили ее патоморфологическое исследование. Ткань фиксировали в 10% – ном растворе нейтрального формалина и заливали парафином по стандартной методике. Депарафинизированные срезы окрашивали гематоксилином и эозином, а также по Гос-Шультце и Ван Гизону. Морфогистологическую картину изменений в поджелудочной железе оценивали на световом исследовательском микроскопе «МБИ-3» и фотографировали на цифровом аппарате модели «Power Shot A 200 Canon» 2.0 MEGA PIXELS AF с помощью заводского набора микрофотонасадок.
Результаты исследований обработаны статистически с определением t-критерия Стьюдента. Данные представлены в виде выборочного среднего М, ошибки среднего m и достигнутого уровня значимости p. Минимальный уровень значимости различий принимали соответствующим p 0,05. Динамика гликемии для каждого животного описывалась как отклонение от исходного состояния (%); для каждой группы животных по этому показателю вычислялось выборочное среднее и его ошибка; именно эти данные приведены в виде (M±m%) (Беленький М.Л, 1963). Статистические расчеты выполнялись при помощи пакетов программ Statsoft Statistica 8,0 и MS Excel 2007.
Апробация работы.
Основные положения диссертации докладывались на IV международной научной конференции «Проблемы здоровья семьи – 2000» (Пермь, 2000), итоговой научной сессии Пермской государственной медицинской академии (Пермь, 2001), 58-й межрегиональной конференции по фармации и фармакологии «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции» (Пятигорск, 2003), VIII международной научной конференции «Здоровье семьи – XXI век» (Пермь, 2004), X международной научной конференции «Здоровье семьи – XXI век» (Пермь, 2006), научной конференции «Фармация и общественное здоровье» (Екатеринбург, 2009), VII международной научно-практической конференции «Наука вчера, сегодня, завтра» (Новосибирск, 2013).
Публикации.
По материалам диссертации опубликовано 23 работы, в том числе – 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК.
Объем и структура диссертации.
Диссертация изложена на 158 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 4 глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы из 218 источников, 94 из которых – работы зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 61 таблицей, 22 рисунками.
Поиск потенциальных противодиабетических средств в ряду производных бензойных кислот
Поиск гипогликемизирующих средств проводится во многих классах соединений. Особый интерес в этом отношении представляют моно- и дикарбоновые кислоты и их производные: соли, амиды, гидразиды и эфиры.
Апробированы сахароснижащие свойства различных ароматических моно-карбоновых кислот [3, 31, 36]. Из ароматических производных протоводиабетиче-ская активность описана у замещенной гидразонпропионовой кислоты [I], 2,2-(4-хлорфеноксигексил-)этокси-карбоксиоксирана [II].
Описано сахароснижающее действие N-(4-гидроксифенил) аминоуксусной [III], феноксиуксусной [IV], фенилуксусной [V], фенилпропионовой [VI], фенил-масляной [VII], фенилкапроновой [VIII], фенилпировиноградной [IX], коричной [X], -метилкоричной [XI] кислот.
В опытах in vitro короткоцепочечные жирные кислоты, замещенные в ос-положении фенильной группой [IV-VIII], уменьшали в гепатоцитах глюконеоге-нез из лактата, пальмитата, пирувата, аланина, глицерина и фруктозы. Причем, с удлинением углеродной цепи ингибирующее действие карбоновых кислот на синтез глюкозы возрастало с 20 % до 90 %. Оксифенильное замещенное аминоуксус-ной кислоты: ]Ч-(4-гидроксифенил) глицин [III] - повышало в мышцах окисление глюкозы и пирувата.
Внутривенное введение фенилпропионовой кислоты [VI] со скоростью 17 мг/мин у здоровых крыс снижало содержание сахара в крови на 54 %, а ее внутрибрюшинная инъекция по 300 мг/кг - на 57 %, уменьшая при этом образование глюкозы из
- аланина в 2 раза. Соединение XI уже в дозе 2 мг/кг на 14 % понижало у них уровень гликемии и на 30 % - глюконеогенез, одновременно снижая лактат- и кетонемию, причем, не только у крыс, но и у морских свинок и кроликов. Введение последним М-(4-гидроксифенилглицина [III] активизировало периферическую утилизацию глюкозы и задерживало продукцию молочной кислоты.
У крыс со стрептозотоциновым диабетом фенилпропионовая кислота [VI] снижала концентрацию сахара в крови при внутривенном введение со скоростью 17 мг/мин на 23 %, а у аллоксандиабетических животных через 6 часов после внутрибрюшинной инъекции по 300 мг/кг уменьшала уровень гипергликемии на 80 %, в 4 раза подавляя при этом синтез глюкозы из 14С-аланина и холестерина -из 14С-ацетата.
Показана способность [транс-4-(4-метилциклогексил)-4-оксимасляной кислоты повышать продукцию инсулина в перфузируемой поджелудочной железе, а у крыс со стрептозотоциновым диабетом - нормализовывать раннюю фазу инсулиновой секреции. В дозе 50 мг/кг у здоровых и диабетических крыс она улучшала показатели глюкозотолерантного теста.
Обнаружена способность 3-(n-4-хлорфенил)-4-аминобутановой кислоты [XII] повышать включение Д-14С-глюкозы в фибробласты кожи человека и подавлять окисление жирных кислот и синтез холестерина [65].
Многообещающим представлялось создание комбинированных бигуанидных препаратов. Еще в 1977 году были исследованы гипогликемические свойства таблеток “глюцинан”, содержащих по 205 мг глюкофага и 295 мг nара-хлор-феноксиуксусной кислоты [XIII]. По выраженности противодиабетического эффекта 1 таблетка была идентична 660 мг чистого глюкофага [114].
Известна гипогликемическая активность замещенных сульфокислот, обладающих одновременно и противовоспалительным [XIV, XV] действием [96].
В опытах in vitro бензоат натрия [XV] уменьшал в гепатоцитах глюконеоге-нез из лактата, пальмитата, пирувата, аланина, глицерина и фруктозы.
Описано сахароснижающее действие натриевой соли салициловой [XVI], ацетилсалициловой [XVII], натриевой соли бензойной [XVIII], 4-[2-(5-мето-ксибензамид) этил] бензойной [XIX], 3-(N,N-диметил) аминопропилнафтилуксус-ной [XX] кислот.
В опытах in vitro показана способность -N-фенилэтиламида, -N-бензиламида и -N-метил-N-бензиламида аргинина снижать интенсивность адреналинового ли-полиза соответственно на 23 %, 30 % и 64 %. Его -N-N-диэтиламид в концентрации 2 ммоль/мл в 7,8 раза повышает поглощение глюкозы из буфера крысиной гемидиафрагмой, в 3,1 раза – накопление в ней гликогена, а также на 55 % уменьшает в культуре жировых клеток адреналиновый липолиз. В опытах на клеточной культуре гепатоцитов бензоат натрия [XVIII] уменьшал скорость глюко-неогенеза.
У здоровых крыс 3-(N,N-диметил)аминопропил- производные нафтилуксус-ной кислоты [XX] в дозах 50 и 100 мг/кг вызывали гипогликемический эффект, сравнимый с таковым хлорпропамида.
Салицилат натрия [XVI] вызывал у здоровых кроликов выраженные гипог-ликемический и гипохолестеринемический эффекты. У здоровых добровольцев добавление 2–3 гр. салицилата натрия усиливало -цитотропное и гипогликеми-ческое действие хлорпропамида и повышало тканевую ассимиляцию вводимой внутривенно глюкозы. Ацетилсалициловая кислота [XVII] увеличивала у них базальную и индуцированную глюкозой, аргинином или толбутамидом секрецию инсулина.
Если монотерапия карбутамидом или инсулином понижала среднесуточное содержание сахара в крови больных диабетом на 9–12 %, то через 10 дней после одновременного с ними ежедневного трехразового приема по 300 мг ацетилсалициловой кислоты гипогликемический эффект достигал 30–35 %. Двухнедельное ее добавление в дозе 500 мг/сутки к глибенкламиду повышало уровень ИРИ и конкурентно ослабляло взаимодействие последнего с инсулиновыми рецепторами.
В 1979 году был синтезирован ряд производных щавелевой кислоты среди замещенных амидов N-R-сульфамидоксаниловых кислот [XXI]. Максимальную активность при пероральном назначении здоровым кроликам в дозе 50 мг/кг проявили соединения с изобутильными и -оксиэтильными радикалами при амидном азоте оксамоильного остатка, снижавшие сахар крови за 4–6 часов на 32–48 %, а за 7–9 часов – на 42–51 %. Эффект бутамида в аналогичные интервалы времени составил 25–30 % и 24–28 %.
В 1987 году было показано выраженное гипогликемическое действие амида бензолсульфогидразида щавелевой кислоты [XXII], который был подвергнут углубленному фармакологическому анализу. В опытах на интактных кроликах он уменьшал содержание глюкозы в крови на 39 % через 6 часов и на 52 % через 10 часов после введения, тогда как бутамид – соответственно на 28 % и 25 %. Близкие данные были получены и при его апробации на собаках. У кроликов с ал-локсановым диабетом эффект однократного назначения вещества был слабее в 1,5 раза и нормогликемия достигалась лишь к концу второй недели его ежедневного применения. Лечение им нормализовало активность гексокиназы, глюкозо-6-фосфатазы и фруктозо-1,6-дифосфатазы, повышало содержание гликогена и белков в печени. При 6-месячном введении интактным кроликам и собакам соединение показало низкую токсичность. Его ДЛ50 при внутрибрюшинной инъекции мышам составила 1969 мг/кг, а крысам – 2917 мг/кг.
В 2002 г. была описана сахароснижающая активность пара-ацетил-фениламида янтарной кислоты, уменьшавшего уровень глюкозы в крови здоровых крыс за 5 часов опыта на 22–23 % [72, 74].
Введение крысам со стероидным диабетом
Введение дексаметазона с самого начала эксперимента замедляет темпы роста тела подопытных животных (таблица 23). Так, уже на 4-е сутки они отстают от интактных крыс на 18,3 %, через неделю – на 24,3 %, через 2 недели – на 31,1 % и спустя 3 недели наблюдения – на 33,2 %. Прогрессирующая потеря веса и ухудшение общего состояния животных «опытной» серии обусловили необходимость ограничения времени исследования тремя неделями.
Проявлением антианаболического действия дексаметазона является активация глюконеогенеза, о чём свидетельствует повышение у животных контрольной серии уровня тощаковой гликемии (таблица 24). Показано, что спустя 2 недели эксперимента содержание сахара в крови животных, получавших дексаметазон, возрастает на 17,4 %, а через 3 недели – на 20,2 %.
К числу характерных глюкокортикоидных эффектов относится также увеличение в крови крыс «опытной» серии лактата и ряда компонентов липидного обмена (таблица 25), а также снижение содержания общего кальция.
Одним из ведущих проявлений глюкокортикоидного метаболического синдрома является, как известно, инсулинорезистентность [2, 183]. Показано, что у интактных крыс внутрибрюшинная инъекция инсулина из расчета 1,0 ЕД/кг вызывает быстрое снижение уровня гликемии: через 30 минут – на 45,4 %, спустя 1 час – на 60,2 %, по истечении 2 часов – на 43,4 % и на 20,7 % – к концу 3 часа опыта (таблица 26). Гипогликемический коэффициент Рафальского составляет у них 0,40±0,02, а пик сахароснижающего эффекта приходится на 1 час после инъекции препарата. У животных, получавших дексаметазон, биологическое действие инсулина значительно ослаблено и укорочено (таблица 26).
C min – время достижения минимальной концентрации глюкозы в крови.
Естественным следствием уменьшения активности инсулина на фоне длительного введения дексаметазона является снижение углеводной толерантности животных. Так, у крыс контрольной серии дозированное кормление сопровождается постоянным постепенным повышением сахара в крови: через 4 часа – на 14,8 %, спустя 6 часов – на 17,7 %, а к концу 10-часового опыта – на 28,8 % (таблица 27). Животные со стероидным диабетом отвечают на пищевую нагрузку более выраженной постпрандиальной гипергликемией: содержание глюкозы в их крови спустя 4 часа возрастает на 23,8 %, через 6 часов – на 33,7 %, а по истечении 10 часов – на 56,9 %.
Пероральное введение глюкозы в виде 40 % раствора из расчета 2 г/кг у молодых крыс вызывает лишь кратковременное повышение уровня гликемии: на 37,6 % через 30 минут, на 41,7 % спустя 45 минут. После повторного применения дексаметазона прирост гликемии в аналогичные интервалы времени значительно увеличивается (таблица 28). Соответственно повышается у этих животных и ги-пергликемический коэффициент Бодуэна: 75,9 против 46,5 у интактных крыс.
Известно, что специфический эффект глюкокортикоидов проявляется и в отношении системы кроветворения. Так, в крови животных на фоне применения дексаметазона повышается содержание эритроцитов, снижается – лейкоцитов, наблюдается лимфопения (таблица 29).
Таким образом, длительное введение крысам дексаметазона из расчета 100 мкг/кг воспроизводит основные проявления глюкокортикоидного метаболического синдрома: похудание, гипергликемию, снижение толерантности к углеводам и чувствительности инсулину, гиперлактатацидемию, ухудшение атерогенных свойств крови.
Ежедневное введение гуакарбена значительно улучшало гликемический профиль животных со стероидным диабетом: если через 1 неделю уровень их суточной гликемии был аналогичен исходному, то через 2 недели – снижался на 16,8 % (таблица 30). Гликлазид проявил близкий по выраженности и динамике развития эффект, тогда как действие метформина развивалось позже. В контрольной же серии эксперимента у крыс отмечалось постепенное повышение тощаковой гликемии, которая спустя неделю введения дексаметазона возрастала на 8,3 %, через 2 недели – на 17,4 %, а к концу исследования – на 20,2 %.
Длительное введение гуакарбена повышает толерантность крыс со стероидным диабетом к вводимой через рот глюкозе: в течение первых 45 минут опыта прирост уровня гликемии был у них ниже «контрольных» значений на 43,1– 59,5 %, через 1 час – на 38,8 %, а спустя 1,5–2 часа – на 17,1–23,8 % (таблица 31). Близкий эффект проявил метформин, тогда как действие гликлазида было менее выражено.
Противодиабетическая активность и острая токсичность структурных аналогов гуанидиниевой соли 2,4-дихлор-5-карбоксифенилсульфокислоты
С целью поиска потенциальных противодиабетических соединений в ряду производных бензолсульфокислот были изучены три наиболее активных структурных аналога гуакарбена: вещества №№ 1е, 1к и 2ж.
Судя по величине среднесмертельной дозы, все три структурных аналога гуакарбена оказались токсичнее его: соединение №1е – на 35 % (таблица 47), соединение №1к – на 14 % (табл.47), а соединение №2ж – на 26 % (таблица 49).
Для сравнительной оценки характера токсического действия апробируемых соединений были проведены эксперименты с их параллельным одновременным внутрибрюшинным введением интактным мышам. Каждое из веществ изучалось при этом на 36 животных массой 18–20 гр.
Сразу после инъекции гуакарбена в токсических дозах у мышей возникает двигательное беспокойство, спонтанный писк, поза драки. Через 11–15 минут развиваются выраженные клинико-тонические судороги, приводящие к гибели. Что касается гуанидиниевой соли 2-аминобензолсульфокислоты (соед.2ж), то после ее введения в токсических дозах у животных отмечается реакция испуга, а спустя 10 минут появляются спонтанные подскоки, гиперрефлексия, поза драки и постепенно усиливающаяся одышка. Через 1 час состояние мышей резко ухудшается: возникают тремор, атаксия, цианоз, выраженная влажность шерстного покрова.
Гибель их наступает спустя 2–2,5 часа на фоне прогрессирующей дыхательной недостаточности и слабых клонических судорог.
По картине общего действия дигуанидиниевая соль 2,4-дихлор-5-карбоксибензолсульфокислоты (соед.1е) приближается к гуакарбену: сразу после их внутрибрюшинной инъекции в токсических дозах у мышей отмечается писк, агрессивность, подскоки. Оба вещества вызывают одышку, которая, усиливаясь, сопровождается жевательными движениями и вынужденной позой сидя. Затем быстро развиваются судороги, завершающиеся гибелью животных.
Динамика отравления зависит от дозы вводимых веществ. При назначении из расчета 250-500 мг/кг соединение 1е провоцирует появление одышки спустя 1– 1,5 часа после затравки, а в дозах 750–1000 мг/кг – по истечении 10–15 минут. Через 20-30 минут после начала опыта на фоне углубления токсического эффекта введенного в максимальных испытанных дозах вещества мыши принимают вынужденную позу сидя, а спустя 25–40 минут у них возникают клонико-тонические судороги с летальным исходом. При введении из расчета 750–1000 мг/кг гуакар-бен вызывает у животных одышку через 10–20 минут, а в дозах 1250–2000 мг/кг – спустя 3-7 минут. Положение сидя у мышей, принявших препарат по 750– 1000 мг/кг, отмечается по истечении 9–13 минут после начала эксперимента, а в дозах 1250–2000 мг/кг – спустя 3–6 минут. Судорожный синдром, появляющийся на 10–13 минуте после возникновения первых симптомов интоксикации при назначения вещества по 1250–2000 мг/кг, быстро завершается гибелью животных.
Картина токсического действия триэтиламина 2,4-дихлор-5-карбо-ксифенилсульфокислоты (соед.1к) иная. Сразу после его внутрибрюшинного введения у мышей развивается реакция испуга. Затем, по мере углубления отравления, развивается гипорефлексия, птоз, боковое положение. Животные погибают при явлениях нарастающего коматозного состояния к концу первых суток.
Влияние на уровень гликемии интактных животных разных видов
На этапе скрининговых исследований было показано, что дигуанидиниевая соль фенилсульфокислоты (соед.1е) и её триэтиламин (соед.1к) при введении крысам с аллоксановым диабетом через рот в эквитоксических дозах, равных 0,1ДЛ50, проявили гипогликемический эффект, аналогичный таковому гуакарбена. За 5 часов наблюдения они снижали содержание глюкозы в крови на 63,4–69,6 % (таблица 48), тогда как гуанидиниевая соль 2-аминофенилсульфокислоты (со-ед.2ж) превосходила активность препарата сравнения, уменьшая сахар крови на 73,9 % (таблица 50).
Известно, что бигуаниды, уменьшая гипергликемию при диабете, не снижают сахар крови у здоровых людей. В отличие от них, производные сульфонилмочевины сохраняют эффективность в обоих случаях. В связи с этим представляло интерес изучение влияния структурных аналогов гуакарбена на уровень гликемии интактных животных.
При внутрибрюшинном введении интактным крысам в дозе 0,1ДЛ50 дигуа-нидиниевая соль 2,4-дихлор-5-карбоксифенилсульфокислоты (соед.1е) и её три-этиламин (соед.1к) показали равный гуакарбену эффект, уменьшая содержание глюкозы в крови за 5 часов наблюдения на 26,6-28,9 % (таблица 51), тогда как гуанидиниевая соль 2-аминофенилсульфокислоты (соед.2ж) была активнее препарата сравнения.
Гипогликемическое действие сравниваемых веществ сохраняется и при их пероральном введении интактным крысам, у которых дигуанидиниевая соль 2,4-дихлор-5-карбоксифенилсульфокислоты (соед.1е) и её триэтиламин (соед.1к) снижают сахар крови на 20,2–25,2 %, а гуанидиниевая соль 2-аминофенилсульфокислоты (соед.2ж) – на 35,8 % (таблица 52). Следует отметить, что и в этом случае эффект первых двух соединений был сопоставим с таковым гуакарбена, тогда как у соединения 2ж – превосходил его.С учетом возможной видовой специфичности действия было изучено влияние структурных аналогов гуакарбена на содержание глюкозы в крови интактных животных разных видов. Показано, что у морских свинок вещества №№1е, 1к и 2ж по эффективности уступают гуакарбену, уменьшая уровень гликемии за 5 часов опыта на 10,9–12,2 %, тогда как препарат сравнения – на 29,4 % (таблица 53).
Влияние на метаболические эффекты адреналина
Уровень глюкозы в крови, как известно, во многом определяется соотношением процессов глюконеогенеза и синтеза гликогена. Судьба последнего в печени тесно связана с состоянием симпатической нервной системы, активация которой стимулирует его распад и вызывает гипергликемию. На фоне сахарного диабета эта зависимость усугубляется более высоким уровнем катехоламинов, которые могут действовать на метаболизм гликогена независимо от цАМФ через 1-адренорецепторы, вызывая с помощью посредника освобождение Са++ из внутриклеточного депо и активируя фосфорилазу. Катехоламины вмешиваются в углеводный обмен и через -адренорецепторы, возбуждение которых сопровождается активацией аденилатциклазы, увеличением внутриклеточного цАМФ и повышением скорости гликогенолиза. Проявлением этого может быть известное клиницистам гипогликемическое действие -адреноблокаторов у больных сахарным диабетом [7, 124].
Изучение антиадренергической активности структурных аналогов гуакар-бена было проведено в опытах in vivo: о наличии ее судили по способности сравниваемых соединений блокировать у сытых интактных крыс гипергликемизи-рующее действие адреналина.
В контрольной серии животных введение адреналина сопровождается быстрым нарастанием уровня гликемии: через 30 минут – на 99,3 %, спустя 1 час – на 134,8 %, по истечении 2 часов – на 155,2 % с последующим ослаблением динамики процесса (таблица 59).
Гуанидиниевые соли фенилсульфокислот (соед.1е и 2ж) сильнее, чем гуакар-бен, снижают у животных выраженность гликогенолиза, уменьшая гиперглике-мический коэффициент Бодуэна, по сравнению с контролем, в 3,9–4,6 раза. Эффект триэтиламина фенилсульфокислоты (1к) при этом значительно уступал таковому сравниваемых веществ и проявлялся лишь на протяжении первых 30 минут опыта.
Одной из точек приложения действия пероральных противодиабетических препаратов является активация гликолиза. Последний, как известно, представляет собой анаэробный процесс распада глюкозы до лактата в лишенных способности аэробного окисления эритроцитах и скелетных мышцах. Соотношение между глюконеогенезом и гликолизом на генетическом уровне контролируется инсулином – индуктором ключевых ферментов последнего: гексокиназы, фосфофрукто-киназы и пируваткиназы. Снижение эффективности инсулина при сахарном диабете приводит к инактивации гликолитических ферментов и уменьшению скорости анаэробного распада глюкозы [92].
До 80-х годов считалось, что стимуляция гликолиза является специфическим эффектом гуанидиновых антидиабетиков, объясняющим не только механизм их гипогликемического действия, но и особенности токсикологии [18]. Позже появились сообщения об аналогичной активности производных сульфонилими-ноимидазола, пиперазинилтиопирано-пиримидина, а также об ее отсутствии у пирролидоновых замещенных имидамида, объединяющих в своей формуле структурные элементы бигуанида и сульфонилмочевины [68, 89, 217].
Для изучения влияния сравниваемых веществ на гликолиз проведены опыты in vivo: об активации его судили по степени увеличения содержания в крови животных молочной кислоты.
На фоне введения интактным крысам в дозах, равных 0,1ДЛ50, лишь дигуа-нидиниевая соль 2,4-дихлор-5-карбоксифенилсульфокислоты (соед.1е) усиливала анаэробный гликолиз, повышая продукцию лактата на 36,6 % (таблица 60). При увеличении дозы соединений до 0,5ДЛ50 образование молочной кислоты повышали все апробируемые вещества кроме триэтиламиновой соли фенилсульфокисло-ты (соед.1к). Так, образование лактата в результате применения дигуанидиниевой соли фенилсульфокислоты возрастало на 193,5 %, гуанидиниевой соли 2-аминофенилсульфокислоты (соед.2ж) – на 66,0 %, бигуанидного противодиабе-тического препарата метформина – на 27,1 %, а гуакарбена – на 30,7 % (таблица 60).
Примечание: контроль 1 – для серий опытов с дозами препаратов, равных 0,1 ДЛ50; контроль 2 – для серий опытов с дозами препаратов, равных 0,5 ДЛ50. Достоверность отличий по сравнению с соответствующим контролем при Р0,05- , Р0,01- , Р0,001- ; по сравнению с эффектом гуакарбена (630 мг/кг) при Р0,05-х, Р0,01-хх, Р0,001-ххх.
На фоне аллоксанового диабета уровень молочной кислоты в крови крыс возрастает в 3,0–3,3 раза (таблица 61). Продукция лактата увеличивается при этом лишь на фоне введения дигуанидиниевой соли фенилсульфокислоты (соед.1е) – в среднем на 38,4 %.
Таким образом, проведенные исследования фармакологической активности трёх отобранных структурных аналогов гуакарбена свидетельствуют о том, что наибольшей перспективностью из них в отношении разработки противодиабети-ческого лекарственного средства обладает гуанидиниевая соль 2-амино-фенилсульфокислоты (соед.2ж). В пользу такого выбора свидетельствует наличие у данного соединения большого набора существенных преимуществ перед гуа-карбеном: более выраженная гипогликемическая активность, проявляющаяся в дозе, равной 0,1ДЛ50, при внутрибрюшинном и пероральном введении интактным крысам и при пероральном введении крысам с аллоксановым диабетом; большая способность потенцировать гипогликемический эффект экзогенного инсулина и уменьшать гипергликемическое действие адреналина. Как и гуакарбен, гуаниди-ниевая соль 2-аминофенилсульфокислоты уменьшает нормогликемию у кроликов; снижает гипергликемию у крыс с аллоксановым диабетом в дозах, равных 0,03-0,01ДЛ50; ограничивает всасывание глюкозы у интактных крыс; не повышает продукцию лактата у крыс с диабетом при введении в дозе, равной 0,1ДЛ50. Что касается недостатков данного соединения, то их немного: судя по величине ДЛ50, оно всего лишь на 26 % токсичнее гуакарбена, слабее снижает сахар крови у морских свинок и сильнее повышает продукцию лактата у интактных крыс при введении из расчета 0,5ДЛ50.
Дигуанидиниевая соль 2,4-дихлор-5-карбоксифенилсульфокислоты (соед.1е) превосходит гуакарбен только по способности снижать выраженность адреналинового гликогенолиза. По ряду показателей данное вещество аналогично препарату сравнения: по выраженности гипогликемического эффекта у интактных и больных аллоксановым диабетом крыс, а также у интактных кроликов; по способности снижать абсорбцию глюкозы и увеличивать эффект инсулина; оно тоже не повышает уровень молочной кислоты в крови крыс с аллоксановым диабетом при введении в дозе, равной 0,1ДЛ50. Во многом это соединение уступает гуакар-бену: слабее снижает уровень гликемии у морских свинок, сильнее увеличивает у интактных крыс лактоацидоз во всем диапазоне апробированных доз, токсичнее на 35 %.
Триэтиламин 2,4-дихлор-5-карбоксифенилсульфокислоты (соед.1к) преимуществ перед гуакарбеном не имеет. Данное вещество аналогично препарату сравнения по выраженности гипогликемического действия у интактных крыс и кроликов, а также у крыс с аллоксановым диабетом; проявляет равную ему активность в отношении потенцирования экзогенного инсулина и нейтральность в отношении молочнокислого ацидоза при введении интактным и аллоксан-диабетическим животным из расчета 0,1ДЛ50. Триэтиламин 2,4-дихлор-5-карбокси-фенилсульфокислоты по сравнению с гуакарбеном имеет много недостатков: слабее снижает сахар крови у морских свинок; в меньшей степени уменьшает гипергликемию у крыс с аллоксановым диабетом в дозах, равных 0,03ДЛ50 и 0,01ДЛ50; слабее задерживает всасывание глюкозы из кишечника животных; в меньшей степени уменьшает адреналиновую гипергликемию; токсичнее на 14 %.