Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 11
1.1 Современные представления об эпилепсии 11
1.2 Методология создания противоэпилептических препаратов 16
1.3 Характеристика противоэпилептических препаратов 20
1.4 Участие нейрохимических механизмов в эпилептогенезе и реализации противосудорожного действия противоэпилептических препаратов 42
2. Материалы и методы 58
2.1 Экспериментальные животные 58
2.2 Используемые вещества 58
2.3 Дизайн исследования 60
2.4 Методы, используемые в исследовании 63
2.4.1 Тест максимального электрошока (МЭШ) 63
2.4.2 Тест электрошока с током малой силы 63
2.4.3 Судороги, вызванные коразолом при его подкожном введении 64
2.4.4 Тест вращающегося стержня (Rota Rod) 65
2.4.5 Тест подтягивание на горизонтальной перекладине 65
2.4.6 Методика оценки острой токсичности 65
2.4.7 Методика аудиогенных эпилептоформных припадков 66
2.4.8 Модель очаговой эпилепсии, вызванной аппликацией кобальта на сенсомоторную кору крыс 66
2.4.9 Модель эпилептического статуса 69
2.4.10 Метод высокоэффективной жидкостной хроматографии с флуоресцентной детекцией 71
2.4.11 Выделение плазматических мембран структур головного мозга 72
2.4.12 Радиолиандный анализ 73
2.4.13 Морфологический контроль .74
2.4.14 Методы статистической обработки 75
3. Результаты исследования 76
3.1 Скрининг производных оксимов 3- и 4-бензоилпиридина 76
3.1.1 Исследование противосудорожной активности производных оксимов 3-бензоилпиридина в тесте максимального электрошока (МЭШ) 76
3.1.2 Исследование противосудорожной активности производных оксимов 4-бензоилпиридина в тесте максимального электрошока (МЭШ) 78
3.1.3 Исследование противосудорожной активности производных оксимов 3 и 4-бензоилпиридина в тесте антагонизма с коразолом 81
3.1.4 Изучение возможных побочных эффектов оксимов 3-бензоилпиридина 83
3.1.5 Изучение возможных побочных эффектов оксимов 4-бензоилпиридина 85
3.1.6 Изучение острой токсичности производных оксимов 3- и 4-бензоилпиридина 88
3.1.7 Анализ закономерности зависимости между химическим строением и противосудорожной активностью 90
3.1.8 Выделение соединения с наилучшим соотношением доза/эффект, расчет терапевтической широты и определение соединения-лидера 92
3.2 Изучение противосудорожного действия соединения ГИЖ-298 на модели очаговой эпилепсии, индуцированной кобальтом .93
3.2.1 Динамика эпилептической активности у контрольной группы крыс с кобальт-индуцированной эпилепсией 93
3.2.2 Влияние соединения ГИЖ-298 на первой стабильной стадии развития эпилептической системы на модели кобальтовой эпилепсии 96
3.2.3 Влияние соединения ГИЖ-298 на второй стабильной стадии развития эпилептической системы на модели кобальтовой эпилепсии 99
3.3 Изучение противосудорожного действия соединения ГИЖ-298, топирамата и вальпроевой кислоты на модели эпилептического статуса 103
3.4 Изучение противосудорожного действия соединения ГИЖ-298 и топирамата на модели судорог, вызванных электрошоком малой силы тока 116
3.5 Изучение противосудорожного действия соединения ГИЖ-298, вальпроевой кислоты и топирамата на модели аудиогенных судорог у крыс Крушинского-Молодкиной 118
3.6 Изучение нейрохимических механизмов действия соединения ГИЖ-298 119
3.6.1 Изучение влияния ГИЖ-298 на нарушенные МЭШ уровни и оборот моноаминов во фронтальной коре, прилежащем ядре, гипоталамусе, стриатуме и гиппокампе мозга крыс 119
3.6.2 Изучение влияния соединения ГИЖ-298 на связывание с NMDA-, mGluII- и 5НТ2А-рецепторами в опытах ex-vivo и in-vitro 124
4. Обсуждение результатов 128
5. Заключение 139
Выводы 142
Практические рекомендации 144
Список сокращений и условных обозначений 145
Список литературы 147
- Характеристика противоэпилептических препаратов
- Участие нейрохимических механизмов в эпилептогенезе и реализации противосудорожного действия противоэпилептических препаратов
- Исследование противосудорожной активности производных оксимов 4-бензоилпиридина в тесте максимального электрошока (МЭШ)
- Изучение влияния соединения ГИЖ-298 на связывание с NMDA-, mGluII- и 5НТ2А-рецепторами в опытах ex-vivo и in-vitro
Характеристика противоэпилептических препаратов
Фенобарбитал (5-этил-5-фенил-2,4,6(1Н,3Н,5Н)-пиримидинтрион). История открытия фенобарбитала связана с синтезом барбитуровой кислоты немецким химиком лауреатом нобелевской премии Адольфом Фон Байером в 1864 г. Хотя сама барбитуровая кислота не оказывает выраженного влияния на ЦНС, по причине недостаточной липофильности для проникновения через ГЭБ, она сформировала основу для дальнейшего развития ЦНС-активных барбитуратов. В 1903 г. два немецких химика, работавших в компании Байер, Эмиль Фишер и Йозеф фон Меринг обнаружили, что более липофильное производное барбитуровой кислоты (5,5-дифенилбарбитуровая кислота) очень эффективно в вызывании сна у собак. Этой же группой ученых в 1911 г. был синтезирован фенобарбитал (5-этил-5-фенилбарбитуровая кислота). Вскоре, барбитал (Веронал) и фенобарбитал (Люминал) продавались как снотворные для пациентов с бессонницей [74].
В 1912 г. немецкий психиатр Альфред Гауптман обнаружил противосудорожную активность фенобарбитала, который быстро вытеснил бромиды, как эффективный и безопасный метод лечения [154]. Барбитураты обладают существенными побочными эффектами, такими как физическая зависимость при длительном лечении, что может привести к наркомании, обострению приступов после отмены и смертельным исходам в результате передозировки [146], что привело к заметному снижению терапии барбитуратами в последние десятилетия, особенно после клинического введения намного более безопасных бензодиазепинов в конце 1950 годов. Тем не менее, несколько барбитуратов осталось на рынке, в частности фенобарбитал до сих пор широко используется в качестве противосудорожного и седативного/снотворного препарата, особенно в развивающихся странах. Фенобарбитал применяется как препарат первой линии или как дополнительное средство при терапии парциальных и генерализованных припадков, эпилептический статуса, неонатальных судорог. Фенобарбитал неэффективен при абсансных припадках. Механизм действия фенобарбитала связан с усилением активности системы ГАМК. Показано, что фенобарбитал имеет тропность к ГАМКА-рецептору и увеличивает продолжительность открытия хлорного канала [90], увеличивая тем самым поток Cl-, что приводит к гиперполяризации постсинаптической мембраны нейронов и прерыванию распространения эпилептической активности [295]. Частота открытия ионного канала при этом не меняется. Фенобарбитал может активировать ГАМКА-рецептор и в отсутствие ГАМК [90].
Фенобарбитал имеет много побочных эффектов, основными из которых являются следующие: седация, атаксия, головокружение, агрессивность, когнитивные расстройства, кожная гиперчувствительность, индукция ферментов, а также может вызывать физическую зависимость.
Фенитоин (5,5-дифенилимидазолидин-2,4-дион). Применяется с 1938 г. как препарат первой линии или как дополнительный препарат при терапии парциальных и генерализованных припадков и при эпилептическом статусе. Возможно внутривенное применение. Фенитоин неэффективен при абсансных и миоклонических припадках. Противоэпилептический эффект фенитоина, как полагают, зависит от способности связываться и продлевать инактивацию натриевых вольтаж-зависимых каналов в нейрональных мембранах [166]. Этот эффект больше, когда клеточная мембрана деполяризована, чем, когда гиперполяризована. Фенитоин связывается с тем же участком натриевого канала на наружной поверхности клеточной мембраны, что и карбамазепин, и ламотриджин [166]. Тем не менее, фенитоин и карбамазепин различаются по аффинности связывания с этим сайтом [145]. Инактивация потенциал-зависимых натриевых каналов приводит к частичной деполяризации аксонов, что уменьшает их способность к передаче быстрых потенциалов действия, таких как при эпилептических разрядах. Тем не менее, влияние на потенциал действия, который проходит вдоль аксонов в нижних частотных импульсах, ниже. В высокой концентрации фенитоин может также ингибировать кальциевые каналы в терминальной части аксонов и нервов, стабилизируя аксональные клеточные мембраны и уменьшая высвобождение нейромедиаторов в ответ на потенциалы действия. Тем не менее, препарат не оказывает влияния на функционирование кальциевых каналов Т-типа в таламусе, которые важны при возникновении абсансных припадков [166]. В высоких концентрациях фенитоин ингибирует Ca2+ кальмодулин-опосредованное фосфорелирование белков [82]. Показано также, что фенитоин связывается периферическим бензодиазепиновым рецептором [103].
Фенитоин имеет много побочных эффектов, основными из которых являются следующие: атаксия, головокружение, седация, головная боль, когнитивные расстройства, депрессия, кожная гиперчувствительность, индукция ферментов, лимфоцитома кожи, миопатия, нелинейная фармакокинетика, тератогенные эффекты.
Триметадион (3,5,5-триметил-1,3-оксазолидин-2,4-дион). Применяется с 1946 г., эффективен при лечении абсансных припадков, устойчивых к терапии другими препаратами. Однако, в связи с серьезными побочными эффектами широко больше не применяется. Противоэпилептический эффект триметадиона связывают со снижением кальциевых токов через мембранные кальциевые каналы Т-типа в таламических нейронах [167; 218], включая вставочные таламические нейроны. В результате увеличивается порог для повторяющейся активности в таламусе и ингибирование кортико-таламической передачи [40; 218]. Таким образом, таламокортикальная ритмичность, которая, как полагают, лежит в основе разрядов 3 Hz спайк-волн, наблюдающихся на ЭЭГ при абсансных припадках [167], гасится [218].
Триметадион имеет много побочных эффектов, основными из которых являются следующие: головокружение, тошнота, рвота, выпадение волос, тератогенный эффект, гепатит. Примидон (5-этил-5-фенилгексагидропиримидин-4,6-дион). Препарат наиболее широкое распространение получил в 1954 г. и применяется как препарат первой линии или как дополнительный препарат при терапии парциальных и генерализованных припадков. Не эффективен при абсансных припадках. Примидон эффективен в предотвращении судорог, вызванных МЭШ, но практически неактивен в отношении судорог, индуцированных коразолом или бикукуллином. Профиль активности примидона в некоторых моделях на животных больше напоминает карбамазепин и фенитоин, чем фенобарбитал, который активен в отношении и МЭШ, и коразол-индуцированных судорог. Примидон оказывает значительно меньший нейротоксический эффект чем фенобарбитал и обладает более высоким терапевтическим индексом [44].
Противоэпилептический эффект примидона в значительной степени опосредован его метаболитом фенобарбиталом. Другой активный метаболит – фенилэтилмалонамид (ФЭМА) – также может играть роль в активности примидона в моделях на животных. В любом случае, примидон обладает самостоятельной противосудорожной активностью. Показано, что примидон в единичной дозе защищает крыс от экспериментально индуцированных судорог прежде чем метаболиты обнаруживаются в крови [30]. Аналогичная защита была продемонстрирована на мышах, когда биотрансформация примидона задерживалась предварительно введенным ингибитором метаболизма [44].
Примидон в умеренной степени оказывает побочные эффекты, основные из которых являются следующие: атаксия, головокружение, агрессивность, когнитивные расстройства, индукция ферментов, кожная гиперчувствительность, мегалобластная анемия.
Этосуксимид ((R,S)-3-этилметилпирролидин-2,5-дион). Применяется с 1958 г. как препарат первой линии или как дополнительное средство при терапии генерализованных абсансных припадков. Механизм действия этосуксимида против абсансных припадков связан со снижением низкопороговых Ca2+ токов Т-типа в таламических нейронах [165; 283], хотя действие на корковом уровне также важно [171]. Спонтанная пейсмейкерная волновая активность таламо кортикальных нейронов запускает низкопороговые Ca2+ токи Т-типа. Эти волновые токи считаются генераторами 3 Hz ритмов спайк-волн, отмеченных у пациентов с абсансной эпилепсией [80]. Вольтаж-зависимая блокада низкопороговых Ca2+ токов Т-типа была продемонстрирована клинически значимыми концентрациями этосуксимида в таламических нейронах, выделенных из крыс и морских свинок [109; 218; 283]. Этосуксимид не влияет на открытие мембранных кальциевых каналов Т-типа [109; 218]. Основываясь на этих данных, предполагается, что этосуксимид воздействует на низкопороговые Ca2+ токи Т-типа в таламокортикальных нейронах, предотвращая синхронизированное возбуждение, связанное с разрядом кальциевых спайк-волн [283]. Точно такое же действие на кальциевые каналы Т-типа в сенсорных нейронах было предложено в качестве основного механизма, ответственного за действия этосуксимида в моделях нейропатической боли [111].
Участие нейрохимических механизмов в эпилептогенезе и реализации противосудорожного действия противоэпилептических препаратов
Нормальная нейрональная активность достигается посредством баланса сложных механизмов на клеточном уровне. Потенциал покоя мембраны клетки нейрона поддерживается калиево-натриевым насосом. Этот механизм накачивает натрий и хлорид до высоких концентраций внутрь клетки. В момент достаточного стимула, реализуется потенциал действия, и клетка деполяризуется. Нормальная функциональная активность мозга является результатом баланса между торможением и возбуждением. Наиболее распространенным возбуждающим нейротрансмиттером является глутамат, а ингибирующим – -аминомасляная кислота (ГАМК) [123]. Во время эпилептического приступа, недостаточность ингибирующих ГАМК-ергических механизмов может привести к тому, что судороги станут самоподдерживающимися и фармакорезистентными [189]. Например, может развиваться резистентность к бензодиазепину после 10–45 минут эпилептического статуса, что может быть связано с изменениями синаптической проводимости и, как следствие, уменьшение количества ГАМКА-рецепторов [189]. Стимулирующие ГАМКА препараты, такие как бензодиазепины, барбитураты, и некоторые анестетики, эффективны для устранения судорог, однако их отмена может провоцировать обратный эффект, поскольку баланс торможения/возбуждения склоняется в сторону возбуждения. Судорожная активность, в независимости от того протекает она с конвульсиями или нет, вызывает интенсификацию метаболизма, которая требуют увеличение мозгового кровотока. Эта нагрузка увеличивается уже в течение первых секунд припадка [124]. В течение первых нескольких минут припадка, нормальная нейрональная активность нарушается из-за очень высоких энергетических потребностей нейронов.
Когда повышенный спрос на метаболизм в клетке не обеспечивается, происходит повреждение нейрона и как следствие его гибель [143; 183; 229]. Неудовлетворённый метаболический спрос нейронов не является единственным фактором, ответственным за гибель клеток. Массовая деполяризация нейронов во время судорог приводит к чрезмерному высвобождению глутамата, который активирует постсинаптические рецепторы NMDA, вызывая приток кальция в клетку [106; 119]. Поддержание гомеостаза нейронов требует большое количество энергии, но нейроны обычно не используют накопленную энергию и особенно восприимчивы к энергетическому стрессу [70; 229]. Таким образом, во время эпилептического припадка происходит нарушение клеточного гомеостаза и высокие концентрации внутриклеточного кальция входят в митохондрии, которые затем теряют свой мембранный потенциал. Происходит нарушение митохондриального дыхания, что приводит к некрозу нейрональных клеток [106; 119].
В настоящее время определены три основных класса молекулярных мишеней, имеющих отношение к ограничению эпилептической активности. Это вольтаж-зависимые натриевые и кальциевые каналы, рецепторы к -аминомасляной кислоте (ГАМКA), ионотропные глутаматные рецепторы. Клинически эффективные ПЭП могут оказывать воздействие как на одну, так и на несколько мишеней. ПЭП могут уменьшать возбуждение или увеличивать торможение. Большинство ПЭП оказывают ограничивающее возбуждение действие путем влияния на ионные каналы (рисунок 1-1; 1-2).
Через вольтаж-зависимые натриевые каналы осуществляется трансмембранный ток Na+ в клетку, что деполяризует мембрану и приводит к формированию потенциала действия. ПЭП, способные влиять на натриевые каналы, блокируют их, ограничивая тем самым деполяризацию. В норме натриевый канал, в зависимости от мембранного потенциала, может находиться в трех состояниях: закрытый, открытый (активированный) и инактивированный. Ток, проходящий через открытые каналы, обладает быстрой кинетикой и достигает своего пика менее чем за одну миллисекунду и снижается к исходному уровню в течение нескольких миллисекунд. Различные мутации натриевых каналов приводят к нарушению их нормальной работы, что связывают с наследственной эпилепсией. Одним из примеров является медленно инактивируемый или не инактивируемый Na+ ток или INaP [75]. Кальциевые каналы, как и другие вольтаж-зависимые ионные каналы, представляют собой макромолекулярные белки, состоящие из нескольких субъединиц, образующих кальций проницаемые поры, активируемые деполяризацией. Существует два основных типа кальциевых каналов. Активируемые высоким напряжением (HVA) и медленным напряжением или кальциевые каналы Т типа (LVA). HVA каналы в свою очередь имеют подтипы: L, R, P, Q и N) [261]. ПЭП действуют путем взаимодействия с различными типами и субъединицами кальциевых каналом, тем самым ограничивая ток Ca2+.
Существуют альтернативные мишени, через которые некоторые ПЭП могут оказывать свое противосудорожное действие. Так, габапентин действует на управляемые циклическими нуклеотидами гиперполяризационно-активируемые каналы (HCN), которые в мозге отвечают за так называемый Ih-ток. Ih-ток играет важную роль в стабилизации мембранного потенциала нейронов в сторону потенциала покоя [161; 222]. Другой важный механизм связан с действием ПЭП на калиевые каналы. Активация калиевых каналов приводит к гиперполяризации мембраны. Так, ретигабин усиливает активацию KCNQ2/KCNQ3. Также существуют ПЭП, действие которых не связано ни с одним из традиционных механизмов. Например, леветирацетам действует через опосредованное связывание с везикулярным синаптическим протеином SV2A, который участвует в кальциевом гомеостазе.
Согласно современным представлениям, эпилепсия может быть вызвана либо аномальной ионной проводимостью, либо дисбалансом между возбуждающими и тормозными системами. Установлено, что нейрональное возбуждение (возбуждающие синапсы) в ЦНС опосредовано ионотропными глутаматными рецепторами (AMPA, каинатные, NMDA). Подавление глутаматергической возбуждающей активности представляется логичным способом уменьшения нервного возбуждения, однако существует всего несколько ПЭП (фелбамат и топирамат), которые способны селективно ингибировать глутаматные рецепторы (рисунок 1-1). Нейрональное торможение (тормозные синапсы) в ЦНС достигается за счет пресинаптического высвобождения нейротрансмиттера ГАМК, который связывается с ионотропным ГАМКA и метаботропным ГАМКB-рецепторами, которые опосредуют быстрое и медленное торможение в головном мозге. ПЭП, способные увеличивать торможение действуют путем модулирования ГАМК-рецепторов или влияют на трансаминирование ГАМК путем ингибирования ГАМК-трансаминазы (рисунок 1-2). Поддержание баланса между тормозными и возбуждающими механизмами во время нормальной активности нейронов препятствует развитию синхронизированных эпилептоформных разрядов. Серотониновые рецепторы нейронов в головном мозге представлены несколькими различными типами. Например, 5-НТ1А, 5-НТ1В, 5-НТ2А, 5-НТ2С и 5 НТ7-рецепторы присутствуют в корковых и/или гиппокампальных глутаматергических или ГАМК-ергических нейронах или терминалях.
Исследование противосудорожной активности производных оксимов 4-бензоилпиридина в тесте максимального электрошока (МЭШ)
Изучение влияния соединения ГИЖ-298 на судороги, вызванные МЭШ у мышей, показало, что ГИЖ-298 достоверно устраняет тонико-экстензорные судороги и увеличивает показатель выживаемости. Соединение ГИЖ-298 в дозе 5 мг/кг устраняет судороги и увеличивает выживаемость на 28,5 %, в дозах 10 и 20 мг/кг на 37,5 %. Соединение ГИЖ-298 достоверно увеличивает показатель выживаемости в дозе 40 мг/кг – на 50 %, в дозах 60 и 80 на 62,5 и 87,5 %, в дозах 100 и 150 мг/кг – на 100 % (Р 0,05). В дозах 0,5 и 1 мг/кг ГИЖ-298 не оказывает противосудорожного действия (таблица 3-2).
При пероральном введении соединение ГИЖ-298 сохраняет свой противосудорожный эффект: в дозе 40 мг/кг эффект составляет 43 %, а в дозе 60 мг/кг – 50 %.
Установлено, что соединение ГИЖ-162 оказывает противосудорожное действие в тесте МЭШ у мышей, уменьшая тонико-экстензорные судороги и увеличивая показатель выживаемости. Соединение ГИЖ-162 в дозах 20 и 40 мг/кг достоверно увеличивает показатель выживаемости на 62,5 и 87,5 % и в дозе 80 мг/кг – на 100 % (Р 0,05). В дозах 5 и 10 мг/кг ГИЖ-162 не оказывает противосудорожного действия (таблица 3-2).
Изучение влияния соединения ГИЖ-323 на судороги, вызванные МЭШ у мышей, показало, что ГИЖ-323 достоверно уменьшает тонико-экстензорные судороги и увеличивает показатель выживаемости. Соединение ГИЖ-323 в дозе 60 мг/кг достоверно увеличивает показатель выживаемости на 66,7 % (Р 0,05). В дозах 5, 20 и 40 мг/кг ГИЖ-323 не оказывает противосудорожного действия (таблица 3-2).
Препарат сравнения вальпроевая кислота (ВК) устраняет тонико-экстензорные судороги в диапазоне доз от 200 до 240 мг/кг. В дозе 240 мг/кг наблюдается увеличение выживаемости мышей до 80 % (таблица 3-2).
Действие топирамата в устранении судорожных проявлении наблюдается в диапазоне доз от 60 до 100 мг/кг. В дозах 80 и 100 мг/кг топирамат увеличивает показатель выживаемости мышей до 62,5 % (таблица 3-2).
Таким образом, производные оксимов 4-бензоилпиридина соединения показали высокую противосудорожную активность в широком диапазоне доз. Среди них наибольшей активностью обладают соединения ГИЖ-298 и ГИЖ-162, которые устраняют судороги и увеличивают показатель выживаемости до 100 %. Действие препаратов сравнения: вальпроевой кислоты (в более высоких применяемых дозах) и топирамата (в сопоставимых дозах) в тесте МЭШ менее выражено по сравнению с оригинальными изучаемыми соединениями из класса 4-бензоилпиридина.
Результаты, описанные в данном разделе, опубликованы в статье -Жмуренко, Л.А. Синтез и противосудорожная активность производных оксимов 3- и 4-бензоилпиридинов [Текст] / Л.А. Жмуренко, Т.А. Воронина, С.А. Литвинова, Л.Н. Неробкова, И.О. Гайдуков, Г.В. Мокров, Т.А. Гудашева // Химико-фармацевтический журнал. – 2018. – 52(1). – С. 19-28 [11].
Изучение влияния соединения ГИЖ-298 на связывание с NMDA-, mGluII- и 5НТ2А-рецепторами в опытах ex-vivo и in-vitro
Исследования выполнены в лаборатории радиоизотопных методов исследования ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова» (зав. лаб. – д.м.н., профессор Г.И. Ковалев).
Исследование проводили с помощью радиолигандного анализа ex-vivo, используя метод насыщения, оценивая величины Bmax и Kd, и метод вытеснения – величина IC50. Было показано, что величины констант диссоциации (Кd) оставались неизменными между исследуемыми группами.
Воздействие МЭШ увеличивало плотность NMDA-рецепторов в гиппокампе крыс на 26 % относительно контрольной группы (p 0,05), ГИЖ-298 в дозе 60 мг/кг в условиях МЭШ не понижал данный показатель до исходного уровня, а также не влиял на количество NDMA-рецепторов в гиппокампе крыс без воздействия МЭШ (таблица 3-20, 3-21; рисунок 3-21).
В условиях МЭШ плотность метаботропных глутаматных рецепторов коры снижалась на 25 %, а вещество ГИЖ-298 не возвращало данный показатель до уровня значений контрольной группы, при этом также не изменяло плотность mGluII-рецепторов в коре у животных без патологии (таблица 3-20, 3-21; рисунок 3-22).
При изучении 5-HT2А-рецепторов стриатума крыс было показано, что их плотность в выбранной структуре не изменяется под воздействием МЭШ, а также при введении ГИЖ-298 в условиях нормы и созданной патологии (таблица 3-20, 3-21).
В опытах in vitro изучено влияние соединения ГИЖ-298 на связывание меченых лигандов с NMDA-, 5-НТ2А-, mGluII-рецепторами. По данным кривых вытеснения рассчитаны величины IC50.
Соединение ГИЖ-298 не показало эффекта конкуренции с лигандами у изученных рецепторов за рецепторные места связывания, величины IC50 оказались 100 мкмоль/л (таблица 3-22).
Полученных результаты позволяют сделать заключение о том, что в условиях МЭШ увеличивается плотность (Bmax) NMDA-рецепторов в гиппокампе и уменьшается количество mGluII-рецепторов в коре мозга, плотность 5-НТ2А-рецепторов в стриатуме не изменяется. При предварительном введении ГИЖ-298 на фоне МЭШ, плотность NMDA- и mGluII-рецепторов не возвращаются до уровня контроля, а количество мест связывания для 5-НТ2А-рецепторов остается на исходном контрольном уровне.
В условиях нормы введение ГИЖ-298 не влияет на плотность NMDA-, mGluII-, 5-НТ2А-рецепторов мозга.
Радиолигандный анализ in vitro показал отсутствие прямого воздействия соединения ГИЖ-298 на NMDA-, mGluII-, 5-НТ2А-рецепторы мозга.
Полученные в результате проведенных экспериментов данные позволили выделить среди производных 3 и 4-бензоилпиридина высокоэффективное соединение с противосудорожной активностью – соединение ГИЖ-298, которое обладает также низкой токсичностью, высокой терапевтической широтой и имеет ряд преимуществ перед известными ПЭП.
В широком диапазоне доз ГИЖ-298 полностью устраняет клонико-тонические припадки на модели первично-генерализованных судорог (МЭШ), превосходя по своей активности вальпроевую кислоту и топирамат. В этом исследовании соединение ГИЖ-298 проявило себя в несколько раз активнее вальпроата: ЭД50 = 16,4 мг/кг в сравнении 205,4 мг/кг у вальпроевой кислоты и имеет более высокие показатели терапевтической широты как по ЛД50, так и по ТД50. Эффективность ГИЖ-298 в отношении генерализованных клонико-тонических судорог также доказана на модели судорог на крысах Крушинского-Молодкиной, предрасположенных к аудиогенным припадкам. ГИЖ-298 в этой модели проявляет высокую активность, не уступая вальпроевой кислоте. В тесте антагонизма с коразолом соединение ГИЖ-298 увеличивает латентный период первого приступа.
Изучение влияния соединения ГИЖ-298 на вторично-генерализованные судороги на модели фокальной (очаговой) эпилепсии, индуцированной кобальтом у крыс, доказало его эффективность в отношении этой патологии.
Противосудорожный эффект отмечается как на 1, так и на 2 стадии развития ЭпА. При анализе изменений ЭЭГ на фоне введения ГИЖ-298 (60 мг/кг) существенно уменьшается количество и длительность ЭпА разрядов, с преимущественным влиянием на вторично-генерализованные очаги, в особенности в контрлатеральной коре.
Наиболее высокая активность ГИЖ-298 наблюдается на модели эпилептического статуса, вызванного гомоцистеина тиолактоном у кобальт-индуцированных крыс. Установлено, что ГИЖ-298 в дозе 60 мг/кг через 50 минут после введения многократно снижает число продолжительных генерализованных высокоамплитудных разрядов в ипси-, контрлатеральной коре (в 46 раз), гиппокампе и гипоталамусе (в 28 раз) и устраняет у 100 % животных вторично-генерализованные тонико-клонические судороги, возникающие в развернутой стадии эпилептического статуса. Вальпроевая кислота в дозе 100 мг/кг через 3 часа после введения значительно подавляет ЭпА во всех исследуемых структурах с максимальным значением в гипоталамусе (в 28 раз). При этом, вальпроевая кислота устраняет моторные проявления эпилептического статуса только у 71 % животных и защищая от гибели 86 % крыс.