Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы
1.1. Наземные растения - источники природных фенольных соединений 18
1.1.1. Фенольные соединения с одним ароматическим кольцом .18
1.1.2. Фенольные соединения с двумя ароматическими кольцами 23
1.1.3. Полимерные фенольные соединения 31
1.1.4. Растительные экстракты 33
1.2. Антиоксидантное и антирадикальное действие флавоноидов .44
1.3. Биодоступность флавоноидов .49
1.4. Стрессовые нарушения метаболических реакций в организме млекопитающих .50
1.5. Фармакологические методы коррекции стресса 56
Собственные исследования
Глава 2. Материалы и методы исследования
2.1. Объекты исследования .66
2.2. Материалы исследования 67
2.3. Получение биоматериала 69
2.4. Повреждающие факторы 69
2.5. Физиолого-биометрические исследования 70
2.6. Лабораторные методы анализа 72
2.6.1. Физиологические характеристики эритроцитов 72
2.6.2. Биохимические методы исследования 72
2.6.3. Биохимические методы определения липидов .73
2.6.4. Количественное определение общих фенолов .74
2.6.5. Тонкослойная хроматография общих фенолов 75
2.6.6. Аналитическая высокоэффективная жидкостная хроматография фенольных соединений .75
2.6.7. Оценка эмбриотоксичности 75
2.6.8. Газовая хроматография жирных кислот 76
2.6.9. Статистическая обработка результатов 76
Глава 3. Обоснование выбора сырьевых источников из дальневосточной флоры для получения стресс протекторных препаратов
3.1. Физико-химические показатели водно-спиртовых экстрактов .77
3.2. Тонкослойная хроматография фенольных соединений экстрактов 80
3.3. ВЭЖХ фенольных соединений экстрактов 83
3.4. Липидный состав экстрактов .88
Глава 4. Влияние растительных экстрактов, содержащих природные фенольные комплексы, на физиологические и биохимические показатели организма крыс в хроническом эксперименте
4.1. Исследование острой токсичности .93
4.2. Исследование хронической токсичности .94
Глава 5. Влияние экстракта из осей соцветий винограда амурского, содержащего природные фенольные комплексы, на физиологические и биохимические показатели организма добровольцев 108
Глава 6. Влияние экспериментального стресса на физиологические и биохимические показатели организма крыс
6.1. Влияние физического стресса (вертикальная фиксация крыс за дорсальную шейную складку) .113
6.2. Влияние химического стресса .131
6.2.1. Влияние интоксикации сероуглеродом на физиологические и биохимические показатели организма крыс .131
6.2.2. Влияние интоксикации оксидами азота на физиологические и биохимические показатели организма крыс .148
6.2.3. Влияние интоксикации ацетоном на физиологические и биохимические показатели организма крыс 161
Глава 7. Влияние стрессовых факторов на физиологические и биохимические показатели организма человека
7.1. Влияние гипербарического стресса 179
7.1.1. Влияние глубоководных спусков на физиологические и биохимические показатели крови и эритроцитов водолазов .179
7.2. Влияние психоэмоционального стресса .184
7.2.1. Влияние учебной нагрузки на физиологические и биохимические показатели крови и эритроцитарных мембран студентов начальных курсов очного обучения в ВУЗе .184
Глава 8. Влияние растительных экстрактов, содержащих природные фенольные комплексы, на метаболические реакции организма крыс в условиях стресса
8.1. Влияние растительных фенольных комплексов на физиологические и биохимические показатели крови, эритроцитов и печени крыс в условиях экспериментального стресса (вертикальная фиксация крыс за дорсальную шейную складку) 189
8.2. Влияние растительных фенольных комплексов на физиологические и биохимические показатели крови, эритроцитов и печени крыс в условиях химического стресса .216
8.2.1. Влияние растительных фенольных комплексов на биохимические показатели крови, эритроцитов и печени крыс в период отмены интоксикации сероуглеродом и при профилактическом введении препаратов до- и в период интоксикации сероуглеродом 216
8.2.2. Влияние растительных фенольных комплексов на биохимические показатели крови, эритроцитов и печени крыс после интоксикации оксидами азота .238
8.2.3. Влияние растительных фенольных комплексов на биохимические показатели крови, эритроцитов и печени крыс в период отмены интоксикации ацетоном 259
Глава 9. Влияние растительных экстрактов, содержащих природные фенольные комплексы, на физиологические и биохимические показатели организма человека в условиях стресса
9.1. Влияние растительных фенольных комплексов на физиологические и биохимические показатели крови и эритроцитов водолазов при гипербарическом стрессе 275
9.2. Влияние растительных фенольных комплексов на физиологические и биохимические показатели крови и эритроцитов студентов начальных курсов очного обучения в ВУЗе (психоэмоциональный стресс) 281
Глава 10. Обсуждение результатов 287
Выводы 323
Список литературы 326-374
- Фенольные соединения с двумя ароматическими кольцами
- Исследование хронической токсичности
- Влияние интоксикации ацетоном на физиологические и биохимические показатели организма крыс
- Влияние растительных фенольных комплексов на физиологические и биохимические показатели крови и эритроцитов студентов начальных курсов очного обучения в ВУЗе (психоэмоциональный стресс)
Введение к работе
Актуальность исследования. Согласно глобального Плана действий ВОЗ по здоровью работающих на 2008-2017 г.г. (60-я сессия Всемирной ассамблеи здравоохранения – WHA 6.26. 23 мая 2007 г.), государственная политика направлена на профилактику профессиональных заболеваний, среди которых обозначен профессиональный стресс и его последствия для здоровья с целью его сохранения у работающих граждан (Рахманин, Михайлова, 2014). В связи с этим в настоящее время исследование возможности профилактики стрессовых нарушений здоровья является актуальной проблемой и одним из приоритетных направлений современной фармакологии.
Современное общество подвержено стрессовым воздействиям (тяжелая физическая нагрузка, переохлаждение, перегревание, химический и психоэмоциональный стрессы и др.). При сильном и длительном воздействии стресса в организме возникают различные повреждения, называемые стрессорными заболеваниями или болезнями адаптации (язвы желудочно-кишечного тракта, гипертоническая болезнь, атеросклероз и др.). Исследованиям различных аспектов влияния стресса на организм животных и человека посвящены фундаментальные труды отечественных и зарубежных ученых, начало которым было положено Г. Селье (1960-1982). Эти исследования посвящены, в первую очередь, функционированию двух систем – гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой и симпатико-адреналовой, которые занимают ключевые позиции в представлениях о стрессе. В результате был обнаружен один и тот же комплекс неспецифических изменений (триада): существенное увеличение надпочечников и исчезновение секреторных гранул из клеток железистой ткани; уменьшение массы лимфоидных органов или инволюция тимико-лимфатической системы; кровоизлияния и изъязвления слизистой желудка и двенадцатиперстной кишки. Указанные неспецифические изменения составили основу «общего адаптационного синдрома», вызываемого различными повреждающими агентами. В то же время в литературе имеются разрозненные сведения по изучению биохимических механизмов воздействия на организм стрессовых факторов. В этом направлении известны работы Барабоя В.А., Голотина В.Г., Кудряшова Ю.Б., Кушнеровой Н.Ф., Ланкина В.З., Меньщиковой Е.Б., Спрыгина В.Г., Фоменко С.Е., Хасиной Э.И. и др.
В работе приняты следующие сокращения: АРА – антирадикальная активность, ГП – глутатионпероксидаза, ГР – глутатионредуктаза, Г-SH – восстановленный глутатион, ЛФХ – лизофосфатидилхолин, ЛФЭ – лизофосфатидилэтаноламин, ЛПВП – липопротеины высокой плотности, ЛПНП – липопротеины низкой плотности, ЛПОНП – липопротеины очень низкой плотности, МДА – малоновый диальдегид, ПОЛ – перекисное окисление липидов, СДЭ – средний диаметр эритроцита, СОЭр – средний объем эритроцита, СЖК – свободные жирные кислоты, СМ – сфингомиелин, СОД – супероксиддисмутаза, ТАГ – триацилглицерины, ФИ – фосфатидилинозит, ФК – фосфатидная кислота, ОФЛ – общие фосфолипиды, ФПП – функциональный пищевой продукт, ФС – фосфатидилсерин, ФХ – фосфатидилхолин, ФЭ – фосфатидилэтаноламин, ХС – холестерин, ЭЖК – эфиры жирных кислот, ЭХС – эфиры холестерина, 14:0 - миристиновая кислота, 16:0 – пальмитиновая кислота, 18:0 – стеариновая кислота, 16:1 – пальмитолеиновая кислота, 18:1 – олеиновая кислота, 18:2 n-6 – линолевая кислота, 20:4 n-6 – арахидоновая кислота, 18:3 n-3 – линоленовая кислота, 20:5 n-3 – эйкозапентаеновая кислота, 22:6 n-3 – докозагексаеновая кислота.
Стрессорная реакция включает набор стереотипных биохимических процессов, происходящих на клеточном, тканевом и системном уровнях. Так, при воздействии стессовых факторов происходит выброс из надпочечников в кровь катехоламинов, при окислении которых в печени цитохромом Р-450 увеличивается индукция свободных супероксиданионов. Также образуются семихинонные радикалы адреналина и возрастает концентрация пероксил- и гидроксил-радикалов, инициирующих свободно-радикальные реакции (Хавинсон и др., 2003; Костюк, Потапович, 2004). При остром или хроническом воздействии стресса наступает предел прочности системы антиоксидантной защиты и запускается механизм перекисного окисления липидов (Панин, 1983; Барабой и др., 1992; Кушнерова, Фоменко, 2011), истощается резерв адаптации и формируется оксидативный стресс (Меньщикова и др., 2006, 2008, 2012). Однако наряду с исследованиями системы «перекисное окисление липидов-антиоксидантная защита» в основе нарушений здоровья при стрессе, возможно, лежат и другие метаболические сдвиги, в частности, углеводном и липидном обменах, физиолого-биохимических изменениях биомембран эритроцитов и их размерных характеристиках. Важность изучения этих вопросов обусловлена тем, что при стрессе происходит переключение пути получения энергии с «углеводного» типа на «липидный» (Панин, 1983). Нарушение антиоксидантной защиты оказывает влияние на липидную составляющую клеточных мембран. В этом отношении липидная составляющая мембран эритроцитов является тонким показателем, определяющим состояние мембран других клеток органов и тканей на уровне целого организма (Эндакова и др., 2002). Уменьшение полиненасыщенных жирных кислот в фосфолипидах мембран обусловит нарушение функционирования мембраносвязанных ферментов, рецепции гормонов, угнетению активности синтетаз простагландинов, являющихся биорегуляторами, снижению лабильности клеток крови при прохождении через микроциркулярное русло и др. Таким образом, возникает необходимость комплексного системного изучения биохимических механизмов стрессовой реакции и профилактики возможных нарушений.
На сегодняшний день известен ряд препаратов, обладающих стресс-протекторным действием, так называемых адаптогенов биофлавоноидной природы, включающих широко известные средства традиционной и народной медицины. К ним относятся корни женьшеня, элеутерококка колючего, аралии маньчжурской, родиолы розовой, левзени сафлоровидной, семена лимонника китайского (Брехман, 1968; Дардымов, 1987; Хасина, 1984; Шахматов, Киселев, 2010; Кушнерова и др., 2012-2014; Huyke et al., 2007; Kim et al., 2012; Mocan et al., 2014; Duan et al., 2015 и др.). Однако использование корней и семян приводит к катастрофическому снижению запасов этих растений.
Наиболее изучены в этом направлении препараты, содержащие в качестве основного действующего вещества группу изомерных флавоноидных соединений – Silimarin, выделенных из экстрактов плодов расторопши пятнистой (Silybum marianum G.). На основе этих соединений разработан ряд лекарственных препаратов: «ЛИВ-52» (Индия), «Карсил» (Болгария), «Легалон» (Германия), «Силегон» (Венгрия), «Сиромин» (Словения) и др. Действие силимарина обусловлено стабилизацией клеточных мембран за счет антиоксидантных свойств препарата (Новиков, 2005). Однако препараты, содержащие силимарин, зарубежного производства, поэтому очевидна актуальность и необходимость поиска и изучения новых источников сырья, имеющегося на территории Российской Федерации, для получения препаратов со стресс-протекторными свойствами с целью импортозамещения. Природные ресурсы Дальнего Востока предоставляют широкие
возможности для их создания. Достаточно актуальным является использование дикорастущих растений Уссурийской тайги. В условиях производств по переработке ягодного сырья остается большой объем отходов, представляющих собой оси соцветий (кисть, зонтик и др.) и отжим после отделения сока ягод (кожица, семена). Это большой возобновляемый сырьевой резерв, который в настоящее время не утилизируется и не используется должным образом. Однако в их составе присутствует значительное количество биологически активных веществ, в частности фенольных соединений, являющихся признанными антиоксидантами и важными компонентами многих лекарственных препаратов. В то же время это поможет создать безотходную технологию по переработке дикоросов и сохранить экологическую обстановку на территориях перерабатывающих предприятий. Важно отметить, что из всего многообразия растительного сырья (растения, фрукты, овощи, злаки, семена, кора и др.) только 10% исследуемых растительных источников достаточно обогащены полифенольными соединениями и могут быть использованы в качестве эффективных натуральных антиоксидантов ( Это делает актуальным изучение глубоких биохимических механизмов их влияния на организм и возможность фармакологической профилактики стресса. Комплексы фенольных соединений входят в состав традиционно употребляемых человеком растительных продуктов (фрукты, овощи, ягоды и др.), поэтому эволюционно адаптированы для человеческого организма. В отличие от синтезированных полифенолов, природные имеют крайне низкую токсичность, не вызывают побочных реакций (аллергия, эффект привыкания, накопления). Из литературных данных известно о широком спектре биологической активности растительных фенольных соединений благодаря проявлению ими антиокислительных свойств и способности выступать ловушками свободных радикалов различного типа (Sanz et al., 1994, Es-Safi et al., 2007). Растительные фенольные соединения защищают организм от проявлений оксидативного стресса (Terao, 2009), образуют комплексы с ионами переходных металлов (De Souza, De Giovani, 2004), влияют на активность металлозависимых ферментов (Sakihama et al., 2000), блокируют процессы перекисного окисления липидов (Pamplona, 2011), взаимодействуют с биологическими мембранами, меняя их структурные характеристики (Афанасьева и др., 2007; Куркин и др., 2009; Тараховский и др., 2010; Arora et al., 2000). Однако до сих пор не проводилось системного исследования состава биологически активных веществ в экстрактах из дикорастущего ягодного сырья Уссурийской тайги, в частности, осей соцветий винограда амурского, аралии маньчжурской, лимонника китайского, отжима после отделения сока ягод калины Саржента, жимолости съедобной, рябины обыкновенной. Также до сих пор многие вопросы их регуляторного эффекта на липидный и углеводный обмен, а также мембраностабилизирующее действие в условиях стресса остаются неясными.
Цель работы: провести оценку фармако-профилактической эффективности комплексов природных фенольных соединений, выделенных из дикорастущего ягодного сырья Уссурийской тайги, при стресс-индуцированных нарушениях метаболических реакций в организме животных и человека.
Задачи исследования:
1. На основании химического анализа обосновать перспективность использования
дикорастущего ягодного сырья Уссурийской тайги (оси соцветий винограда амурского, лимонника китайского, аралии маньчжурской, отжим после отделения сока ягод калины
Саржента, жимолости съедобной, рябины обыкновенной) как источника природных биологически активных веществ.
-
Исследовать на лабораторных животных острую и хроническую токсичность выделенных растительных экстрактов, провести анализ их влияния на метаболические реакции организма человека.
-
Изучить стресс-индуцированные нарушения метаболических реакций в организме экспериментальных животных в условиях физического стресса (вертикальная фиксация за дорсальную шейную складку).
-
Изучить стресс-индуцированные нарушения метаболических реакций в организме экспериментальных животных в условиях химического стресса (интоксикация сероуглеродом, оксидами азота, ацетоном).
-
Провести сравнительную оценку эффективности применения растительных экстрактов в условиях физического стресса и интоксикации оксидами азота с известным стресс-протектором аптечным препаратом «Экстракт элеутерококка».
-
Исследовать эффективность применения растительных экстрактов в условиях химического стресса (сероуглерод и ацетон) с зарегистрированным в качестве основного действующего вещества группу изомерных флавоноидных соединений – Silimarin, выделенных из экстрактов плодов расторопши пятнистой (Silybum marianum G.), в восстановлении метаболических реакций крови и печени, а также липидной составляющей мембран эритроцитов крыс.
-
Установить основные закономерности изменений в содержании компонентов антиоксидантной защиты, метаболитов углеводного обмена, нейтральных и фосфолипидов, жирных кислот в крови и эритроцитарных мембранах добровольцев в условиях производственного стресса (водолазы) и изучить эффективность применения растительных экстрактов как фармако-профилактических средств.
-
Оценить возможность профилактики стрессовых нарушений метаболических реакций у студентов первого года обучения в ВУЗе путем использования функционального пищевого продукта.
Научная новизна исследования. Сформулированы положения научной концепции применения дикорастущего ягодного сырья Уссурийской тайги в виде водно-спиртовых экстрактов как фармако-профилактических средств при различных видах стресса. Концепция основывается на сочетании полифункциональных эффектов природных биологически активных веществ с позиций их воздействия на организм животных и человека в условиях стрессовой нагрузки.
Наряду с известными стресс-индуцируемыми биохимическими изменениями метаболических реакций в организме животных и человека впервые проведено глубокое исследование фосфолипидного и жирнокислотного обмена в сыворотке крови, печени и эритроцитарных мембранах.
Впервые обнаружено в спектре жирных кислот общих липидов сыворотки крови, печени и эритроцитарных мембран увеличение насыщенных и моноеновых жирных кислот, снижение полиненасыщенных жирных кислот семейства n-6 и n-3, что свидетельствует о нарушении процессов десатурации и элонгации.
Показано появление новых молекулярных видов фосфатидилхолина и
фосфатидилэтаноламина в липидной составляющей мембран эритроцитов
экспериментальных животных при воздействии стрессовых факторов.
Изучен подробный химический состав растительных экстрактов из дикорастущего ягодного сырья Уссурийской тайги.
Природный комплекс фенольных соединений различной структуры оказывает эффективное действие в коррекции и профилактике стрессовых нарушений метаболических реакций. Актуальность и целесообразность использования дикорастущего ягодного сырья для получения стресс-протекторных препаратов обусловлены высокой биологической активностью входящих в его состав фенольных соединений, их структурной уникальностью, а также ресурсной обеспеченностью, экологической и экономической значимостью.
Теоретическая значимость исследования. Работа является комплексным научным исследованием, посвященным изучению фармако-профилактических свойств экстрактов, содержащих комплексы фенольных соединений, выделенных из дикорастущего ягодного сырья Уссурийской тайги. Приводятся новые данные о химическом составе экстрактов. Исследование расширяет и дополняет современные знания о биохимических механизмах стрессовой реакции в условиях экспериментальных моделей на животных. На основании сравнительного анализа стресс-протекторного действия растительных экстрактов с известными препаратами сравнения показано преимущество комплексов фенольных соединений, входящих в состав растительных экстрактов. Полученные результаты расширяют представления о профилактических свойствах растительных фенольных соединений в условиях воздействия стрессовых факторов.
Установленные биохимические механизмы стрессовой реакции служат научным фундаментом для понимания патогенеза стрессорных нарушений метаболических реакций.
Практическая значимость исследования. Результаты работы могут быть применены в фармацевтической и пищевой промышленности. Доказана возможность использования дикорастущего ягодного сырья Уссурийской тайги для производства экстрактов со стресс-протекторными свойствами. Обосновано применение экстрактов с растительными фенольными соединениями в производстве функциональных пищевых продуктов со стресс-протекторными свойствами с экстрактом калины. Результаты изучения стресс-протекторного действия экстрактов из калины были использованы при разработке Методических рекомендаций «Биологически активная добавка Калифен», получен патент на изобретение (RU № 2483548).
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Концептуальная модель и основные научные принципы использования дикорастущего ягодного сырья Уссурийской тайги для выделения из него растительных экстрактов, содержащих природные биологически активные вещества.
-
Ведущими биохимическими механизмами, обусловливающими стрессовые нарушения метаболических реакций организма, являются напряжение и истощение антиоксидантной защиты, гиперпротонемия и тканевая гипоксия, нарушение липидного обмена, дислипидемия, увеличение объема и диаметра эритроцитов, разбалансировка фосфолипидных фракций в липидной составляющей их мембран, увеличение насыщенных жирных кислот и снижение полиненасыщенных жирных кислот в общих липидах крови, печени и эритроцитарных мембранах, появление новых молекулярных видов фосфолипидов.
-
В период восстановления (отмена) после воздействия химических токсикантов (сероуглерод, ацетон) на экспериментальных животных исследованные биохимические параметры к норме не возвращаются, что указывает на углубляющееся состояние дестабилизации метаболических реакций и необходимость фармкоррекции.
-
Изучение особенностей нарушений метаболических реакций в организме добровольцев, подвергавшихся в условиях производственной деятельности гипербарическому (водолазы) и психоэмоциональному (студенты первого года обучения в ВУЗе) стрессу.
-
Совокупность данных, обусловливающих методические подходы к использованию экстрактов с комплексом природных растительных фенольных соединений в условиях стрессовой нагрузки на экспериментальных животных.
-
Коррекция стрессовых нарушений метаболических реакций у добровольцев (водолазы, студенты) достигается при использовании экстракта из калины и функционального пищевого продукта с экстрактом калины, обладающих антиоксидантными и антирадикальными свойствами.
Личный вклад автора заключается в теоретическом обосновании проблемы, выборе направления исследований и непосредственном участии в выполнении экспериментов и методик исследований, а также статистической обработке материала. Анализ результатов, их теоретическое обоснование, разработка концептуальных представлений о стресс-протекторном действии экстрактов из дикорастущего ягодного сырья Уссурийской тайги и их свойствах как метаболических корректорах при стрессе, осуществлены лично автором.
Апробация работы. Основные результаты диссертации представлялись на
Международных, Всероссийских симпозиумах и конференциях, в том числе: VI
Всероссийском симпозиуме по проблемам боевого стресса (Москва, 2007), Дне науки
молодых ученых Ростовского медицинского университета (Ростов-на-Дону, 2008),
Международном симпозиуме «Пищевые биотехнологии: проблемы и перспективы в XXI
веке (Владивосток, 2008), II Международной научной конференции «Актуальные проблемы
экологической физиологии, биохимии и генетики животных» (Саранск, 2009),
Всероссийской научной конференции «Проблемы безопасности жизнедеятельности в
техносфере» (Благовещенск, 2010), 11-й научно-практической конференции
«Дальневосточная весна – 2011» (Комсомольск-на-Амуре, 2011), VI научно-практической
конференции «Фундаментальная наука – медицине» (Владивосток, 2011), молодежном
научном симпозиуме «Современные научные исследования на Дальнем Востоке» (Южно-
Сахалинск, 2012), VIII Международном симпозиуме «Фенольные соединения:
фундаментальные и прикладные аспекты» (Москва, 2012, 2015), Международной научно-
практической конференции «Свободные радикалы и антиоксиданты в химии, биологии и
медицине» (Новосибирск, 2013), V Международной научно-практической конференции
«Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины» (Ростов-на-Дону, 2013),
Международной научно-практической конференции молодых ученых и специалистов
«Современная Российская наука глазами молодых исследователей» (Красноярск, 2013), III
Международной научно-практической конференции «21 век: фундаментальная наука и
технологии» (Москва, 2014), интернет-конференции с международным участием
«Фармакологическая наука – от теории к практике» (Казань, 2014), Международной научно-
практической конференции «Теоретические и прикладные вопросы образования и науки»
(Тамбов, 2014), Международной научной интернет-конференции «Медицина в XXI веке:
тенденции и перспективы» (Казань, 2014), III Международной научной интернет-
конференции «Биотехнология: взгляд в будущее» (Казань, 2014), IX Международном
симпозиуме «Биоантиоксидант» (Москва, 2015), Седьмой Всероссийской научно-
практической конференции «Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных
процессов» (Новосибирск, 2015), Пленуме «Методологические проблемы изучения, оценки и регламентирования химического загрязнения окружающей среды и его влияние на здоровье населения» (Москва, 2015, 2016, 2017), VIII Международной научно-практической конференции «Topical areas of fundamental and applied research VIII» (North Charleston, USA, 2016).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 61 научная работа, среди которых 38 статей (в том числе 29 статей в журналах, включенных в перечень ВАК РФ и 9 статей в рецензируемых журналах), 1 монография, 1 патент, 1 препринт.
Финансовая поддержка:
Диссертационная работа выполнялась при финансовой поддержке грантов: «Старт» № 7371 (2007-2008 г.г.) «Исследование химического состава, гепатопротекторных, антиоксидантных и антирадикальных свойств экстрактов из отходов от переработки дикоросов Уссурийской тайги»; «Старт» № 9177 (2009-2010 г.г.) «Исследование нарушений метаболических реакций при стрессе в экспериментальных и натурных условиях и их коррекция экстрактами из растений Дальнего Востока». В соответствии с тематическим планом научно-исследовательской работы Школы биомедицины Дальневосточного федерального университета.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 374 листах компьютерного текста, состоит из 10 глав, содержит введение, обзор литературы, описание материалов и методов исследования, описание результатов собственных исследований, обсуждение результатов и выводы. Список литературы содержит 504 источника (225 отечественных и 279 зарубежных авторов). Диссертация иллюстрирована 59 таблицами и 107 рисунками.
Фенольные соединения с двумя ароматическими кольцами
Наиболее обширная (около 8000) группа природных полифенольных соединений представлена флавоноидами, в основе молекулы которых лежит так называемый С6-С3-С6-скелет, представленный структурой флавана (Ross, Kasum, 2002). 2
В зависимости от наличия в кольце С двойной связи между углеродными атомами 2 и 3, гидроксильных групп и карбонила выделяют следующие основные классы флавоноидов: дигидрофлавоны (флаваноны), дигидрофлавонолы (флаванонолы), халконы, флавоны, флавонолы, флаван-3-олы (катехины), флаван-3,4-диолы (проантоцианидины) и антоцианидины.
Флаваноны – небольшая группа флавоноидов, в основе структуры которых лежит нестойкое дигидро-7-пироновое кольцо (Ajmala et al., 2017). Они обнаружены в семействе Rosaceae, Rutaceae, Fabaceae и Asteraceae. Наиболее значительные их количества встречаются у цитрусовых. Гесперетин и его гликозид гесперидин содержатся в мякоти апельсина, лимона и цитрона, гликозид нарингин придает горьковатый вкус грейпфрутам, эриодиктиол содержится в лимонах. Нарингин обладает защитным эффектом на цитохром Р-450 в условиях интоксикации бенз(а)пирреном и другими химическими веществами (Ueng et al., 1999). Дигидрокверцитин - природное соединение, выделенное из древесины сибирской (Даурской) лиственницы. Обладает антиоксидантными и антивирусными свойствами (Galochkina et al., 2016), снижает артериальное давление (Slashcheva et al., 2016; Plotnikov et al., 2017), ингибирует фосфолипазы (Guseva et al., 2015). Системное профилактическое введение дигидрокверцетина в продуты питания позволяет продлить жизнь нормального человека на 20-25 лет (Lee et al., 2017; Santi et al., 2017; Kay et al., 2017).
Флавонолы наряду с флавонами относятся к желтым пигментам растений, издавна применявшимся для крашения различных тканей. Для них характерно наличие гидроксильной группы у 3 углеродного атома. Они принадлежат к числу наиболее окисленных флавоноидных соединений. Флавонолы наиболее широко, практически повсеместно, распространены в мире растений, в особенности такие их представители, как кемпферол, кверцетин, мирицетин и их многочисленные производные (Graefe et al., 1999). Как мирицетин, так и кверцетин активно снижают липогенез в адипоцитах и являются медиаторами липолиза (Kuppusamy, Das, 1994; Ong, Khoo, 1997). Дополнительное разнообразие в их структуру вносят многочисленные соединения с сахарами – гликозиды. Так, гликозид кверцетина носит название рутина. Этот наиболее широко применяемый в медицине препарат витамина Р (хотя и уступающие по активности катехинам) первоначально был выделен из руты, а в настоящее время получается из софоры и других источников – гречихи, цитрусовых (Rabadn-Chvez et al., 2016; Sansone et al., 2017; Huang et al., 2017; Pinent et al., 2017).
Флавоноиды различной структуры встречаются практически во всех растениях. В настоящее время известно около 4000 видов природных флавоноидных соединений различной структуры, однако есть представители растительного мира, особенно богатые этими соединениями. К ним относятся, например, плоды боярышника и расторопши пятнистой, трава зверобоя, прополис, листья гинкго билоба, косточки и кожура винограда (Тараховский и др., 2013; Zhou et al., 2017; Adaszyska-Skwirzyska, Dzicio, 2017; Ben Ahmed et al., 2017). Основными источниками поступления флавоноидов в организм человека служат напитки (чай, сок, вино), а также овощи и фрукты. Среднестатистическое поступление флавоноидов в организм человека составляет от 600 до 1500 мг/день (Kuhnau, 1976), что создает в тканях и биологических жидкостях их значительные фармакологические концентрации. Много фенольных соединений содержится в различных сортах чая, и в том числе свободных гликозилированных и полимеризованных флавоноидов (около 30-40 мг/л напитка, заваренного по стандартной технологии). В некоторых странах Западной Европы на чай приходится около 60% всех потребляемых пожилыми людьми флавоноидов, в том время как с яблоками - поступает только 10%. Флавоноиды обладают бактерицидными свойствами (Aires et al., 2017; Miyamoto et al., 2017). С пищей в организм человека флавоноиды поступают в мономерной, димерной или полимерной формах (рис. 1.1.2.1).
Полимерные формы называют таннинами, они могут быть гидролизуемыми, «сложными» (частично гидролизуемыми) или конденсированными (негидролизуемыми). Гидролизуемые таннины представляют собой соединения, синтезирующиеся в растениях в результате этерификации глюкозы или других сахаров с галловой кислотой (галлотаннины) или её димером, метадигалловой кислотой (эллаготаннины); в водной среде последняя спонтанно дегиратируется с образованием соответствующего лактона эллаговой кислоты (Suvanto et al., 2017). В «сложных» таннинах флаван-3-олы, которые называются также катехинами, связаны с галло- или эллаготаннинами гликозидными связями. По этим связям и осуществляется гидролиз соединений данного типа. Конденсированные таннины представляют собой олигомеры или полимеры, состоящие из флаван-3-олов (Hammerstone et al., 2000). Катехиновые единицы в проантоцианидинах в основном связаны через атомы углерода, находящиеся в 4, 8 или 6 положениях. Такие проантоцианидины относятся к типу В (димеры) и типу С (тримеры) (Рис.1.1.2.1). Проантоцианидины, в которых мономерные единицы связаны двумя связями (одной С-С и одной С-О), относятся к А типу (Рис. 1.1.2.1). Они обнаруживаются в некоторых пищевых растениях, таких как какао, чайные листья (Moore et al., 2009), ягоды клюквы (Porter, 1994), напитки из фруктов и вина, бобы, пшеница, кофе, яблочный сидр и др.
Катехины – бесцветные соединения. Свое название получили от экстракта индийской акации катеху (Acacia catechu), который используется в качестве дубильного вещества в Японии и Малайзии при обработке и окраске кожи в желто-коричневый цвет, так как он богат таннинами и катехинами (Li et al., 2011; Dos Santos et al., 2017).
Очень легко окисляются, благодаря чему приобретают различные цвета. Ярким проявлением такого окисления можно рассматривать чай. Черный, красный, желтый цвета чая зависят от степени окисления катехинов. Катехины содержатся также в цитрусовых соках и обладают антибактериальной активностью (Monga et al., 2011). Они содержатся в бобах какао, яблоках, грушах, вишне, айве, малине, землянике, смородине, винограде. Зеленый чай наиболее богат катехинами: листья зеленого чая содержат 51-84 мг катехинов на грамм сухого веса, что в несколько раз больше, чем в черном чае (Khokhar, Magnusdottir, 2002; Chiu, 2006). Эти соединения обладают выраженными антиоксидантными свойствами (Koleckar et al., 2008; Ho et al., 2009), благодаря способности связывать свободные радикалы (Mangels et al., 2017). Катехины обладают свойством повышать функциональную активность систем детоксикации чужеродных соединений (увеличению синтеза и активности супероксиддисмутазы, глутатион-пероксидазы, глутатионредуктазы, глататион-S-трансферазы, каталазы и хиноредуктазы) (Hwang et al., 2012; Fan et al., 2017) и за счет этих свойств существенно снижать риск развития опухолей молочных желез, простаты, легких, кишечника и др. (Abe et al., 2000; Mizugaki et al., 2000; Monga et al., 2011; Sae-Leaw et al., 2017; Naponelli et al., 2017). Ежедневное потребление экстракта кожицы винограда повышало антиоксидантные свойства плазмы крови у крыс как в нормальных условиях, так и при интоксикации четыреххлористым углеродом (Lionetto et al., 2011). Катехины активно включаются в липидный метаболизм, снижая концентрацию холестерина за счет уменьшения количества липопротеинов низкой плотности (Kim et al., 2011). Олигомерные формы катехинов используются в профилактике различных заболеваний: способствуют укреплению сердечно сосудистой системы (Babu, Liu, 2008), препятствуют ожирению (Rains et al., 2011) и развитию болезней Паркинсона и Альцгеймера (Mandel et al., 2008). Эпигаллокатехингаллат считается наиболее активным среди полифенолов: обладает антиканцерогенным действием, благодаря способности инициировать апоптоз у быстро делящихся клеток опухоли (Stuart et al., 2006; Yang, Wang, 2011). Три чашки зеленого чая в день обеспечивают поступление примерно 240-320 мг полифенолов.
Исследование хронической токсичности
Эксперимент проводили на крысах-самцах линии Вистар, находящихся в стандартных условиях вивария и на стандартном рационе питания (Западнюк и др., 1974). Ежедневно проводили замеры потребления водных растворов исследуемых экстрактов из градуированных поилок. Водные растворы являлись единственным источником жидкости для животных. Контрольные животные потребляли водопроводную воду.
Перед смешиванием с водой исходный экстракт упаривали на роторном испарителе для удаления этанола. Полученный после упаривания препарат доводили дистиллированной водой до первоначального объема. Стандартизацию растворов экстрактов проводили по количеству общих фенолов. Приготовление растворов для потребления крысами проводили следующим образом: экстракт из винограда, калины, жимолости и рябины (количество общих фенолов в экстрактах составляло 30-35 г/л) вносили в количестве 6%, тогда как экстракт из осей соцветий аралии и лимонника (количество общих фенолов составляло 14-15 г/л) в количестве 13%. Такие количества внесенных экстрактов соответствовали дозе общих фенолов 20 мг/200 г массы животного в сутки, что согласуется с известной дозой общих фенолов в количестве 100 мг/кг/сутки (Венгеровский и др.,1999).
Как видно из таблицы 4.2.1, удельное потребление водных растворов в течение 6 месяцев не отличалось от такового у контрольных крыс. Животные также не отличались внешне по состоянию шерсти, поведению, весовым характеристикам.
При изучении содержания общего белка и белковых фракций в сыворотке крови крыс в динамике эксперимента (табл. 4.2.2) было показано отсутствие изменений от контрольного уровня, что является важным критерием состояния физиологической нормы организма. Величины изученных параметров соответствовали известным в литературе данным для крыс (Западнюк и др., 1974).
Изучение осмотической резистентности эритроцитов крыс к повреждающему действию NaCl показало, что потребление всех растворов в течение 6 мес сопровождалось тенденцией к повышению устойчивости мембран (табл. 4.2.3), так как и начало и завершение гемолиза эритроцитов происходят при меньшей концентрации NaCI по сравнению с контролем.
Согласно данным литературы фенольные структуры образуют сшивки между монослоями фосфолипидов в мембранах, обеспечивая более плотную упорядоченность жирнокислотных цепей фосфолипидов, что способствует устойчивости мембран к повреждающему агенту (Huh et al.,1996).
Концентрация натрия и калия в плазме крови сохранялась в пределах физиологической нормы для крыс (табл. 4.2.4).
Исследование водных растворов экстрактов на эмбриотоксичность (табл. 4.2.5) показало, что постимплантационная гибель плодов в группе животных, получавших водные растворы экстрактов на 10, 11, 12-й дни беременности, составляла в среднем 2,94-3,92% и статистически достоверно не отличалась от соответствующего показателя в контрольной группе.
Средняя масса плода также соответствовала контрольному показателю. При внешнем осмотре плодов аномалий развития обнаружено не было. Потребление водных растворов экстрактов беременными самками крыс не влияло как на ранний эмбриогенез, так и на период органогенеза. Следовательно, водные растворы экстрактов не оказывают эмбриолетального и тератогенного действия.
Как видно из таблицы 4.2.6, исследование в ткани печени динамики активности лизосомальных ферментов, инициирующих распад гликопротеинов (-галактозидаза и -глюкозидаза), а также ферментных систем, участвующих во второй фазе метаболизма ксенобиотиков (-глюкуронидаза и УДФ-глюкуронилтрансфераза), показало отсутствие статистически достоверных различий от контрольных величин.
Содержание гексуроновых кислот, участвующих в реакции коньюгации, также находилось в пределах нормы.
Динамика содержания малонового диальдегида в печени крыс в течение 6 мес потребления водных растворов экстрактов представлена в табл. 4.2.7. Наблюдения за животными показали, что длительный прием водных растворов экстрактов не оказывает токсического действия на организм крыс. Подтверждением этого является отсутствие статистически достоверных различий от контроля в содержании малонового диальдегида, являющегося показателем перекисного окисления липидов.
В то же время, при исследовании количественных характеристик общих фосфолипидов в печени крыс при потреблении водных растворов экстрактов отмечалось увеличение этого показателя (табл. 4.2.8). Так, через месяц потребления водных растворов экстракта винограда, калины, жимолости и рябины увеличение составляло 8% (р 0,05-0,01) от контрольной величины.
Через 6 мес количество общих фосфолипидов выросло до 69,2+1,3% при потреблении водного раствора экстракта жимолости, что отличалось от контроля на 5% (р 0,05). Через 6 мес потребления растворов с экстрактом винограда и жимолости количество общих фосфолипидов в печени увеличилось, в среднем, на 6% (р 0,05-0,001).
При исследовании количественных характеристик фракций нейтральных липидов печени через 6 мес потребления водных растворов экстрактов отмечалось снижение триацилглицеринов во всех группах (табл. 4.2.9) в среднем на 9-11% (р 0,01-0,001). В содержании остальных фракций достоверных различий с контролем не обнаружено.
Исследование изменений в содержании фракций нейтральных липидов в печени крыс показало статистически достоверное снижение триацилглицеринов и увеличение эфиров холестерина. Это обусловлено активацией этерифицирующей функции печени. Подтверждением этого вывода является повышение количества общих фосфолипидов в результате их синтеза из триацилглицеринов. Это доказывает и сильная обратная корреляционная связь между увеличением количества фосфатидилхолина и снижением количества триацилглицеринов (r = -0,82; р 0,05).
Гипохолестеринемический эффект обусловлен тем, что растительные фенольные соединения активируют фермент 7-холестерингидроксилазу, участвующего в окислении ХС в желчные кислоты (Yang et al., 2000) Исследование количественных характеристик фосфолипидных фракций печени крыс через 6 мес потребления водных растворов экстрактов (табл. 4.2.10) показало достоверное увеличение фосфатидилхолина в среднем на 4-5% (р 0,05). Одновременно снизилось количество лизофосфатидилхолина во всех группах в среднем на 35-39% (р 0,001).
Это подтверждают известные в литературе данные об ингибировании фосфолипаз растительными фенольными соединениями (Kropacova et al., 1998). Обращает на себя внимание рост количества фосфатидной кислоты во всех группах в среднем на 13-17% (р 0,05-0,01). По-видимому, ее синтез произошел из триацилглицеринов, количество которых достоверно снижалось во всех группах. Так как количество дифосфатидилглицерина, необходимого для нормального функционирования компонентов дыхательной цепи (цитохромов), не отличалось от контрольного уровня, то это означает, что эти экстракты не вызывают разобщения дыхания и окислительного фосфорилирования.
Анализ величин жирных кислот в общих липидах печени крыс после 6-ти месячного потребления водных растворов экстрактов представлен в табл. 4.2.11.
Влияние интоксикации ацетоном на физиологические и биохимические показатели организма крыс
По фармакологическим свойствам ацетон относится к числу веществ, проявляющих наркотическое действие. Он обладает кумулятивными свойствами и медленно выводится из организма. Наряду с молекулярной формой ацетон также присутствует в организме в виде кето-енольных таутомеров, являющихся нуклеофилами, что приводит к образованию токсических метаболитов. Метаболизм ацетона происходит, главным образом, в печени путем окисления в ацетат, формиат и диоксид углерода (Kumagai, Matsunaga, 1995 с участием НАД -зависимых ферментов ) + .
Известно, что при острых и хронических отравлениях ацетоном развиваются гематологические нарушения, дисфункция печени и неврологические заболевания (Muttray et al., 2005).
Эксперимент проводили на крысах самцах Вистар массой 180-200 г, содержащихся в стандартных условиях вивария. Животных (20 крыс) помещали в специальную затравочную камеру Б.А. Курляндского при концентрации ацетона 300 мг/м3 (ПДК составляет 200 мг/м3). Ингаляцию осуществляли в течение 6 часов 5 раз в неделю на протяжении 3-х недель.
После интоксикации ацетоном животных разделили на 2 группы по 10 крыс в каждой. 10 крыс после интоксикации ацетоном и 10 крыс контрольной группы были выведены из эксперимента методом декапитации под легким эфирным наркозом. Оставшихся 10 животных после интоксикации ацетоном поместили в обычные клетки и в течение 7 дней они находились в стандартных условиях вивария (период отмены токсиканта).
Через 7 дней оставшихся 10 животных контрольной группы и 10 животных группы отмены выводили из эксперимента методом декапитации под легким эфирным наркозом. Контрольные животные находились в стандартных условиях вивария. Таким образом, животные были разделены на 3 группы: 1-я группа (контроль) - интактные животные; 2-я - интоксикация ацетоном в течение 3-х недель; 3-я - интоксикация ацетоном в течение 3-х недель с последующей отменой в течение 7 дней.
Кровь
Исследование показателей лейкоцитарной формулы крови после интоксикации ацетоном отмечалось достоверное снижение количества лимфоцитов на 11% (49,10±0,71% против с 55,06±0,78% в контроле; р 0,001), а эозинофилов - на 13% (3,30±0,11% против 3,80±0,13% в контроле; р 0,01). При этом индекс интоксикации вырос на 33% (р 0,001), что составляло 0,16±0,01 по сравнению с 0,12±0,01 в контроле. В период отмены токсиканта (3 группа) количество лимфоцитов еще более снизилось - до 47,93±1,22%, что на 13% (р 0,001) ниже контроля, при этом количество эозинофилов было ниже котроля на 8% (3,49±0,11%; р 0,001). Значение индекса интоксикации оставалось на уровне таковой величины во 2-й группе - 0,16±0,01 (р 0,001). По соотношению показателей в лейкоцитарной формуле по Л.Х. Гаркави (1977) интоксикацию ацетоном можно отнести к острому стрессу.
Биохимические показатели крови крыс после интоксикации ацетоном имели статистически достоверные отклонения от контроля (табл. 6.2.3.1). Так, активность печеночного фермента АлАТ в сыворотке крови увеличилась почти в 2 раза (р 0,001). Аналогичная направленность изменений отмечалась в активности цитозольного фермента лизосом -галактозидазы, которая увеличилась на 25% (р 0,001). В то же время, количество окисленной формы НАД+ снизилось на 53% (р 0,01), что указывает на истощение этих макроэргов в связи с блокированием реакций по их реокислению из НАДН (Кушнерова, 2012).
Количество лактата увеличилось на 58% (р 0,001) при одновременном снижении пирувата на 21% (р 0,001). В связи с этим соотношение НАД+/НАДН снизилось до 72 (146 в контроле). Интоксикация ацетоном сопровождалась снижением активности супероксиддисмутазы на 42% (р 0,001). Это обусловило усиление прекисного окисления липидов, что подтверждается увеличением количества малонового диальдегида на 22% (р 0,001). Количество общих фосфолипидов при этом уменьшилось на 20% (р 0,001), а количество холестерина увеличилось на 18% (р 0,01). В результате коэффициент холестерин/фосфолипиды увеличился до 1,53 (в контроле - 1,03). Количество суммарной фракции липопротеинов очень низкой и низкой плотности выросло на 50% (р 0,001), а количество липопротеинов высокой плотности, наоборот, снизилось на 31% (р 0,001). То есть, интоксикация ацетоном сопровождается дислипопротеинемией.
В период отмены токсиканта (3 группа) активность АлАТ была выше контроля на 30% (р 0,001). Однако по сравнению со 2-й группой величина активности была ниже на 32%. Активность -галактозидазы оставалась на уровне таковой величины во 2-й группе, что на 26% (р 0,001) выше контроля. При этом количество НАД+ увеличилось по сравнению со 2-й группой, но по сравнению с контролем было ниже на 32% (р 0,05). Величина лактата была выше контроля на 39% (р 0,001), а пирувата ниже на 21% (р 0,001), как таковая величина во 2-й группе. В связи с этим соотношение НАД+/НАДН составляло 83. Активность супероксиддисмутазы в период отмены сохранялась низкой (на 39% ниже контроля, р 0,001). В связи с этим количество малонового диальдегида было больше контрольной величины на 28% (р 0,001). В липидной составляющей сыворотки крови количество общих фосфолипидов было ниже контроля на 12% (р 0,05), а холестерина выше на 10% (р 0,05). При этом коэффициент холестерин/фосфолипиды составлял 1,3. Величина суммарной фракции липопротеинов очень низкой и низкой плотности была еще высокой (на 43% выше контроля; р 0,001). В то же время величина липопротеинов высокой плотности была на 27% (р 0,001) ниже контрольного значения.
При исследовании количественных характеристик фракций нейтральных липидов в сыворотке крови при интоксикации ацетоном отмечалась гипертриглицеринемия и гиперхолестеринемия (рис. 6.2.3.1).
Количество триацилглицеринов увеличилось на 14% (р 0,01), а свободных жирных кислот на 23% (р 0,01) превышало контрольный уровень. При этом количество эфиров жирных кислот и эфиров холестерина снизилось на 8% (р 0,05) и 16% (р 0,001), соответственно.
В период отмены воздействия ацетона (3 группа) количество триацилглицеринов сохранилось на уровне таковой величины во 2-й группе, в то же время количество свободных жирных кислот снизилось по сравнению со 2-й группой, однако еще на 8% (р 0,05) было выше контроля. Сохранялось пониженным значение эфиров холестерина, которое на 15% (р 0,001) отличалось от контроля.
Анализ показателей фосфолипидных фракций в сыворотке крови крыс после интоксикации ацетоном показал снижение количества фосфатидилхолина на 5% (р 0,01) по сравнению с таковым значением в контроле (рис.6.2.3.2). Также снизилось количество фосфатидилэтаноламина на 23% (р 0,01). Одновременно увеличивалось количество лизофракций: лизофосфатидилхолина на 36% (р 0,001) и лизофосфатидилэтаноламина на 59% (р 0,001). Количество сфингомиелина увеличилось на 35% (р 0,001).
Среди метаболически активных фракций снизилось количество фосфатидилинозита на 13% (р 0,01), фосфатидилсерина - на 35% (р 0,001) и дифосфатидилглицерина - на 24% (р 0,001). При отмене токсиканта (3 группа) в течение 7 дней по сравнению со 2 й группой отмечалось небольшое увеличение количества фосфатидилхолина и фосфатидилэтаноламина, однако по сравнению с контролем эти величины все еще были ниже, соответственно, на 3% (р 0,05) и 12% (р 0,05). Также сохранялось повышенное количество лизофракций фосфолипидов: лизофосфатидилхолина на 25% (р 0,001) и лизофосфатидилэтаноламина на 39% (р 0,001). Однако относительно 2-й группы их величины были значительно ниже. Также отмечался повышенный уровень сфингомиелина (на 11% выше контроля; р 0,01). Количество метаболически активных фракций повысилось по сравнению со 2-й группой, в то же время по сравнению с контролем их значения еще оставались достоверно низкими. Так, количество фосфатидилинозита было снижено на 10% (р 0,01), фосфатидилсерина - на 12% (р 0,001), а дифосфатидилглицерина - на 18% (р 0,01).
Анализ жирнокислотных спектров общих липидов сыворотки крови крыс после интоксикации ацетоном показал рассогласование в соотношении жирных кислот относительно контрольных значений (рис. 6.2.3.3).
Влияние растительных фенольных комплексов на физиологические и биохимические показатели крови и эритроцитов студентов начальных курсов очного обучения в ВУЗе (психоэмоциональный стресс)
Как отмечалось в подглаве 7.2.1. под влиянием эмоциональной и умственной нагрузки, испытываемой учащимися, в организме возникают изменения функциональных и биохимических показателей. У большинства студентов отмечается повышенный уровень холестерина в крови, снижение показателей антиоксидантной защиты организма, что согласуется с данными литературы (Кушнерова и др., 2002; Кушнерова и др., 2002а; Sparling, Snow. 1999). В связи с этим является необходимым принятие специальных профилактических и коррекционных мер с целью укрепления здоровья и повышения умственной работоспособности студенческой молодежи.
Для обеспечения здорового образа жизни и высокой трудоспособности в современных условиях важно очень внимательно относиться к качественному составу пищи. Роль питания в обеспечении здоровой жизнедеятельности организма является определяющей, так как способствует оптимальному росту и развитию человеческого организма, его трудоспособности, адаптации к воздействию различных агентов внешней среды и, в конечном итоге, оказывает определенное влияние на длительность жизни и активную деятельность человека (Тутельян, 2004). На современном этапе развития общества в производстве продуктов здорового питания широко используются комплексы биологически активных веществ, которые влияют на функции тех или иных систем организма (Нечаев, 2005). Отсюда растущая популярность функциональных ингредиентов, повышающих резистентность организма человека к различным заболеваниям, способные сохранять и стабилизировать метаболические процессы в организме и тем самым участвовать в сохранении его активности. В последнее время особое внимание уделяется функциональным ингредиентам природного происхождения, обладающими антиоксидантными и антирадикальными свойствами. Это обусловлено, с одной стороны, их постоянным и выраженным дефицитом в питании, а с другой - исключительной эффективностью в предотвращении развития стресс-индуцированных состояний, которые могут привести к срыву адаптации и развитию болезней стресса (язва желудочно-кишечного тракта, гипертоническая болезнь, инфаркт миокарда, сахарный диабет и др.) (Суханов, Керимова, 2004). Среди соединений антиоксидантного действия наиболее перспективными являются комплексы природных фенольных соединений, которые входят в состав растительных продуктов, традиционно употребляемых человеком в пищу и являются эволюционно-адаптированными для человеческого организма. Одними из наиболее массовых оздоровительных продуктов и доступных для всех групп детского и взрослого населения, по мнению технологов, могут стать в России фруктово-ягодные кондитерские изделия: желированные джемы, мармелад и фруктово-ягодные желе, содержащие биологически активные вещества растительного происхождения, обладающие высокой биологической ценностью. При этом содержащийся в них агар-агар может служить носителем фенольного комплекса. В связи с этим на кафедре товароведения и экспертизы продовольственных товаров Института пищевых технологий и товароведения Тихоокеанского государственного экономического университета был создан функциональный пищевой продукт (ФПП) - мармелад желейный «Биолад-калина», в состав которого была введен экстракт калины. Добавка вводилась в мармелад перед его розливом, что обеспечивало полную сохранность полезных свойств фенольных соединений экстракта калины (ТУ 9128-152-02067936-2006).
В подглаве 7.2.1. были рассмотрены изменения исследованных физиологических и биохимических показателей крови во 2-й группе (студенты до приема ФПП) относительно контроля (1-я группа - доноры). В настоящей главе мы рассмотрим в сравнительном аспекте изменения в 3-й группе (студенты после приема ФПП) относительно 2-й группы (студенты до приема ФПП). Таким образом, было проведено обследование 10 студентов-мужчин в возрасте 20-22 лет. Во 2-ю группу вошли 10 студентов-мужчин до приема ФПП, 3-я группа - 10 студентов-мужчин 2-й группы, которым после биохимического обследования крови было предложено ежедневно утром принимать в течение 6-ти недель по 100 г ФПП мармелад с экстрактом калины, что соответствовало 100 мг общих фенольных соединений в сутки.
Исследование величин показателей лейкоцитарной формулы крови студентов после приема ФПП показало их полную нормализацию. То есть, прием ФПП с полифенольным комплексом из экстракта калины нивелировало воздействие психоэмоционального стресса на организм студентов.
Сыворотка крови
Количество НАД+ в крови студентов после приема ФПП соответствовало таковой величине в контроле. Однако при сравнении этого значения с таковым во 2-й группе (до приема ФПП) отмечалось увеличение на 35% (р 0,05) (табл. 9.2.1). Количество общих фосфолипидов и холестерина в сыворотке крови после приема ФПП также соответствовало контрольным показателям, в то же время при их сравнении с таковыми во 2-й группе выявлены статистически достоверные различия.
Количество общих фосфолипидов увеличилось в сыворотке крови студентов после приема ФПП на 15% (р 0,001), а значение холестерина снизилось на 28% (р 0,001), что обусловило снижение коэффициента холестерин/фосфолипиды до 0,43 (во 2-й группе - 0,69).
Прием студентами ФПП сопровождался нормализацией фосфолипидного состава сыворотки крови. В то же время при сравнении величин фосфолипидных фракций в сыворотке крови студентов после приема ФПП с таковыми до приема (2 группа) отмечались статистически достоверные различия (рис. 9.2.1). Обращает на себя внимание снижение количества лизофосфатидилхолина на 18% (р 0,05) и лизофосфатидилэтаноламина на 21% (р 0,05) по сравнению с таковыми показателями во 2-й группе. Количество суммарной фракции фосфатидилинозит+фосфатидилсерин увеличилось на 14% (р 0,05), а дифосфатидилглицерина - на 34% (р 0,05), что связано с ингибированием активности фосфолипаз полифенолами, входящими в состав ФПП.
Увеличение количества дифосфатидилглицерина, являющегося важной составляющей мембран митохондрий, обусловливает, по нашему мнению, отмечаемое студентами повышение работоспособности, общего тонуса и настроения.
Эритроциты
При сравнении фосфолипидного состава мембран эритроцитов студентов после приема ФПП (3 группа) с таковым в контроле следует отметить нормализующий эффект: количество практически всех исследованных фосфолипидных фракций не отличалось от контрольных величин, за исключением повышенного содержания фосфатидной кислоты (на 10%, р 0,001). Однако это позитивный фактор, так как, по-видимому, происходит преобразование триацилглицеринов сыворотки крови в фосфатидную кислоту, которая является основой для синтеза всех глицерофосфолипидов.
При сравнении величин липидных фракций эритроцитарных мембран между 2-й и 3-й группами были отмечены достоверные различия (рис. 9.2.2).
Количество холестерина в эритроцитарных мембранах после приема ФПП снизилось на 12% (р 0,001). В фосфолипидном спектре отмечалось уменьшение количества лизофосфатидилхолина на 21% (р 0,001), а сфингомиелина - на 6% (р 0,001) при одновременном повышении фосфатидной кислоты на 46% (р 0,001). Такие изменения в липидной составляющей мембран эритроцитов свидетельствуют о мембранопротекторном эффекте ФПП, содержащего природный растительный фенольный комплекс в составе мармелада. Анализируя результаты исследования по применению функционального пищевого продукта мармелада «Биолад-калина» следует отметить целесообразность его использования как функционального пищевого продукта для профилактики стресса, вызванного повышенной умственной и эмоциональной нагрузкой.